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方法文章

整体封片 原位 腹足类软体动物杂交方法 Lymnaea stagnalis

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DOI：

10.3791/53968

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2016年3月15日

 ,  , 
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

本文内容

摘要

本实验方案的目的是为用户提供一套高通量去壳方法 Lymnaea stagnalis 用于整体封片的胚胎和幼虫制备 原位 杂交，以及杂交前后的处理。

摘要

整体封片 原位 杂交（WMISH）是一种可在“整体装片”组织样本或特定发育阶段（如胚胎或幼虫）中实现核酸分子（通常为mRNA）空间定位的技术。WMISH具有极强的实用性，因其可显著促进对复杂后生动物基因组的功能表征——这一任务正随着新一代测序数据的激增而日益成为研究瓶颈。尽管该技术在概念上较为简单，但在新型模式系统中，往往需要耗费大量时间来优化WMISH实验中固有的各项参数；由于不同组织类型和发育阶段在细胞与生化特性上存在细微差异，单一的WMISH方法难以适用于所有情况。我们已为重新兴起的腹足类模式生物建立了一套WMISH方法 Lymnaea stagnalis 可对多种基因及所有发育阶段均产生稳定且清晰的WMISH信号的方法，包括将未知实际年龄的幼虫归入相应的个体发育时间窗，以及高效地将胚胎和幼虫从其卵囊中取出, 针对每个个体发育阶段采用适当的蛋白酶K处理，以及杂交、杂交后和免疫检测步骤。这些方法为优化特定RNA转录本的检测信号提供了基础，可通过探针特异性的调整（主要是探针浓度和杂交温度）进一步优化结果。

引言

软体动物是一类受到众多科学领域广泛关注的动物。尽管其形态多样1、物种丰富（物种数量仅次于节肢动物2），并在商业3、医学4及多种科学问题5-8中具有重要意义，但目前仍仅有少数软体动物物种可同时被视为成熟的科学研究模型且易于在实验室环境中培养。其中，Lymnaea stagnalis 被神经生物学9、生态毒理学10以及近年来的进化生物学11,12等多个学科广泛使用，主要得益于其广泛的地理分布和极高的饲养便利性。尽管该物种作为“模式”生物广受欢迎，并且发育生物学家已对其有长期研究历史13-19，但目前提供给 L. stagnalis 科研群体的分子工具在种类和功能上仍远落后于更传统的动物模型（如 Drosophila、小鼠、海胆和线虫）。

我们致力于开发 Lymnaea 作为分子模型，源于对指导贝壳形成的分子机制的兴趣。这促使我们优化了一套技术，以实现对基因表达在贝壳形成过程中高效、一致且灵敏的可视化观察 Lymnaea的发育。整体装片 原位 杂交（WMISH）被广泛应用于多种模式生物，已有40多年的历史 20ISH 可以不同形式用于在染色体、rRNA、mRNA 和 micro-RNA 上进行特定位点的空间定位。

在优化用于L. stagnalis的全胚胎原位杂交（WMISH）方法之前，我们需要解决的一个挑战是如何轻柔且高效地从卵囊中提取处于不同发育阶段的胚胎和幼体。为了获得足够材料用于特定的in situ实验，这种提取（即“去囊”）必须高效完成，同时保持胚胎形态和细胞结构的完整性。尽管其他模式生物也经历囊内发育，但在我们实践中，已报道的针对这些物种的去囊方法均无法成功应用于L. stagnalis。

因此，本方法的总体目标是：以高通量的方式从卵囊中提取L. stagnalis胚胎和幼体，进行优化全胚胎原位杂交（WMISH）信号的预杂交处理，制备具有满意WMISH信号的胚胎和幼体以用于成像。

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方案

注意：以下步骤概述了我们进行实验的方法 原位 胚胎和幼虫阶段的实验 L. stagnalis 若某步骤涉及使用危险化学品，则会标有“CAUTION”字样，应采取所有适当的安全操作规程。文中提供了危险化学品的代表性MSDS说明书链接。 补充文件 1所有试剂的配制方法均在文中提供 补充文件 2.

