基于高效液相色谱测量的近红外光谱蓝莓成分含量无损预测模型构建

摘要

本文介绍了一种利用近红外光谱法对单个蓝莓中总糖、总有机酸和总花青素含量进行无损预测的模型构建与验证方案。

摘要

农产品成分含量的无损预测有助于保证产品质量，便于产品的运输和销售。本文采用近红外光谱法对单个蓝莓中的总糖、总有机酸和总花青素含量进行无损预测。该技术有望从所有采收的蓝莓中筛选出仅口感优良的果实。通过漫反射模式测量蓝莓在非萼片位置的近红外吸收光谱。利用高效液相色谱法测定蓝莓的成分含量，用于建立根据观测光谱预测成分含量的模型。模型构建采用偏最小二乘回归法。需合理选择光谱的预处理方法以及用于分析的光谱波长范围。所建模型必须经过验证，以确认其能够以实际应用可接受的精度预测成分含量。本文提供了一套通过近红外光谱法无损预测蓝莓成分含量的模型构建与验证方案。

引言

近红外（NIR）光谱技术作为一种无损检测方法，已广泛应用于分析各类水果和蔬菜的成分。^1,2 利用近红外光谱进行无损检测，可确保仅运输品质优良、口感上乘的果蔬产品。目前，该技术已用于橙子、苹果、甜瓜、樱桃、猕猴桃、芒果、木瓜、桃子等水果，以测定其对应于总糖含量的糖度（Brix）、酸度、总固形物含量（TSC）等指标。近期，我们报道了近红外光谱技术在蓝莓品质评价中的应用。³ 我们不仅测定了蓝莓的总糖含量和对应酸度的总有机酸含量，还测定了总花青素含量。花青素是一种具有生物活性的成分，被认为对人体健康有益。若消费者能够购买到糖度、酸度和花青素含量均有保障的美味蓝莓，将极为便利。

在水果和蔬菜的近红外吸收光谱中，仅能观察到宽泛的吸收带，这些吸收带主要由纤维和水分引起。尽管同时可观察到许多由未破坏目标样品中各种成分产生的弱吸收带，但在大多数情况下，无法将这些吸收带归因于目标样品特定组分的特定振动模式。因此，利用朗伯-比尔定律测定特定组分含量的传统方法对近红外光谱并不适用。取而代之的是，通过化学计量学方法分析观测光谱与对应光谱的组分含量之间的相关性，建立用于从观测光谱预测目标组分含量的校准模型^4,5。本文提供了一种从近红外光谱预测蓝莓总糖含量、对应酸度的总有机酸含量以及总花青素含量的模型构建与验证方案。

图1展示了构建可靠且稳健校准模型的一般流程图。收集足够数量的样品，其中一部分用于模型的构建，另一部分用于验证所构建的模型。对每个采集的样品，测量其近红外（NIR）光谱，然后采用传统的破坏性化学分析方法对目标组分进行定量分析。此处，采用高效液相色谱法（HPLC）对糖类、有机酸和花青素进行化学分析。采用偏最小二乘法（PLS）回归构建校准模型，考察观测光谱与化学分析测定的组分含量之间的相关性。为了构建具有最佳预测能力的稳健模型，还需考察观测光谱的预处理方法以及用于预测的波长区域。最后，对构建的模型进行验证，以确认其具备足够的预测能力。在验证过程中，将通过构建模型由观测光谱预测得到的组分含量（预测值）与化学分析测定的结果（观测值）进行比较。若预测值与观测值之间无法建立足够强的相关性，则应重新构建校准模型，直至获得足够强的相关性为止。尽管如本图所示，使用不同的样品组分别进行模型构建与验证（外部验证）更为理想，但当样品数量不足以分为不同组时，也可使用同一组样品同时进行模型构建与验证（交叉验证）。

图1. 校准模型构建与验证的流程图。 蓝线和绿线包围的步骤分别对应校准模型的构建及其验证过程。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 样品采集

1. 确定校准模型目标中将包含的品种。
2. 采集目标品种的足量且多种类型的蓝莓样品。
   1. 建议采集约100颗蓝莓用于构建校准模型，至少10颗用于验证所构建的模型。为了构建稳健的模型，应采集多种类型的样品，i.e. 具有不同颜色、大小以及不同成熟度的样品。
3. 称量每颗蓝莓。注意：所测得的重量将用于后续计算每颗蓝莓中各成分的含量百分比。

