髂内动脉注射法用于高效选择性建立微小骨转移模型

摘要

本文提供了经髂内动脉（IIA）注射的详细操作步骤，该技术可将癌细胞特异性地递送至包括骨骼在内的后肢组织，以建立实验性骨转移模型。尽管该方法最初是在乳腺肿瘤模型中建立的，但本方案可轻松扩展应用于其他类型的癌症。

摘要

髂内动脉（IIA）注射是一种在动物体内引入多种癌细胞转移病灶的有效方法。与广泛使用的经心腔注射和经胫骨注射相比，IIA注射具有多项优势。首先，它能够将大量癌细胞特异性地输送至后肢骨骼，从而实现空间和时间上同步的早期定植事件，便于对播散性肿瘤细胞进行可靠定量和快速检测。其次，IIA注射将癌细胞注入循环系统的同时不损伤局部组织，从而避免了可能干扰骨组织定植过程的炎症反应和伤口愈合反应。第三，IIA注射在非骨器官中几乎不引起转移性生长，从而防止动物因其他重要器官的转移而死亡，使得对惰性骨病变的持续监测成为可能。这些优势对于研究单个癌细胞发展为多细胞微转移灶的进展过程尤为有用，而这一过程在以往的研究中很大程度上难以捕捉。当结合前沿的生物成像技术和骨组织学方法时，IIA注射可广泛应用于与骨转移相关的各类研究。

引言

转移灶导致了90%以上实体瘤患者的死亡。骨是多种癌症类型转移最常见的受累器官，尤其是乳腺癌和前列腺癌。临床诊断时，骨转移通常已进入晚期阶段，表现为骨溶解性或骨形成性骨质改变，且常伴有神经系统症状。

既往研究主要集中于明显的溶骨性骨转移^1-3，然而目前对于溶骨过程发生前骨骼中的微转移灶仍了解有限。这至少部分归因于缺乏合适的实验模型和研究方法。乳腺癌基因工程小鼠模型常发生肺转移，但骨转移效率较低⁴。同样，原位移植的肿瘤很少自发形成骨转移，仅有少数嗜骨性的4T1乳腺癌亚克隆以及过表达MSP的PyMT转基因小鼠模型为例外^5-7。胫骨内钻孔可将癌细胞递送至骨骼^8-10，但该方法同时会造成局部组织损伤和炎症反应。目前，心内注射乳腺癌细胞系是研究骨定植的主要方法^11-13。然而，将癌细胞注入左心室后，仅有少量细胞最终到达骨骼和骨髓，因此难以以可量化的方式追踪微小转移灶。

在本研究中，我们建立了一种称为髂内动脉（IIA）注射¹⁴的技术，可将癌细胞选择性地递送至后肢组织，从而在不损伤局部组织的情况下，富集骨骼及骨髓中的癌细胞。由于该方法具有骨组织特异性，还可为惰性癌细胞提供足够时间，使其在动物因原发肿瘤或其他重要器官转移灶死亡前完成定植。当与多种其他技术（如生物发光成像、免疫荧光染色和骨组织形态计量学）联合使用时，IIA注射在骨转移相关研究中具有广泛的应用潜力，尤其适用于追踪单个癌细胞发展为多细胞微转移灶的进程。具体而言，我们证实IIA注射能够使我们可视化观察癌细胞与骨微环境中多种周围细胞之间的相互作用。

方案

所有动物实验均按照贝勒医学院的动物护理指南进行。

1. 细胞准备

注意：根据研究目的，可使用不同的癌细胞系进行IIA注射。在我们的研究中，已使用乳腺癌细胞系MCF7、4T1、4T07、MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-436以及前列腺癌细胞系C4-2。我们通常同时使用表达GFP和萤火虫荧光素酶的标记癌细胞进行研究，并在此展示来自GFP-荧光素酶标记的MCF7细胞系的部分数据。

1. 在含有10%胎牛血清和0.1 mg/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。
2. 在IIA注射前，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液消化80–90%汇合度的细胞。用预冷的PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于10 ml PBS中进行计数。通过在800 × g离心5分钟去除PBS。
3. 将细胞重悬于预冷的PBS中，浓度为5 × 10⁶ 个细胞/ml。
4. 每只小鼠IIA注射使用100 µl表达GFP和荧光素酶标记的癌细胞。
   注意：因此每只动物接受的细胞数量为5 × 10⁵。该数量可能需要根据细胞系的侵袭性进行调整。
5. 将细胞悬液置于冰上保存。
   注意：每隔几分钟可能需要轻微振荡以防止细胞聚集。对于某些细胞系（如MDA-MB-231），可能需要更严格的处理步骤（例如，通过45 µm细胞筛过滤）以防止聚集。请注意，血管堵塞可能导致组织坏死，从而干扰实验结果。