1. 脱囊装置的组装

  1. 为此，将一个 20 ml 的一次性注射器通过一个适当长度的 P1,000 吸头连接至硅胶管（内径为 1 mm，外径为 3 mm），如图 2A所示。
  2. 将标准显微镜载玻片用胶带固定在倒置的大培养皿上。将硅胶管紧邻显微镜载玻片用胶带固定，如图 2C 和 2D所示。
  3. 将一根拉制的玻璃针置于显微镜载玻片上，并轻轻插入硅胶管中，直至针尖伸出约等于管内径 20% 的距离（见图 2C 和 2D）。针头定位后，用胶带将其固定在培养皿上。
  4. 使硅胶管的自由端置于另一个培养皿中，用于收集去囊材料。

2. 样本采集、固定与去囊

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行 。

  1. 从水族箱壁上仔细采集卵带。操作时，使用一块扁平的柔性塑料片作为刮铲，将卵带从基质上刮下，并用塑料茶漏网捞取水中漂浮的卵带。在显微镜下根据所提供的指南对样本进行分期和分类。 图1.
  2. 将卵串置于纸巾上，使用超细镊子沿卵团做纵向切口。用超细镊子将卵囊从卵串中滚出，并在纸巾上轻轻推动卵囊以去除尽可能多的胶状物质。
  3. 使用轻巧的镊子将卵囊转移至含有5 ml自来水的培养皿中。继续将所需发育阶段的去胶卵囊收集到该培养皿中。为计划进行的全 mount 原位杂交（WMISH）实验收集足够数量的所有发育阶段卵囊，然后进入下一步操作。
  4. 处理更晚期的幼虫（首次卵裂后5天及以上）时，固定前需先进行麻醉。
    注意：这将防止肌肉收缩，从而避免对结果的解读产生干扰。 原位 染色模式非常难以辨认。
    1. 将幼虫（仍处于其囊膜中时）放入2% w/v的MgCl溶液中使其松弛2•6H2O 培养 30 分钟后再进行固定。
    2. 30分钟后，将数个仍处于卵囊中的幼虫浸入固定液中，于显微镜下观察其反应，以评估放松程度。未完全放松的幼虫会缩入壳内，而完全放松的幼虫则无反应。待幼虫完全放松后，进行下一步操作。
  5. 使用宽口塑料移液管将卵囊转移至可密封的离心管中，管的体积应为卵囊体积的10倍例如，1 ml 沉降的胶囊需要使用 10+ ml 的离心管。
  6. 吸尽试管中的液体，加入固定液，其体积为沉降后卵囊体积的10倍。在室温下轻轻旋转混匀卵囊。 每个发育阶段的适当时间（参见 图1).
  7. 停止旋转，使胶囊沉降，并将固定液吸入适当的废液容器中。
  8. 用含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBTw）替换固定液，室温下旋转洗涤5分钟。吸除PBTw，重复此步骤两次。
  9. 使用该装置（详见第1节）从囊中取出胚胎和幼虫 图2用20 ml注射器吸取胶囊，连接导管，然后将胶囊通过导管并经玻璃针推出，收集到收集皿中。
    注意：通常情况下，大部分（>90%以上的胶囊只需通过仪器一次即可。在许多情况下，胶囊膜虽已受损，但胚胎和幼体仍保留在破裂的胶囊内。可直接将此材料重新吸入注射器中，再次排出进行重复处理。
  10. 使用移液器将去壳的胚胎和幼虫收集到1.5 ml离心管中（0–3日龄幼虫使用P20，较大龄幼虫使用剪去枪头末端的P200）。
    注意：此步骤可暂停（最长可达数月）。若需暂停，应将去荚材料收集至1.5 ml离心管中保存（继续执行下一步）。否则请立即进入方案3。
  11. 让胚胎和幼虫沉降至管底，吸去上清液。加入含33%乙醇（EtOH）的PBTw溶液，静置5–10分钟。随后依次更换为含66% EtOH的PBTw溶液和100% EtOH，重复相同步骤。在100% EtOH中于室温下洗涤幼虫两次。将样品置于100% EtOH中，于-20 °C保存。
  12. 当准备继续操作时，通过移除100% EtOH并加入含66% EtOH的PBTw重悬样品，静置5–10分钟。随后用含33% EtOH的PBTw重复处理，静置5–10分钟。最后用PBTw洗涤3次，每次5分钟，以确保完全去除EtOH。

3. 蛋白酶K、TEA及后固定

 注意：我们发现，使用带网状底面的小型篮子进行以下步骤，是快速更换时间敏感性溶液最高效且温和的方法。虽然此类篮子可自行制作，但我们使用的是与Intavis InSituPro-Vsi液体处理机器人（www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc）兼容的中号篮子。使用这种篮子可快速、方便地在12孔组织培养板（TCD）的不同孔之间转移，以更换溶液，或者也可用移液器从孔中吸出溶液。此外，也可不使用这些篮子，直接通过吸除幼虫上方的上清液来完成所有溶液更换操作。在此情况下，轻轻晃动培养板可使所有胚胎和幼虫集中于板孔中央，从而便于从孔边缘处移走上清液。以下操作均假设使用者采用篮子进行溶液更换。