2. 光谱测量

1. 在测量前充分预热分光光度计（超过1小时），以获得可靠的光谱数据。
2. 设置分光光度计，确保整个测量过程中条件保持恒定。以下为典型测量条件的示例：
   1. 将测量范围设置为 12,500–3,600 cm^-1。
   2. 将光谱分辨率为设置为 16 cm^-1。
   3. 设置累加次数为 32 次。
3. 选择漫反射作为测量模式。
4. 将标准反射器置于分光光度计用于漫反射测量的窗口上。使用"背景单通道"命令测量背景光谱，该光谱将自动用于后续样品蓝莓光谱计算相对反射光谱。
5. 将蓝莓样品置于分光光度计用于漫反射测量的窗口中心位置。使用"样品单通道"命令，最好在果实多个点位测量每颗蓝莓的光谱。
   注意：如果光谱采集条件已设定为执行该操作，则样品蓝莓观测光谱将自动进行Kubelka-Munk转换^6,7。Kubelka-Munk转换可将漫反射模式下测得的光谱转换为等效于透射模式下测得的光谱，对于高精度光谱分析是必需的。分析时使用吸光度标度的光谱。
6. 若对同一蓝莓样品在多个点位进行了光谱测量，可使用如 Microsoft Excel 等数据处理程序计算各样品光谱的平均值。使用平均后的光谱进行分析。

3. 糖类和有机酸高效液相色谱检测的预处理⁸

注意：使用超纯水提取每颗蓝莓中的糖类和有机酸（这些物质可溶于水），具体步骤如下。每颗蓝莓整体用于分析。

1. 将蓝莓保存在低于 -30 °C 的冷冻设备中，以备在完成光谱测量后立即进行化学分析。
2. 将蓝莓切成若干小块，以便在后续步骤中易于均质化。若蓝莓为冷冻状态，无需解冻，直接进行切割。
3. 将样品放入50 ml烧杯中。
4. 向烧杯中加入约 10 ml 超纯水（电导率小于 0.1 μS/cm 的蒸馏水）。
5. 将切碎的蓝莓置于超纯水中，用微波炉加热20秒，以灭活可能在分析过程中分解糖类的酶。
6. 添加 约 10 ml超纯水加入烧杯中。
7. 使用配备标准轴和发生器的匀浆器，在12,000 rpm条件下将混合物匀浆5分钟。
8. 将匀浆混合物在3,000 rpm（2,000 × g）条件下离心10分钟。
9. 使用5B滤纸通过真空抽滤收集离心后样品的滤液。
10. 重复步骤 3.6–3.9 两次，以充分回收滤渣中的全部糖类和有机酸，并合并所有滤液。
11. 用稀盐酸（0.1 和 0.01 mol L⁻¹）测定滤液的 pH 并调节至 7^-1）以及氢氧化钠的稀水溶液（0.1 和 0.01 mol L^-1).
12. 用超纯水将滤液稀释至50 ml。
13. 将样品分为两份；一份用于糖类分析，另一份用于有机酸分析。
14. 将第一个样品溶液依次通过串联的两根C18柱、CM柱和QMA柱，以去除色素、阳离子和阴离子。弃去柱流出液的前1 ml。随后收集柱流出的样品溶液，用于HPLC分析糖类。
15. 将第二个样品溶液通过串联的两根柱子（C18 和 CM）以去除色素和阳离子。弃去柱子流出液的前 1 ml。然后收集柱子流出的样品溶液，用于 HPLC 分析有机酸。
16. 将3.14和3.15步骤中的每种溶液分别置于配备0.45 µm滤膜的微量离心管中，使用微型离心机在6,600 rpm（5,800 × g）下离心10分钟，然后进行HPLC分析。

4. 糖类的高效液相色谱检测

注意：在本研究中，每颗蓝莓中蔗糖、葡萄糖和果糖的总含量被视为总糖含量。因此，首先分别获得三种糖的标准工作曲线，然后计算每颗蓝莓中糖的总含量。标准含量分别为 0.3–0.4 wt%（蔗糖）、3.8–4.8 wt%（葡萄糖）和 4.2–5.3 wt%（果糖）。⁹

