双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

摘要

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。

摘要

不同类型脑细胞中基因表达的检测 例如， 神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞和小胶质细胞，由于缺乏针对免疫染色的特异性一抗或二抗，其检测可能受到限制。本文介绍一种在同一脑切片中通过双荧光检测三个不同基因表达的实验方案。 原位 使用两种基因特异性探针进行杂交，随后用高特异性抗体对第三种基因编码的蛋白质进行免疫染色。 天冬氨酰基环化酶 ASPA基因的突变可导致一种罕见的人类白质疾病——坎万病。该基因被认为在少突胶质细胞和小胶质细胞中表达，而在星形胶质细胞和神经元中不表达。然而，ASPA在脑内的精确表达模式尚未明确。本实验方案使我们能够确定ASPA在一部分成熟少突胶质细胞中表达，并可广泛适用于多种基因表达模式的研究。

引言

胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞，包括少突胶质细胞（CNS的髓鞘形成细胞）、少突胶质前体细胞（OPs，也称为"NG2细胞"）、星形胶质细胞和小胶质细胞。目前对胶质细胞的功能及其在神经系统疾病中的潜在作用日益受到关注¹。例如，异染性脑白质营养不良（Canavan病，CD）是一种遗传性神经退行性疾病，婴儿期早期发病，表现为海绵状脑白质营养不良和神经元进行性丧失，通常在10岁前死亡^2,3。已在CD患者中发现Aspartoacyclase（ASPA）基因的突变，导致ASPA酶活性显著降低⁴。ASPA是一种催化N-乙酰天冬氨酸（NAA）去乙酰化的酶，NAA是一种在脑内高度富集的分子，其反应产物为乙酸和天冬氨酸^5-7。许多CD患者由于缺乏ASPA活性而表现出NAA水平升高。一些研究推测，在发育过程中，由NAA产生的乙酸可能是脑内脂肪酸/脂质的主要来源，而CD可能源于NAA无法被正常分解，导致发育期间髓鞘合成减少所致^3,5,6。

ASPA 主要存在于肾脏、肝脏和脑白质中。鉴于 ASPA 在 CD 中的重要作用，多个实验室已对其在脑内的细胞表达进行了研究。通过检测脑内 ASPA 酶活性，早期研究发现，ASPA 活性在脑发育过程中的升高与髓鞘形成的时间进程相一致。 ^8-10在细胞水平上，酶活性检测以及 原位 原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）分析表明，ASPA 主要在脑内的少突胶质细胞中表达，而在神经元或星形胶质细胞中不表达^11-16一些研究发现，ASPA 可能在中枢神经系统的小胶质细胞中也有表达^12,14迄今为止，关于少突前体细胞（OPs）中ASPA表达的数据十分有限。根据最近一项研究，通过RNA测序分析了小鼠大脑皮层中不同细胞类型（包括神经元、星形胶质细胞、少突前体细胞、新生少突胶质细胞、髓鞘形成期少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和周细胞）的转录组¹⁷, ASPA 仅在少突胶质细胞中表达，特别是在形成髓鞘的少突胶质细胞中（http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html）。  尽管已有这些关于脑内ASPA表达模式的研究，但仍存在许多未解之处。

可采用多种技术来研究基因表达模式。免疫组织化学（IHC）是一种常用于检测基因功能产物（即， 组织切片中基因表达的蛋白质）检测。尽管该技术具有重要应用价值，但其应用范围和特异性受限于所需抗体的可获得性及其特异性。相比之下，原位杂交（ISH）技术的优势在于能够检测任意基因在mRNA水平的表达。然而，同时使用多个探针以将基因表达定位到特定细胞类型时，技术上可能具有较大挑战。本文中，我们描述了一种结合双重荧光RNA 原位 荧光免疫标记与蛋白质杂交。我们已采用这一系列技术来检测某种蛋白质的表达模式 Aspa 在小鼠脑组织中。该方法可利用共聚焦显微镜精确研究基因表达。

方案

伦理声明：
小鼠的饲养和操作遵循英国政府内政部法规以及伦敦大学学院伦理委员会指南，符合英国《1986年动物（科学程序）法》及其2012年修正条例的规定。

注意：所有溶液均应使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水配制，以破坏任何残留的RNase。DEPC处理方法：每升水中加入1 ml DEPC，剧烈振荡直至所有DEPC液滴完全消失，然后进行高压灭菌以降解DEPC。