  1. 使用移液器将胚胎和幼虫转移至置于含 2 ml PBTw 的 12 孔 TCD 中的篮子内。
    注意：可添加的胚胎和/或幼虫数量取决于所研究的发育阶段，但一般原则是保持至少 25% 的底部面积无胚胎/幼虫（即，不要使篮子过于拥挤）。
  2. 在相邻孔中加入 2 ml 适当浓度的蛋白酶 K 溶液（见图 1），另准备两个孔，每孔加入 2 ml 0.2% 甘氨酸。将每个篮子移入含有适当浓度蛋白酶 K 的孔中，并立即开始计时。
  3. 10 分钟后，将每个篮子移入含 0.2% 甘氨酸的孔中，孵育 5 分钟。然后将每个篮子移入第二个含 0.2% 甘氨酸的孔中，再孵育 5 分钟。用 3 ml PBTw 更换三次，每次 5 分钟，以洗去甘氨酸。
  4. 吸去 PBTw 溶液，用新鲜配制的三乙醇胺（TEA）溶液处理样品一次，孵育 5 分钟 注意！ 不要振荡。更换为 3 ml 新鲜配制的 TEA 溶液，再孵育 5 分钟。不要振荡。吸去样品中大部分 TEA 溶液。加入新鲜配制的含乙酸酐的三乙醇胺（TEAAA）溶液，孵育 5 分钟。注意！ 不要振荡。
  5. 可选 —— 在上述步骤孵育期间，另配制一批新鲜 TEAAA 溶液，并重复上述步骤。
    注意：第二次 TEAAA 处理为可选步骤，但可能有助于彻底消除易产生背景信号的探针的所有背景。
  6. 通过从孔中吸出的方式去除 TEAAA 溶液，并替换为 3 ml PBTw。不要振荡。去除 PBTw 后，加入 3 ml 含 3.7% 甲醛的 PBTw 溶液。在 30 min 孵育期间偶尔轻轻摇动。
  7. 通过从孔中吸出的方式去除固定液，并替换为 3 ml PBTw。将样品转移至 1.5 ml 离心管中。用杂交缓冲液替换 PBTw，并在室温下孵育 5 分钟 — 注意。
  8. 将离心管放入室温的金属加热块中，并将温度设定至所需的杂交温度。
    注意：杂交温度因探针而异，需通过实验优化；但我们发现 55 °C 是一个适合初步试验的良好温度。待加热块达到杂交温度后，使样品预杂交约 15 分钟（即，制备核糖探针所需的时间，更长时间并无必要）。配制足够体积（通常为 100 µl）的稀释核糖探针。我们通常以 100 和 500 ng/ml 作为初始浓度范围进行试验。核糖探针的制备方法参照 12。
  9. 从样品中去除杂交缓冲液，并将含有探针的杂交缓冲液加入样品中。覆盖 100 µl（或足以在杂交缓冲液上方形成一相的适量）矿物油。
    注意：矿物油可防止在长时间杂交过程中形成大量冷凝水。大量冷凝会显著改变杂交溶液的化学性质及探针的浓度。
  10. 将样品加热至 75 °C 持续 10 分钟，以使探针和靶 RNA 变性，然后将温度降至所需的杂交温度。让杂交反应至少进行 12 小时（过夜）或更长时间（24–48 小时）。
  11. 在杂交过程中，从加热块中取出一根离心管，用拇指和食指快速旋转，使幼虫悬浮而不扰动油相，然后将其放回加热块中。每隔 6–12 小时重复一次此操作。

4. 热洗涤与免疫检测

注意：虽然我们使用液体处理机器人执行以下步骤，但这些步骤也可以手动轻松完成。在此情况下，应将胚胎和幼虫保留在其杂交所用的1.5 ml离心管中。所有后续溶液更换均使用P1,000移液器进行吸除和添加。若手动操作，以下每个步骤均应使用1 ml的相应溶液。