2. 动物准备

1. 对于动物疼痛管理，在手术前不少于24小时，以5 mg/kg/天的剂量将卡洛芬（或其他镇痛药）与膳食补充剂一起给予小鼠。手术前60分钟，皮下注射0.1 mg/ml的丁丙诺啡。注意：可选步骤是将雌二醇缓释 pellet 植入动物背部，以提供额外的雌二醇。这将加速ER+癌细胞（例如，MCF-7细胞）的生长⁹。
2. 通过腹腔注射给予4至6周龄小鼠（约20 g）氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（10–12.5 mg/ml）进行麻醉。
3. 通过夹捏脚趾并观察呼吸频率降低50%以及黏膜呈粉红色（例如，小鼠耳部皮肤和足部皮肤）来确认20 g小鼠达到适当的镇静水平。手术期间每15分钟持续监测这些生命体征。注意：动物无任何运动表明其已充分麻醉，可进行手术。
4. 在眼睛上使用兽用眼膏以防止干燥。
5. 剃除小鼠下腹部的毛发，特别是手术和注射将要进行的右侧腹股沟区域。
   注意：若使用裸鼠（athymic nude mice），此步骤非必需。
6. 将小鼠仰卧放置，将其腿部展开至自然位置，并用胶带将脚趾固定在可移动的解剖纸板上。
7. 用浸有70%异丙醇的无菌棉签擦拭右侧腹股沟区域，随后多次使用聚维酮碘外科洗手液进行清洁。

3. 髂总静脉和动脉的位置与分离

1. 在第4肋间做一长度为1.0 - 1.2 cm的皮肤切口^th 和 5^th 使用无菌的#10碳钢刀片（安装于3号刀柄）在右下腹部切开乳头。然后用无菌手术巾覆盖动物身体，仅暴露切口部位。
2. 将动物转移至标准台面解剖显微镜下。注射时使用4倍放大倍率。
3. 在解剖显微镜4倍放大倍数下，将钝性分离镊插入脂肪组织与腹膜之间，向两侧推开组织以暴露髂血管和神经（参见 图1).
   注意：位于中线主动脉与动脉分支下部之间的动脉称为髂总动脉，此处为注射部位。
4. 使用一对直头精细镊子，在靠近血管处，穿透血管与神经之间的结缔组织（类似膜状结构）。
5. 将直头精细镊子换至左手。用右手取一把弯头精细镊子。将右手的镊子插入之前已分离结缔组织的同一位置，然后将镊子从血管下方穿过。
6. 同时，将左手镊子插入血管左侧的结缔组织中，引导右手镊子穿过。
7. 当右手镊子到达血管下方时，尝试进一步将血管与周围组织分离，然后使其保持在右手镊子的上方。
8. 用左手镊子将4-0丝线缝合线的线端传递至右手镊子，然后轻柔缓慢地将缝线从血管下方穿过。注意：此时缝线已托起颈总静脉和颈总动脉（见 图2).

4. 注射与注射后护理

1. 使用31 G胰岛素注射器准备用于注射的细胞。每次注射使用100 µl PBS中的细胞悬液。务必反复吹打数次以充分分散细胞，避免细胞聚集，确保注射时细胞不会堵塞针头或阻断血流。
2. 用左手持斜角镊子，沿缝线引导将镊子置于血管下方，然后张开镊子两臂，使血管轻柔地固定在镊子上。
   注意：镊子两臂之间的间隙即为注射部位。
3. 右手持装有100 µl细胞悬液的31 G针头，针尖斜面朝上，准备进行注射。
4. 将针头插入动脉管腔内（血液会进入针尖），然后缓慢推注细胞悬液以完成注射。细胞悬液将推动血管内的红细胞向前移动。操作时应尽量避免损伤血管或导致细胞悬液外漏。
5. 注射完成后，轻柔地撤出针头，并继续用左手镊子夹住血管以防止出血，随后移除缝线。
6. 移开左手镊子，立即用棉签按压动脉切口部位以止血。
   注意：通常持续按压5–10分钟即可有效止血。
7. 止血后，使用皮肤胶闭合手术区域的皮肤切口边缘。进行耳标标记，并检测生物发光信号以评估注射细胞的分布情况。
   注意：成功的注射应获得与图3相似的成像结果。
   1. 通过眼眶静脉窦注射100 µl浓度为15 mg/ml的荧光素酶底物（luciferin）PBS溶液（剂量为75 mg/kg小鼠体重），检测生物发光信号。
      1. 进行眼眶静脉注射时，用手指轻压小鼠眼球两侧，施加压力使眼球轻微突出眼眶，将28 G胰岛素注射器针头插入眼球与鼻部之间的间隙，然后缓慢推动注射器注入荧光素酶底物。
         注意：当针头位置正确时，在触及硬组织（骨骼）前应能插入2–3 mm深度。
      2. 在注射后5分钟内将小鼠放入成像系统，进行in vivo整体动物成像，持续10–60秒（参见图3）。
         注意：可选步骤是在动物背部植入雌二醇缓释丸，以提供额外的雌二醇，促进ER+癌细胞（例如，MCF-7细胞）的生长¹⁵。
8. 将小鼠置于温热的加热垫上直至苏醒。术后密切观察出血、肿胀、切口裂开及疼痛等体征。将小鼠放回笼中，并给予镇痛支持（建议使用卡洛芬饮食补充剂）直至无疼痛表现。术后7天内需对动物进行密切监护和护理。