1. 准确称取约 200 mg 蔗糖，溶于 50 ml 超纯水中，配制标准溶液。取 5 ml 该溶液用超纯水稀释至 50 ml，配制第二级标准溶液。以第二级标准溶液为原料，同样方法配制第三级标准溶液。
2. 以相同方法配制葡萄糖和果糖的标准溶液。
3. 按以下条件设置高效液相色谱（HPLC）系统：
   1. 色谱柱使用凝胶渗透柱，并置于 40 °C 的柱温箱中。
   2. 流动相使用脱气的超纯水，流速为 0.1 ml/min。
   3. 检测器使用示差折光检测器。
4. 每次进样 20 µl，测定各标准溶液的 HPLC 色谱图。注意：此处使用 PAC Solution 软件进行测定。
5. 用鼠标右键点击“重新分析”功能，获取各标准溶液色谱图中糖峰的峰面积强度。
6. 以各标准溶液中糖的峰面积强度对其相应浓度作图，通过线性回归绘制工作曲线，得到每种糖的峰面积强度与浓度之间的关系方程。
7. 每次进样 20 µl，测定各样品溶液的 HPLC 色谱图。
8. 参照步骤 4.5 的方法，获取各样品溶液色谱图中各糖峰的峰面积强度。
9. 利用步骤 4.6 中获得的工作曲线对应方程，计算各样品溶液中各糖的浓度。
10. 根据上一步所得样品溶液中各糖的浓度及样品溶液总体积（50 ml，见步骤 3.12），计算每颗蓝莓中各糖的含量。
11. 将三种糖的含量相加，得到每颗果实的总糖量。
12. 利用步骤 1.3 中测得的蓝莓重量，计算每颗蓝莓中总糖含量的百分比。

5. 有机酸的高效液相色谱检测

注意：本研究中，柠檬酸、奎宁酸、苹果酸和琥珀酸的总含量被视为总有机酸含量。因此，首先获得这四种有机酸各自的工作曲线，然后测定每颗蓝莓中的有机酸含量。标准含量范围报告为0.42–0.62 wt%（柠檬酸）、0–0.15 wt%（奎宁酸）、0.08–0.23 wt%（苹果酸）和0.06–0.25 wt%（琥珀酸）。⁹

1. 准确称取约 5 mg 柠檬酸，溶于 50 ml 超纯水中，配制标准溶液。取 5 ml 该溶液用超纯水稀释至 50 ml，配制第二级标准溶液。再以第二级标准溶液按同样方法配制第三级标准溶液。
2. 参照上述方法，分别配制奎宁酸、苹果酸和琥珀酸的标准溶液。
3. 按以下条件设置高效液相色谱（HPLC）系统：
   1. 在 40 °C 柱温箱中串联使用两根阴离子交换色谱柱。
   2. 以脱气的 0.1% 磷酸水溶液作为流动相，流速为 0.02 ml/min。
   3. 使用紫外-可见光检测器，检测波长设为 210 nm。
4. 每次进样 20 µl 标准溶液，测定各标准溶液的 HPLC 色谱图。
5. 通过鼠标右键点击“重新分析”功能，获取各标准溶液色谱图中有机酸色谱峰的峰面积强度。
6. 以各标准溶液中有机酸的峰面积强度对其相应浓度作图，采用线性回归法绘制工作曲线，得到每种有机酸的峰面积强度与浓度之间的关系方程。
7. 每次进样 20 µl 样品溶液，测定各样品溶液的 HPLC 色谱图。
8. 参照步骤 5.5 的方法，获取各样品溶液色谱图中各有机酸色谱峰的峰面积强度。
9. 利用步骤 5.6 中获得的工作曲线对应的关系方程，计算各样品溶液中各有机酸的浓度。
10. 根据上一步所得样品溶液中各有机酸的浓度及样品溶液的总体积（50 ml，见步骤 3.12），计算每颗蓝莓中各有机酸的含量。
11. 将四种有机酸的含量相加，得到每颗蓝莓中总有机酸的含量。
12. 利用步骤 1.3 中测得的蓝莓重量，计算每颗蓝莓中总有机酸的含量百分比。

6. 花青素高效液相色谱检测的预处理

1. 若蓝莓在完成光谱测量后不立即进行化学分析，应将其保存在低于 -80 °C 的冰箱中，以备后续化学分析使用。
2. 使用真空冷冻干燥机对每颗冷冻果实干燥 12 小时。
3. 将干燥后的蓝莓置于含 1% 三氟乙酸的甲醇溶液中（蓝莓质量（g）与溶液体积（ml）之比为 1:10），于 4 °C 冰箱中静置 12 小时，以提取花青素。
4. 将提取液在 2 ml 微量离心管中，于 -8 °C 条件下，以 15,000 rpm（21,900 × g）超速离心 15 分钟。
5. 用 0.45 µm 滤膜过滤提取液，获得用于高效液相色谱（HPLC）分析的样品。

