本实验方案的目的是为用户提供一套高通量去壳方法 Lymnaea stagnalis 用于整体封片的胚胎和幼虫制备 原位 杂交，以及杂交前后的处理。
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本文内容
摘要
摘要
整体封片 原位 杂交（WMISH）是一种可在“整体装片”组织样本或特定发育阶段（如胚胎或幼虫）中实现核酸分子（通常为mRNA）空间定位的技术。WMISH具有极强的实用性，因其可显著促进对复杂后生动物基因组的功能表征——这一任务正随着新一代测序数据的激增而日益成为研究瓶颈。尽管该技术在概念上较为简单，但在新型模式系统中，往往需要耗费大量时间来优化WMISH实验中固有的各项参数；由于不同组织类型和发育阶段在细胞与生化特性上存在细微差异，单一的WMISH方法难以适用于所有情况。我们已为重新兴起的腹足类模式生物建立了一套WMISH方法 Lymnaea stagnalis 可对多种基因及所有发育阶段均产生稳定且清晰的WMISH信号的方法，包括将未知实际年龄的幼虫归入相应的个体发育时间窗，以及高效地将胚胎和幼虫从其卵囊中取出, 针对每个个体发育阶段采用适当的蛋白酶K处理，以及杂交、杂交后和免疫检测步骤。这些方法为优化特定RNA转录本的检测信号提供了基础，可通过探针特异性的调整（主要是探针浓度和杂交温度）进一步优化结果。
引言
软体动物是一类受到众多科学领域广泛关注的动物。尽管其形态多样1、物种丰富（物种数量仅次于节肢动物2），并在商业3、医学4及多种科学问题5-8中具有重要意义，但目前仍仅有少数软体动物物种可同时被视为成熟的科学研究模型且易于在实验室环境中培养。其中，Lymnaea stagnalis 被神经生物学9、生态毒理学10以及近年来的进化生物学11,12等多个学科广泛使用，主要得益于其广泛的地理分布和极高的饲养便利性。尽管该物种作为“模式”生物广受欢迎，并且发育生物学家已对其有长期研究历史13-19，但目前提供给 L. stagnalis 科研群体的分子工具在种类和功能上仍远落后于更传统的动物模型（如 Drosophila、小鼠、海胆和线虫）。
我们致力于开发 Lymnaea 作为分子模型，源于对指导贝壳形成的分子机制的兴趣。这促使我们优化了一套技术，以实现对基因表达在贝壳形成过程中高效、一致且灵敏的可视化观察 Lymnaea的发育。整体装片 原位 杂交（WMISH）被广泛应用于多种模式生物，已有40多年的历史 20ISH 可以不同形式用于在染色体、rRNA、mRN....
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方案
注意：以下步骤概述了我们进行实验的方法 原位 胚胎和幼虫阶段的实验 L. stagnalis 若某步骤涉及使用危险化学品，则会标有“CAUTION”字样，应采取所有适当的安全操作规程。文中提供了危险化学品的代表性MSDS说明书链接。 补充文件 1所有试剂的配制方法均在文中提供 补充文件 2.
1. 脱囊装置的组装
- 为此，将一个 20 ml 的一次性注射器通过一个适当长度的 P1,000 吸头连接至硅胶管（内径为 1 mm，外径为 3 mm），如图 2A所示。
- 将标准显微镜载玻片用胶带固定在倒置的大培养皿上。将硅胶管紧邻显微镜载玻片用胶带固定，如图 2C 和 2D所示。
- 将一根拉制的玻璃针置于显微镜载玻片上，并轻轻插入硅胶管中，直至针尖伸出约等于管内径 20% 的距离（见图 2C 和 2D）。针头定位后，用胶带将其固定在培养皿上。
- 使硅胶管的自由端置于另一个培养皿中，用于收集去囊材料。
2. 样本采集、固定与去囊
注意：除非另有说明，所有步骤均....
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结果
代表性WMISH染色模式如图所示 图3 采用上述技术生成，反映了参与从壳体形成到多种分子过程相关基因的各种空间表达模式新基因1、2、3 和 4），到细胞间信号传递（Dpp) 到转录调控（Brachyury）在多个发育阶段中均有表达。尽管我们尚未对这些基因的表达水平进行定量分析，但我们预计它们的表达量也会存在显著差异，这表明我们的方法可适用于发育各阶段以不同水平表达的多种基因产物。本文所展示的基因中，仅有其中一个（Dpp) 之前已有描述 L. stagnalis 21,22. 本文展示的结果与这些先前的报道基本一致，但具有显著更高的空间分辨率。基因表达的空间分布模式 Brachyury 已在鲍鱼中被描述 23 和帽贝 24 并且在这两种情况下，在套细胞中也有检测到，正如我们所发现的 L. stagnalis (图 3F.......
