方法文章

内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模

DOI：

10.3791/53982

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2016年9月26日

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1Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine, 6Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

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本手稿提供了髂内动脉 （IIA） 注射的详细程序，这是一种将癌细胞特异性输送到包括骨骼在内的后肢组织以建立实验性骨转移的技术。虽然最初是用乳腺肿瘤模型建立的，但该方案可以很容易地扩展到其他癌症类型。

摘要

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髂内动脉 （IIA） 注射是一种在动物体内引入各种癌细胞转移病灶的有效方法。与广泛使用的心内和胫骨内注射相比，IIA 注射具有几个优点。首先，它可以将大量癌细胞特异性地递送到后肢骨骼，从而提供时空同步的早期定植事件，并允许对播散的肿瘤细胞进行稳健的定量和快速检测。其次，它将癌细胞注射到循环中而不会损害局部组织，从而避免了混淆骨定植过程的炎症和伤口愈合过程。第三，IIA 注射在非骨器官中引起非常小的转移生长，从而防止动物屈服于其他重要转移，并允许连续监测惰性骨病变。 这些优势对于检查从单个癌细胞到多细胞微转移的进展特别有用，这在过去基本上是难以捉摸的。当与生物成像和骨组织学的尖端方法相结合时，IIA 注射可应用于与骨转移相关的各种研究目的。

引言

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转移占引起实体瘤死亡的90％以上。骨是受各种癌症类型，特别是乳腺癌和前列腺癌的转移中最常见的器官。当诊断在临床上，骨转移一般都已经进入高级阶段，在骨无论是溶骨性或成骨细胞的改变，常伴有神经症状。

以往的研究主要集中在明显溶骨骨转移1-3，但是我们目前有溶骨过程来临前限制骨骼微的理解。这至少部分是由于缺乏合适的实验模型和方法。乳腺癌的基因工程小鼠模型常转移至肺部，但更高效地骨4。同样，原位移植瘤很少自发的骨转移，一些骨热带4T1乳腺carcinom子的克隆和MSP过表达PyMT转基因小鼠模型例外5-7。帧内胫钻孔可以提供癌细胞的骨8-10，但它也导致损伤和炎症到局部组织。目前的乳腺癌细胞系心内注射已经调查骨定植11-13的主要方法。然而，在癌症细胞导入左心室只有有限的比例将最终达到骨和骨髓，使得它难以跟踪在一个量化的方式微观转移。

在这项研究中，我们建立了一种技术，即帧内髂动脉（ⅡA）注射14，癌细胞选择性地递送到后肢组织中，从而丰富癌细胞在骨和骨髓而不导致破坏局部组织。由于骨特异性，该方法还允许有足够的时间好逸恶劳癌细胞的一个前殖民最终imals屈从于原发肿瘤或转移的其他重要器官。当与各种其他技术，如生物发光成像，免疫荧光染色和骨形态计量学结合，ⅡA注射是相关的骨转移研究目....

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方案

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所有的动物工作是按照药品的贝勒医学院的动物护理准则进行。

1.细胞的制备

注意:不同的癌细胞系可以用于IIA注射取决于研究目的。我们已经使用了乳腺癌细胞系MCF7，4T1，4T07，MDA-MB-361，MDA-MB-231，MDA-MB-436和前列腺癌细胞系C4-2在我们的研究。我们通常使用两种GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞对我们的研究，并从GFP荧光素酶标记的MCF7细胞系在这里显示的一些数据。

  1. 保持在5％CO 2含有10％FBS和0.1mg / ml的青霉素-链霉素，在37℃的细胞在DMEM中。
  2. IIA注射前，trypsinize在80细胞 - 90％汇合，用0.25％胰蛋白酶/ EDTA溶液。用冷PBS洗细胞两次，并重新悬浮细胞在10ml PBS中的细胞计数。以除去PBS，离心细胞，在800×g离心5分钟。
  3. 重新悬浮细胞在冰冷的PBS一个的5×10 6个细胞/ ml的浓度。
  4. 用100微升GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞注射IIA一个鼠标的。
    注意:因此，每个动物接收的细胞数为5×10 5个该数目可能需要基于对细胞系的侵袭性被改变。
  5. 置于冰上细胞悬液。
    可能需要的振动，以防止细胞聚集每隔几分钟，直到它准备好用于注射:....