7. 花青素的高效液相色谱检测

注意：蓝莓中含有约13种不同的花青素。由于难以获得所有花青素的工作曲线，因此仅针对蓝莓中最常见的花青素之一——矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物——建立工作曲线，并将其用于其他花青素的大致定量分析。

1. 称取约 1.5 mg 的 cyanidin-3-O准确称取-葡萄糖苷氯化物，溶于10 ml 1%三氟乙酸甲醇溶液中，配制成标准溶液。取5 ml该溶液，用1%三氟乙酸甲醇溶液稀释至10 ml，制备第二份标准溶液。依此类推，依次制备第三和第四份标准溶液。
2. 按照以下方式设置高效液相色谱（HPLC）系统：
   1. 使用C18反相色谱柱，并置于40 °C柱温箱中。
   2. 采用梯度洗脱方法，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈中含0.5%三氟乙酸，流速为0.1 ml/min；进样后0–50分钟内，流动相B的比例从8%升至15%；50–60分钟内，流动相B的比例从15%升至75%。
   3. 使用光电二极管阵列检测器在520 nm处进行监测。
3. 通过每次进样10 µl等分试样，测定标准溶液的高效液相色谱图。 "LC 溶液" 使用该软件进行测量。
4. 获取矢车菊素-3-的条带面积强度O-葡萄糖苷氯化物在每种标准溶液色谱图上的峰。
5. 将面积强度与相应的浓度作图，绘制出矢车菊素-3-的校准曲线O通过线性回归法测定矢车菊素-3-葡萄糖苷氯化物，其中获得代表峰面积强度与浓度之间关系的方程，用于矢车菊素-3-葡萄糖苷氯化物O-葡萄糖苷氯化物
6. 通过每次进样10 µl样品溶液，测定各样品溶液的高效液相色谱图。
7. 按照步骤7.4中所述方法，获取各样品溶液色谱图中每种花青素条带的面积强度。
8. 使用步骤7.5中获得的工作曲线对应方程，计算溶液中花青素的浓度。
9. 根据上一步骤测得的浓度以及第6.3步中所用样品溶液的总体积，计算每颗蓝莓中各花青素的含量。
10. 通过加总13种花青素的含量，计算每颗蓝莓中的花青素总量。
11. 通过步骤1.3中测得的重量，计算每份蓝莓中总花青素的含量百分比。

8. 成分含量预测校准模型的构建

注：偏最小二乘回归（PLS 回归）^4,5 是一种利用潜在变量的多元回归技术，用于根据观测光谱和通过化学分析测定的组分含量，为每种组分建立校准模型。PLS 回归可使用商业软件或自行开发的程序进行。有关模型构建的详细过程，请参见参考文献^5,10。

1. 检验观测光谱的哪些预处理方法对实现准确且稳健的预测最为有效。
   1. 通过应用以下一种或两种预处理方法构建校准模型：MSC（多元散射校正）^1,2,5、SNV（标准正态变量变换）^1,2,5、MMN（最小-最大归一化）、COE（恒定偏移消除），以及采用SG（Savitzky-Golay）方法^1,2,5计算一阶或二阶导数。利用所构建的模型，根据验证集样本的光谱预测其成分含量。
      注：在MMN中，光谱被归一化，使其最小值和最大值分别为0和1。在COE中，光谱的纵坐标被平移，使其最小值变为零。
   2. 计算验证集中实测值与预测值之间的决定系数R²和残差预测偏差RPD，以评估不同光谱预处理方法的有效性。选择能获得更高R²和RPD值的预处理组合。
2. 通过例如移动窗口PLS技术¹¹来分析哪些波数区域有助于实现准确且稳健的预测，从而筛选出有效波数区间。
   注：该步骤相当于去除光谱中不含有效预测信息或含有干扰预测信息的波数区域。

9. 构建的校准模型的验证

注：有关构建模型验证的详细过程，请参见参考文献^5,10。

1. 利用构建的校准模型，结合最佳的预处理方法和对预测有效的波数范围，根据验证集的光谱预测其成分含量。^5,10
2. 计算验证集中实测值与预测值之间的 R² 和 RPD。^5,10
3. 检查校准模型实际性能的一般标准^12,13是否满足，即 R² > 0.85 且 RPD > 2.5；若不满足，应考虑重新构建模型。

结果

图2 展示了一组蓝莓的近红外吸收光谱示例，其中同时显示了70个蓝莓的光谱。由于在近红外光谱中未观察到可明确归属于糖类、有机酸或花青素的吸收峰，传统的朗伯-比尔定律不适用于定量分析其成分含量。因此，有必要构建模型以预测成分含量。

图3 显示蓝莓中糖类定量分析的典型色谱图。自上而下的三个图分别为蔗糖、葡萄糖和果糖标准溶液的色谱图。最下方的图显示了样品溶液的色谱图。 即 蓝莓提取物。样品溶液中糖的种类和浓度可通过观察到的色谱峰的保留时间及峰面积强度确定。总糖含量为蔗糖、葡萄糖和果糖含量的总和。

图4展示了蓝莓中有机酸分析的色谱图示例。通过参照标准溶液的色谱图（此处未显示），可确定样品溶液中有机酸的种类和浓度。根据图注中对...