1. RNA 探针合成

1. 注意：操作甲酰胺时，须穿戴个人防护装备（PPE），并在安全柜中进行。配制杂交缓冲液：含50%（v/v）去离子甲酰胺、200 mM NaCl、5 mM EDTA、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM NaH₂PO₄的DEPC处理去离子水₂PO₄，5 mM Na₂HPO₄，0.01 mg/ml 酵母 tRNA，1× Denhardt 溶液，以及 10% w/v 硫酸葡聚糖
2. 选择一个含有目的基因cDNA序列的DNA克隆，该克隆应位于带有RNA聚合酶启动子的质粒中。本示例使用pCMV-SPORT6克隆，IRAVp968C0654D（GenBank登录号BC024934），其含有T7和Sp6 RNA聚合酶启动子 Aspa (补充图1).
3. 制备线性化的质粒DNA作为模板。
   1. 培养DNA克隆，根据试剂盒说明书使用小量质粒纯化试剂盒提取质粒，并利用T7和Sp6通用引物进行测序。
   2. 用一种在cDNA有义链5'端进行切割的限制性内切酶消化1,020 µg质粒DNA。本示例中使用100单位 盐我用于消化 pCMV-SPORT6-Aspa 质粒。在37℃孵育1.5小时 ^oC.
   3. 在琼脂糖凝胶上电泳一小部分样品，以确认质粒已完全线性化。
4. 使用酚-氯仿纯化线性化的质粒。
   1. 加入1/10体积的3 M醋酸钠、1体积经10 mM Tris HCl（pH 8.0）平衡的苯酚和1体积氯仿/异戊醇（IAA）（24:1）。
   2. 在室温（20 - 25 °C，RT）下以 16,000 × g 离心 1 分钟，收集上层水相。
   3. 加入等体积的氯仿/IAA，16,000 × g 离心 1 分钟，提取上层水相。
   4. 重复步骤 1.4.3。
   5. 加入两倍体积的乙醇，置于-20℃环境中静置^o37°C孵育1小时或过夜。
   6. 在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 10 分钟。弃去上清液。
   7. 用70%冷乙醇洗涤沉淀，并将其重悬于TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5）中，浓度约为每2.5 µl含1 µg cDNA。
5. 合成两种探针，一种用洋地黄素（DIG）标记，另一种用异硫氰酸荧光素（FITC）标记。
   1. 选择合适的RNA聚合酶以制备反义探针（与目标mRNA互补）。本示例中，使用T7 RNA聚合酶制备 Aspa 探针
   2. 准备 体外 转录反应：加入1 µg线性化DNA、4.0 µl 5×转录缓冲液、6.0 µl 100 mM DTT、2.0 µl含有dNTPs的10×DIG或FITC RNA标记混合物、1 µl RNase抑制剂和20–40单位RNA聚合酶；用DEPC处理水补至终体积20 µl。
   3. 37℃孵育 ^o1.5 小时，4℃
6. 将1 µl转录反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，以验证反应是否成功。凝胶应显示出线性模板和一条明亮的探针条带。
7. 用杂交缓冲液定容至100 µl，并将10 µl分装后于-80 °C保存。

2. 灌注、固定与组织采集

1. 注意：操作多聚甲醛（PFA）时，无论是固体还是水溶液，均需佩戴个人防护装备（PPE）并在安全柜中进行。将4%（w/v）PFA溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，加热（55 °C）配制甲醛溶液。使用滤纸过滤甲醛溶液。
2. 将20%（w/v）蔗糖溶于蒸馏水中配制蔗糖溶液，并加入0.1%（v/v）DEPC溶液。室温下敞口放置过夜，然后进行高压灭菌。
3. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠实施终末麻醉。通过脚趾夹捏测试评估麻醉深度，无回缩反射表明已进入深麻醉状态。
4. 当小鼠达到深麻醉状态后，在肋骨下方做一切口，沿两侧切开肋骨，抬起以暴露心脏。
5. 将25号针头插入心脏左心室。在右心房处做一小切口。
6. 先用20 ml PBS灌注动物，随后用40 ml甲醛溶液灌注。对于P30及更年长的小鼠，灌注速率为12 ml/min；对于较年轻动物，则使用较低速率（7–10 ml/min）。
7. 解剖脑组织。
   1. 使用手术剪从耳后部位切断小鼠头部。沿中线从尾侧向头侧做正中切口，剥离颅骨上的皮肤。
   2. 从尾侧开始，使用虹膜剪沿中线及两眼之间剪开颅骨顶部。每次用镊子倾斜一侧骨板并将其折断，移除顶骨和额骨骨板。
   3. 用镊子从脑前部轻轻向上抬起脑组织，剪断视神经及其他颅神经，然后轻柔地将脑组织从颅腔中取出。
8. 将脑组织置于小鼠冠状脑切片模具中，使用剃毛刀片将脑切成约3段，每段厚约4 mm。
9. 将脑片转移至4% PFA溶液中，于4 °C孵育过夜。
10. 将脑片转移至经DEPC处理的20%蔗糖溶液中，于4 °C孵育过夜。
11. 将每一片脑组织放入干燥的冷冻模具中，周围包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，在干冰上速冻，随后于-80 °C保存。