  1. 将适量体积的4x、2x和1x洗涤液（每个样品各3 ml）加热至杂交温度。
  2. 所有样品均在4x洗涤缓冲液中于杂交温度下洗涤三次，每次15分钟；随后在2x洗涤缓冲液中于相同温度下洗涤三次，每次15分钟；最后在1x洗涤缓冲液中于相同温度下洗涤三次，每次15分钟。
  3. 所有样品在杂交温度下用1x SSC + 0.1% Tween（氯化钠-柠檬酸钠缓冲液加0.1%吐温）洗涤一次。随后让样品冷却至室温。
  4. 所有样品用1x SSC + 0.1% Tween洗涤两次，每次15分钟。将该1x SSC溶液替换为马来酸缓冲液（MAB），静置10分钟。重复一次MAB洗涤。再将MAB替换为封闭液，于室温孵育1.5小时。
  5. 将封闭液更换为抗体溶液（以封闭液按1:10,000比例稀释抗体），于室温轻柔振荡孵育12小时（过夜）。

5. 显色与封片

  1. 吸去抗体溶液，用 PBTw 每次 10 分钟，共洗涤 15 次。弃去 PBTw，加入 1x 碱性磷酸酶缓冲液（AP），孵育 10 分钟。
  2. 在上述孵育过程中，配制 AP 染色液（见补充文件 2）——注意安全。将样品转移至 TCD 孔中，弃去 1x AP 溶液，加入 AP 染色液。记录当前时间，以便准确记录显色反应持续的时间。持续观察染色模式的发育情况，直至信号与背景的比值达到最佳。
  3. 为终止显色反应，移除 1x AP 染色液（倒入适当的废液容器中），加入 2 ml PBTw，并记录当前时间。再用 PBTw 洗涤两次，每次 5 分钟。利用其中一次洗涤步骤将样品转移至 1.5 ml 离心管中。
  4. 吸去 PBTw，加入 1 ml 含 3.7% 甲醛的 PBTw 溶液，在室温下振荡或旋转固定至少 30 分钟（也可过夜进行）。
  5. 用 PBT 洗涤三次以去除固定液（将废弃的固定液倒入适当的废液容器中）。在去离子水中于 50 °C 下洗涤样品三次。
    注意：这些洗涤步骤可消除在透明化和观察过程中可能出现的盐类沉淀。
  6. 确定样品应使用苯甲酸苄酯:苯甲醇（BB:BA，又称 Murray 透明液）还是甘油进行封片。
    注意：由于中国台湾 L. stagnalis 胚胎具有一定不透明性，我们更倾向于使用透明效果更强的 BB:BA。使用 BB:BA 封片的样品需先经乙醇梯度脱水处理；而使用 60% 甘油封片的样品则可直接进行封片。
  7. 用移液器将样品转移至封片液（BB:BA 或 60% 甘油）中。
    注意：若使用 BB:BA 封片，必须在玻璃孔板中操作（BB:BA 会溶解聚碳酸酯塑料）。
  8. 让样品透明化 5–10 分钟，然后使用适当数量的叠加盖玻片作为垫片，将样品封固在载玻片上（对于 <1 dpfc 的样品使用 1 片盖玻片，对于 >1 dpfc 的样品使用 2 片盖玻片）。
    注意：现在可使用配备微分干涉差（DIC）光学系统的复合显微镜对整体封片样品进行成像。

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结果

代表性WMISH染色模式如图所示 图3 采用上述技术生成，反映了参与从壳体形成到多种分子过程相关基因的各种空间表达模式新基因1、2、3 和 4），到细胞间信号传递（Dpp) 到转录调控（Brachyury）在多个发育阶段中均有表达。尽管我们尚未对这些基因的表达水平进行定量分析，但我们预计它们的表达量也会存在显著差异，这表明我们的方法可适用于发育各阶段以不同水平表达的多种基因产物。本文所展示的基因中，仅有其中一个（Dpp) 之前已有描述 L. stagnalis 21,22. 本文展示的结果与这些先前的报道基本一致，但具有显著更高的空间分辨率。基因表达的空间分布模式 Brachyury 已在鲍鱼中被描述 23 和帽贝 24 并且在这两种情况下，在套细胞中也有检测到，正如我们所发现的 L. stagnalis (图 3F...

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讨论

此处描述的方法可有效可视化所有发育阶段中表达水平可能不同的RNA转录本 Lymnaea stagnalis 为将胚胎和幼虫从其卵囊中分离，我们尝试了多种已见于其他具卵囊发育模式生物的化学、渗透压休克及物理处理方法。然而，据我们经验，本文所述方法是唯一一种可高效去除坚韧卵囊膜且不损伤胚胎和幼虫的高通量技术。去囊处理后，样品可选择保存，或经阶段特异性蛋白酶K处理后再与核糖探针进行杂交。针对每种探针/靶标，可能还需进一步经验性优化（通常集中于探针浓度和杂交温度）。这些参数（连同固定方案和蛋白酶K处理）通常是影响任何原位杂交实验成败的最关键因素。 原位 实验（假设固定材料和RNA探针的质量均达到较高标准）。