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结果

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图1示出的解剖位置和髂总动脉（红色）和静脉（蓝色）的关系。

图2显示了在解剖镜下髂血管和神经的相对位置。 如图2A所示，血管和神经的右腹膜壁下方和皮肤切口由与腹膜推开后，可以发现。髂总静脉是在左侧，并与动脉是更大和更暗。动脉是在中间，并期待粉红色。它比静脉薄，但有更厚的肌壁。静脉和动脉平行且相互紧密相连。在右边更远是白腰骶神经。 图2B示出了由4-从周围结缔组织，肌肉和神经分离，并举起髂血管0丝线缝合。髂总静脉，动脉，腰骶神经也表示。

图3显示了内髂动脉注射后的代表在体内和动物的体外生物发光图像。五×10 5个

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讨论

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虽然只有髂动脉被注射癌细胞的目标，我们建议既髂静脉和动脉从周围组织中分离，并把它们一起抬起作为包。这是因为静脉和动脉广泛相互接触，与静脉血管壁薄，容易断裂。因此，对于一个成功的注射，这样可以节省时间和精力，将两个容器保持在一起，虽然癌细胞仅注射到动脉。 4-0丝线来帮助这个过程如图2所示，缝合线还可以帮助它应该出现止血。

需要的解剖显微镜下进行IIA注射的大多数步骤。鼠标容器是柔软而小，这使得程序有挑战性。在我们的经验100％ - 然而，经过充分实践，成功率可以达到90。

利用这种技术，研究人员可以是BLE建立自己喜欢的肿瘤细胞模型的骨骼殖民化模型，包括那些传统上认为"非转移"。 MCF-7细胞表示这样的例子。事实上，在骨微环境到达时，MCF-7细胞起飞拓殖之前经历短暂休眠。在进行原位乳腺癌MCF-7异种移植物的动物已检测很少自发骨转移。然而，故障很可能从播散的肿瘤细胞的剩余量，定植的缓慢启动，和原位肿瘤的更积极的增长（即杀死动物前骨病变可建立）导致。因此，缺乏检测不能被视为证据对MCF-7细.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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张实验室的研究得到了 X. H.-F 的支持。Z. 的 NCI CA151293，乳腺癌研究基金会CA183878，美国国防部 DAMD W81XWH-13-1-0195，CA149196-04 飞行员奖，麦克奈尔医学研究所和 H.W. 的美国国防部 DAMD W81XWH-13-1-0296。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
DMEMHyCloneSH30022.01
FBSGibco16000
笔/链球菌两性霉素 BLonza Biowhittaker17-745E
PBSLonza Biowhittaker17-516F
胰蛋白酶/EDTA 溶液HyCloneSH30042.01
45 &亩;M 细胞过滤器VWR 国际实验室195-2545
MediGel CPF 含卡洛芬 护理的受控项目用于疼痛管理
丁丙诺啡 兽医护理的受控项目用于疼痛管理
雌二醇颗粒美国创新研究SE-121
氯胺酮和甲苯噻嗪BCM
软膏BCM避免眼睛干涩
剃须刀Oster78005-050用于毛鼠
异丙醇ACROS67-63-0
优碘手术磨砂中兽医护理的受控项目
Ted Pella， Inc549-3CS-10多个
3 号手柄Ted Pella， Inc541-31需要高压灭菌
无菌手术单Sai 输液技术PSS-SD1
直镊子 Roboz 手术器械RS-5132需要高压灭菌
直细镊子精细科学工具11253-20需要高压灭菌
边缘细镊子精细科学工具11253-25需要高压灭菌
4-0 薇乔线缝合Johnson &Johnson Health CareJ214H
31 G 胰岛素注射器BD328418多个
棉签（无菌）VWR 国际实验室89031-272
皮肤胶Henry Schein 动物保健31477用于手术部位皮肤闭合
耳标涂抹器Fine Science Tools24220-00
耳标Fine Science Tools24220-50
D-荧光素金生物技术LUCK避光并冰敷
28 G 胰岛素注射器BD329410用于眶内注射
ParaformadehydeAlfa Aesar30525-89-4用于组织固定
EDTAOmniPur4050用于骨组织脱钙
名称公司目录号评论
设备
解剖显微镜徕卡 LeicaLeica S6E 立体
IVIS Lumina II 成像系统Advanced Molecular Vision
名称公司目录号<strong>评论
>抗体
抗 GFP 抗体 （JL-8）Clontech632381
ALP 抗体Abcamab108337
抗 Osterix 抗抗体Abcamab22552
BCM 兽医BCM 兽医护理的受控项目 兽医 兽医护理的受控项目 膏 BCM#10 手术刀刀片抗

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  2. Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometa....

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