讨论

以下是对本实验方案的一些补充说明。首先，在步骤1.1中提到需要确定目标中包含的品种。尽管可以构建涵盖多个品种蓝莓或不指定品种的模型，但这些模型的预测准确度有时远低于针对单一品种或有限品种所构建模型的准确度。还应注意，为了获得较高的预测性能，应针对不同产地的蓝莓分别建立校准模型，因为不同产地收获的蓝莓具有不同的特性，这些特性会影响预测性能。¹

其次，在步骤 2.3 中提到，应选择漫反射模式进行光谱测量。分光光度计也具备透射模式以供测量使用。尽管透射模式下测得的光谱也可用于构建校准模型，但在大多数情况下，使用漫反射模式测得的光谱可构建更为准确且稳健的模型。总有机酸含量无法利用透射模式测得的光谱进行预测。³

第三，对于蓝莓光谱的测量，不建议在萼片处进行，因为萼片区域的表面状态和内部成分与其他位置不同。尽管如此，仍有可能利用在萼片和其他位置采集的大量光谱数据建立校准模型。然而，在大多数情况下，这些模型的准确性低于仅使用非萼片位置光谱数据构建的模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
傅里叶变换近红外分光光度计	Bruker Optics GmbH	MPA
高效液相色谱仪	岛津公司	228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31	用于糖类分析
		223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31	示差折光检测器
高效液相色谱仪	岛津公司	228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31	用于有机酸分析
		228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31	紫外-可见光检测器
高效液相色谱仪	岛津公司	228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31	用于花青素分析
		228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31	光电二极管阵列检测器
		228-45009-31
pH计	梅特勒-托利多	30019028	S220，自动温度补偿
超纯水处理设备	ORGANO公司	ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0	PURELAB ultra；PURELITE
医用冷冻柜	SANYO	2-6780-01	MDF-U338
超低温冰箱	松下医疗健康有限公司	KM-DU73Y1	-80 °C
真空冷冻干燥机	岩城玻璃有限公司	119770	DRC-3L；FRD-82M
均质器	Microtec有限公司	Physcotron
超速离心机	日立工机有限公司	S204567	CF15RXII
微型离心机	LMS公司	KN3136572	MCF-2360
离心机	光泉公司	2-5534-01	H-103N
滤纸	Advantec	1521070	5B，相当于Whatman 40
Sep-Pak C18柱	沃特世公司米尔福德	WAT020515
Sep-Pak CM柱	沃特世公司米尔福德	WAT020550
Sep-Pak QMA柱	沃特世公司米尔福德	WAT020545
离心过滤装置	默克密理博公司	R2SA18503	PVDF，0.45 μm
微量离心管	As One公司	1-1600-02	聚丙烯，2 ml
注射器滤器	GE医疗有限公司	6788-1304	聚丙烯，0.45 μm
蔗糖	和光纯药工业有限公司	194-00011	试剂级
葡萄糖	和光纯药工业有限公司	049-31165	试剂级
果糖	和光纯药工业有限公司	123-02762	试剂级
柠檬酸	和光纯药工业有限公司	036-05522	试剂级
苹果酸	和光纯药工业有限公司	355-17971	试剂级
琥珀酸	和光纯药工业有限公司	190-04332	试剂级
奎宁酸	Alfa Aesar，A Johnson Matthey公司	10176328	试剂级
磷酸	和光纯药工业有限公司	162-20492	高效液相色谱级
三氟乙酸	和光纯药工业有限公司	208-02746	试剂级
甲醇	和光纯药工业有限公司	131-01826	试剂级
乙腈	和光纯药工业有限公司	015-08633	高效液相色谱级
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物	和光纯药工业有限公司	306-37661	高效液相色谱级
分析软件	Bruker Optics GmbH	OPUS ver. 6.5
预处理软件	微软	Excel（基于Visual Basic for Applications）
模型构建软件		Freemat 4.0	http://freemat.sourceforge.net/