适当的蛋白酶K处理对最终实验结果的重要性 原位 实验至关重要 L. stagnalis这体现在不同发育阶段所需的蛋白酶K浓度范围较广（从0 µg/ml到500 µg/ml）。因此，能够将特定的卵串归属于相应的个体发育时期至关重要。为此，我们提供的指南如下 图1 可用于对未知年龄的发...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了德国研究基金会（DFG）项目 #JA2108/2-1 对 DJJ 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
轻质镊子Ehlert & Partner#4181119
硅胶管Glasgerätebau OCHS GmbH760070
玻璃毛细管Hilgenberg1403547
12孔组织培养皿Carl RothCE55.1
37% 甲醛Carl RothP733.1注意——可能致癌。吸入、皮肤接触或吞咽后有毒。有毒：经吸入、皮肤接触或吞咽可能导致非常严重的不可逆损害。
乙二胺四乙酸Carl RothCN06.3注意——引起眼睛刺激。可能引起呼吸道和皮肤刺激。避免吸入粉尘。避免接触眼睛、皮肤和衣物。仅在通风良好的条件下使用。
氯化镁Carl Roth2189.1
吐温-20Carl Roth9127.1注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。
氯化钠Carl Roth3957.1
Ficoll 400型Carl RothCN90.1
聚乙烯吡咯烷酮 K30（分子量 40）Carl Roth4607.1注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。
无核酸酶牛血清白蛋白Carl Roth8895.1
鲑鱼精子DNACarl Roth5434.2
肝素Carl Roth7692.1注意——不良反应包括出血、局部刺激。吸入、摄入或接触后可能发生过敏反应。对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性。可能引起过敏性致敏。妊娠期间使用已被报道会增加死胎风险。
蛋白酶KCarl Roth7528.1
甘氨酸Carl Roth3790.2
去离子甲酰胺Carl RothP040.1注意——对眼睛和皮肤有刺激性。吸入、皮肤接触或吞咽可能有害。可能对胎儿造成损害。具有吸湿性。
标准甲酰胺Carl Roth6749.3注意——对眼睛和皮肤有刺激性。吸入、皮肤接触或吞咽可能有害。可能对胎儿造成损害。具有吸湿性。
三乙醇胺Carl Roth6300.1注意——避免吸入蒸气或雾滴。避免接触眼睛。避免皮肤长时间或反复接触。操作后彻底清洗。
乙酸酐Carl Roth4483.1注意——引起严重的皮肤和眼睛灼伤。与水剧烈反应。吞咽有害。蒸气对眼睛和呼吸道有刺激性。
马来酸Carl RothK304.2注意——眼睛接触（刺激物）或摄入时非常危险。皮肤接触（刺激物）或吸入（肺刺激物）时有危险。皮肤接触（渗透剂）时轻微危险。对眼睛和皮肤具有腐蚀性。
苯甲酸苄酯SigmaB6630-250ML注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽有害。
苯甲醇Sigma10,800-6注意——吞咽有害。吸入有害。引起严重眼睛刺激。
甘油Carl Roth3783.1
封闭剂粉末Roche11096176001
抗DIG Fab片段碱性磷酸酶偶联物Roche11093274910
Tris-HClCarl Roth9090.3
二甲基甲酰胺中的4-硝基蓝四氮唑氯化物 Carl Roth4421.3注意——可能对胎儿造成损害。吸入和皮肤接触有害。对眼睛有刺激性。
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐Carl RothA155.3注意——摄入可能有害。不得接触皮肤、眼睛或衣物。可能为皮肤和眼睛刺激物。 
N-乙酰半胱氨酸Carl Roth4126.1
二硫苏糖醇Carl Roth6908.1注意——可能引起眼睛和皮肤刺激。可能引起呼吸道和消化道刺激。该物质的毒理学性质尚未完全研究。
TergitolSigmaNP40S注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。
十二烷基硫酸钠Carl RothCN30.3注意——吞咽有害。皮肤接触有毒。引起皮肤刺激。引起严重眼睛损伤。可能引起呼吸道刺激。
氯化钾Carl Roth6781.1
二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4•2H2O）Carl Roth4984.1
磷酸二氢钾（KH2PO4）Carl Roth3904.1
二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7•2H2O）Carl Roth3580.1注意——可能引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。该物质的毒理学性质尚未完全研究。
矿物油 Carl RothHP50.2
InSituPro-Vsi Intaviswww.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

参考文献

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