3. 冷冻切片

1. 在冷冻切片机中将冷冻组织切成15 µm的切片，并将切片转移至显微镜载玻片上。如有需要，可用经DEPC处理的PBS润湿切片，并用细毛笔将其展平。
2. 将载玻片静置干燥约1小时，以确保组织牢固黏附于载玻片上。

4. 杂交

1. 配制 65 °C 洗涤缓冲液：150 mM NaCl、15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃（即 1× 盐溶液柠檬酸钠）、50% (v/v) 甲酰胺和 0.1% (v/v) Tween-20。
2. 配制 MABT 缓冲液：100 mM 马来酸、150 mM NaCl、0.1% (v/v) Tween-20，pH 7.5。
3. 将两种探针（DIG 标记和 FITC 标记）用预热至 65 °C 的杂交缓冲液按 1/1,000 比例稀释，并充分混匀。
4. 每张载玻片上加入约 300 µl 杂交混合液，用经烘箱烘烤（200 ^oC）的盖玻片覆盖，于湿盒中 65 °C 过夜孵育。
5. 将载玻片转移至盛有预热洗涤缓冲液的考普林瓶中，在 65 °C 下用洗涤缓冲液洗涤两次，每次 30 分钟。
6. 在室温下用 MABT 缓冲液洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。

5. FITC 探针的可视化

1. 配制原位杂交封闭缓冲液：在MABT中加入2%封闭试剂和10%热灭活羊血清。
2. 可选：使用疏水笔在载玻片上的组织切片周围画圈，以减少所需抗体溶液的体积。
3. 将载玻片置于湿盒中，于室温下用原位杂交封闭缓冲液孵育1小时。
4. 将载玻片在4 °C下用辣根过氧化物酶（POD）标记的抗FITC抗体以1/500（v/v）比例溶于原位杂交封闭缓冲液中，过夜孵育（O/N）。
5. 将载玻片放入盛有含0.1%（v/v）Tween-20的PBS（PBST）的考普林罐中，每次用新鲜PBST洗涤10分钟，共洗涤3次。
6. 使用前立即用扩增稀释液将荧光酪胺稀释100倍。本示例中使用FITC-酪胺。
7. 将上述溶液加入载玻片，室温下孵育10分钟。
8. 将载玻片放入考普林罐中，用PBST洗涤3次，每次10分钟。

6. DIG 探针的可视化

1. 配制 0.1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.2。
2. 将切片在原位杂交封闭缓冲液（ISH blocking buffer）中室温孵育 1 小时。
3. 将切片在 4 °C 条件下与碱性磷酸酶（AP）标记的抗 DIG 抗体以 1/1,500（v/v）比例溶于 ISH 封闭缓冲液中，过夜孵育 。
4. 用 MABT 溶液每次洗涤 10 分钟，共洗涤三次。
5. 在室温下用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2）每次洗涤 5 分钟，共洗涤两次。
6. 使用前立即配制 Fast Red 溶液：将试剂片剂溶解于 0.1 M Tris 缓冲液（pH 8.2）中，并通过 0.22 µM 滤膜过滤溶液。
7. 将切片置于湿化 chamber 中，于 37 °C 用 Fast Red 溶液孵育。由于最佳显色时间因样本而异，需定期使用荧光显微镜观察沉淀物的形成情况。本示例中，在孵育 2–3 小时后终止反应。
8. 用 PBST 溶液每次洗涤 10 分钟，共洗涤三次。

7. 免疫组织化学

1. 配制免疫组化封闭缓冲液：将10% (v/v) 的血清（与一抗宿主物种不同）加入PBST中。
2. 将切片置于湿盒中，用免疫组化封闭缓冲液在室温下孵育1小时。
3. 配制一抗溶液：将一抗用含5%血清（与一抗宿主物种不同）的PBST按适当比例稀释。本示例中使用兔抗Olig2抗体，按1/400 (v/v) 比例稀释。
4. 在4 °C下用一抗溶液过夜孵育。
5. 用PBST洗涤10分钟，重复三次。
6. 配制二抗溶液：将荧光标记的二抗（与一抗宿主物种不同）用含5% (v/v) 血清和0.1% (v/v) Hoechst 33258的PBST按适当比例稀释。本示例中使用驴抗兔Alexa647标记的二抗，按1/1,000 (v/v) 比例稀释。
7. 在室温下用二抗溶液孵育1小时。
8. 用PBST洗涤10分钟，重复三次。