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讨论
此处描述的方法可有效可视化所有发育阶段中表达水平可能不同的RNA转录本 Lymnaea stagnalis 为将胚胎和幼虫从其卵囊中分离，我们尝试了多种已见于其他具卵囊发育模式生物的化学、渗透压休克及物理处理方法。然而，据我们经验，本文所述方法是唯一一种可高效去除坚韧卵囊膜且不损伤胚胎和幼虫的高通量技术。去囊处理后，样品可选择保存，或经阶段特异性蛋白酶K处理后再与核糖探针进行杂交。针对每种探针/靶标，可能还需进一步经验性优化（通常集中于探针浓度和杂交温度）。这些参数（连同固定方案和蛋白酶K处理）通常是影响任何原位杂交实验成败的最关键因素。 原位 实验（假设固定材料和RNA探针的质量均达到较高标准）。
适当的蛋白酶K处理对最终实验结果的重要性 原位 实验至关重要 L. stagnalis这体现在不同发育阶段所需的蛋白酶K浓度范围较广（从0 µg/ml到500 µg/ml）。因此，能够将特定的卵串归属于相应的个体发育时期至关重要。为此，我们提供的指南如下 图1 可用于对未知年龄的发.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了德国研究基金会（DFG）项目 #JA2108/2-1 对 DJJ 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 轻质镊子 | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| 硅胶管 | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| 玻璃毛细管 | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12孔组织培养皿 | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% 甲醛 | Carl Roth | P733.1 | 注意——可能致癌。吸入、皮肤接触或吞咽后有毒。有毒：经吸入、皮肤接触或吞咽可能导致非常严重的不可逆损害。 |
| 乙二胺四乙酸 | Carl Roth | CN06.3 | 注意——引起眼睛刺激。可能引起呼吸道和皮肤刺激。避免吸入粉尘。避免接触眼睛、皮肤和衣物。仅在通风良好的条件下使用。 |
| 氯化镁 | Carl Roth | 2189.1 | |
| 吐温-20 | Carl Roth | 9127.1 | 注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。 |
| 氯化钠 | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll 400型 | Carl Roth | CN90.1 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 K30（分子量 40） | Carl Roth | 4607.1 | 注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。 |
| 无核酸酶牛血清白蛋白 | Carl Roth | 8895.1 | |
| 鲑鱼精子DNA | Carl Roth | 5434.2 | |
| 肝素 | Carl Roth | 7692.1 | 注意——不良反应包括出血、局部刺激。吸入、摄入或接触后可能发生过敏反应。对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性。可能引起过敏性致敏。妊娠期间使用已被报道会增加死胎风险。 |
| 蛋白酶K | Carl Roth | 7528.1 | |
| 甘氨酸 | Carl Roth | 3790.2 | |
| 去离子甲酰胺 | Carl Roth | P040.1 | 注意——对眼睛和皮肤有刺激性。吸入、皮肤接触或吞咽可能有害。可能对胎儿造成损害。具有吸湿性。 |
| 标准甲酰胺 | Carl Roth | 6749.3 | 注意——对眼睛和皮肤有刺激性。吸入、皮肤接触或吞咽可能有害。可能对胎儿造成损害。具有吸湿性。 |
| 三乙醇胺 | Carl Roth | 6300.1 | 注意——避免吸入蒸气或雾滴。避免接触眼睛。避免皮肤长时间或反复接触。操作后彻底清洗。 |
| 乙酸酐 | Carl Roth | 4483.1 | 注意——引起严重的皮肤和眼睛灼伤。与水剧烈反应。吞咽有害。蒸气对眼睛和呼吸道有刺激性。 |
| 马来酸 | Carl Roth | K304.2 | 注意——眼睛接触（刺激物）或摄入时非常危险。皮肤接触（刺激物）或吸入（肺刺激物）时有危险。皮肤接触（渗透剂）时轻微危险。对眼睛和皮肤具有腐蚀性。 |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma | B6630-250ML | 注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽有害。 |
| 苯甲醇 | Sigma | 10,800-6 | 注意——吞咽有害。吸入有害。引起严重眼睛刺激。 |
| 甘油 | Carl Roth | 3783.1 | |
| 封闭剂粉末 | Roche | 11096176001 | |
| 抗DIG Fab片段碱性磷酸酶偶联物 | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 二甲基甲酰胺中的4-硝基蓝四氮唑氯化物 | Carl Roth | 4421.3 | 注意——可能对胎儿造成损害。吸入和皮肤接触有害。对眼睛有刺激性。 |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐 | Carl Roth | A155.3 | 注意——摄入可能有害。不得接触皮肤、眼睛或衣物。可能为皮肤和眼睛刺激物。 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Carl Roth | 4126.1 | |
| 二硫苏糖醇 | Carl Roth | 6908.1 | 注意——可能引起眼睛和皮肤刺激。可能引起呼吸道和消化道刺激。该物质的毒理学性质尚未完全研究。 |
| Tergitol | Sigma | NP40S | 注意——吸入可能有害。可能引起呼吸道刺激。经皮肤吸收可能有害。可能引起皮肤刺激。可能引起眼睛刺激。吞咽可能有害。 |
| 十二烷基硫酸钠 | Carl Roth | CN30.3 | 注意——吞咽有害。皮肤接触有毒。引起皮肤刺激。引起严重眼睛损伤。可能引起呼吸道刺激。 |
| 氯化钾 | Carl Roth | 6781.1 | |
| 二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4•2H2O） | Carl Roth | 4984.1 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Carl Roth | 3904.1 | |
| 二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7•2H2O） | Carl Roth | 3580.1 | 注意——可能引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。该物质的毒理学性质尚未完全研究。 |
| 矿物油 | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
参考文献
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the Uni....
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重印与许可
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