8. 封片

1. 在室温下部分干燥载玻片，然后使用荧光封片剂封片。将载玻片完全干燥后，使用共聚焦显微镜在10X、20X和63X物镜下进行成像，共采用四个不同通道，其激发波长分别为：Fast Red使用570 nm，FITC使用488 nm，Olig2免疫标记使用647 nm，Hoechst使用350 nm。

结果

本文介绍了一种在小鼠脑切片中进行双重荧光原位杂交（ISH）后接免疫标记的方法。该方案的简要描述如下所示： 图1. 第一步是合成特异于 Aspa 和 Mbp（髓鞘碱性蛋白））。为确认探针是否成功合成，将每个反应体系的一小部分上样至琼脂糖凝胶进行电泳检测。可见微弱的线性模板条带以及大量RNA探针条带。图2双荧光原位杂交 用于Aspa 和 Mbp随后对小鼠脑切片进行Olig2免疫标记及Hoechst核染色。我们使用共聚焦显微镜扫描脑切片，并将图像拼接，以展示基因表达信号在脑内的分布情况。 Aspa 表达于 Mbp阳性（Mbp+) 细胞在整个大脑中均被观察到 （图3） 我们还检测了 Aspa 使用更高倍率观察不同脑结构中的表达情况。 Aspa 皮层和胼胝体少突胶质细胞中...

讨论

本方案提供了进行双重RNA 原位 杂交后接免疫染色的逐步操作流程。我们已利用该方案证实，Aspa 在多个脑区的成熟少突胶质细胞中表达。

该多步实验流程存在多个可能影响检测灵敏度的潜在问题，需加以避免。首先，转录反应所用的所有溶液及储存缓冲液必须为无RNase的。其次，cDNA模板的选择至关重要，我们倾向于使用长度约为1 kb的模板。在进行体外转录前，必须通过苯酚/氯仿抽提对cDNA模板进行纯化，并重新沉淀。 体外 转录。此外，探针的转录需要达到最佳状态；如果探针产量不足，将降低原位杂交（ISH）的质量。可通过琼脂糖凝胶电泳检测探针质量，高质量的探针在凝胶上表现为与模板条带相比具有更强的荧光亮度条带（图2）。对于双重原位杂交（double ISH），需使用两种不同标记的探针，通常一种用DIG标记，另一种用FITC标记。由于FITC标记的探针检测信号较弱，应将其用于靶mRNA在组织中预期表达水平较高的基因。该探针通常先进行显色检测，随后再进行DIG标记探针的显色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAprep 质粒小量提取试剂盒	Qiagen	27104
去离子甲酰胺	Sigma	F9037	用于原位杂交封闭缓冲液
氯化钠	Sigma	S3014
Trizma 碱基	Sigma	T1503
盐酸	VWR International	20252.290
无水磷酸二氢钠	Sigma	S8282
二水合磷酸氢二钠	Sigma	30435
酵母 tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt 溶液	Life Technologies	750018
硫酸葡聚糖	Sigma	D8906
Aspa cDNA 克隆	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
乙酸钠	Sigma	S2889
平衡酚	Sigma	P4557
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432
异戊醇	Aldrich	496200
乙醇	VWR International	20821.321
T7 RNA 聚合酶	Promega	P4074
转录缓冲液	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG 核苷酸混合物	Roche	11277073910
RNasin	Promega	N251B
多聚甲醛	Sigma	P6148
滤纸	Fisher scientific	005479470
蔗糖	Sigma	59378
焦碳酸二乙酯	Sigma	D5758
戊巴比妥钠	Animalcare Ltd	BN43054
解剖剪刀	World Precision Instruments	15922
25 号针头	Terumo	300600
蠕动泵	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
虹膜剪刀	Weiss	103227
2 号镊子	World Precision Instruments	500230
冠状脑切片模具	World Precision Instruments	RBMS-200C
剃须刀片	Personna Medical	PERS60-0138
OCT 包埋介质	Tissue tek	4583
冷冻切片机/切片机	Bright
Superfrost Plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
柠檬酸钠	Sigma	S4641	用于 65 °C 洗涤缓冲液
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
盖玻片	VWR International	631-0146
柯普林瓶	Smith Scientific Ltd	2959
封闭试剂	Roche	11096176001
热灭活羊血清	Sigma	S2263
疏水笔	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC 辣根过氧化物酶标记抗体	Roche	11426346910
TSA™ Plus 荧光素系统	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG 碱性磷酸酶标记抗体	Roche	11093274910
Fast Red 片剂	Roche	11496549001
0.22 µm 滤膜	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 兔抗体	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647 标记的 α-兔抗体	Life technologies	A-31573	1:1,000
双苯并咪唑 H 33258	sigma	B2883
封片介质	Dako	S3023
Leica SP2 共聚焦显微镜	Leica