5. 监测转移性生长

1. 组织形态计量学：
   1. 取带瘤骨组织，用4%多聚甲醛固定24小时，然后在pH 7.0的14% EDTA溶液中脱钙3–5天，并按先前所述方法进行石蜡包埋¹⁴。
   2. 将石蜡包埋的骨组织切片至3 µm厚度，并按先前所述方法进行标准的苏木精/伊红染色¹⁴。
2. 免疫组织化学：
   1. 对携带肿瘤的石蜡包埋骨组织切片进行免疫组织化学染色，用于不同目的，操作步骤如前所述¹⁴。简言之，使用抗GFP抗体对MCF7癌细胞进行免疫染色，分别使用抗Osterix抗体和抗碱性磷酸酶（ALP）抗体对成骨细胞（前成骨细胞和成骨细胞）进行免疫染色。

结果

图1展示了髂总动脉（红色）与髂总静脉（蓝色）的解剖位置及其相互关系。

图2显示了在解剖显微镜下髂血管与神经的相对位置。如图2A所示，这些血管和神经位于腹膜壁正下方，在皮肤切开并推开腹膜后即可暴露。左侧为髂总静脉，相较于动脉更大且颜色更深；动脉位于中间，呈粉红色，虽比静脉细，但肌壁更厚。静脉与动脉彼此平行且紧密相连。更靠右侧的是白色的腰骶神经。图2B显示髂总血管已从周围结缔组织、肌肉和神经中分离出来，并用4-0丝线提起。图中同样标注了髂总静脉、动脉以及腰骶神经。

图3 显示代表性 体内 和 离体 经髂动脉注射后的动物生物发光成像。5...

讨论

尽管注射癌细胞的目标仅为髂动脉，但仍建议将双侧髂静脉和髂动脉均从周围组织中分离出来，并作为一束共同提起。这是因为静脉与动脉之间存在广泛的接触，且静脉管壁较薄，容易破裂。因此，尽管仅需向动脉内注射癌细胞，但将两条血管一同提起可为成功注射节省时间和精力。如图2所示，可使用4-0丝线缝合来辅助此操作。该缝合线还可用于在发生出血时帮助止血。

IIA注射的大部分步骤需要在解剖显微镜下进行。小鼠的血管柔软且细小，这使得操作具有挑战性。然而，经过充分练习后，据我们的经验，成功率可达90 - 100%。

利用该技术，研究人员可建立其感兴趣的癌细胞模型在骨组织中的定植模型，包括那些传统上被认为"非转移性"的细胞模型，MCF-7细胞即为一个典型例子。事实上，当MCF-7细胞到达骨微环境后，会经历短暂的休眠期，随后开始增殖并定植。在携带原位MCF-7异种移植瘤的动物中，极少能检测到自发性骨转移。然而，这种检测失败很可能源于播散性肿瘤细胞残留数量极少、定植启动缓慢，以及原位肿瘤更具侵袭性的生长（导致动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
青霉素/链霉素 两性霉素B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
胰蛋白酶/EDTA 溶液	HyClone	SH30042.01
45 μm 细胞筛	VWR International Laboratory	195-2545
含卡洛芬的 MediGel CPF	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		用于疼痛管理
丁丙诺啡	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		用于疼痛管理
雌二醇缓释丸	Innovative Research of America	SE-121
氯胺酮和赛拉嗪	贝勒医学院兽医护理部门管控物品
兽用软膏	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		防止眼睛干涩
剃毛器	Oster	78005-050	适用于有毛小鼠
异丙醇	ACROS	67-63-0
聚维酮碘外科洗手液	贝勒医学院兽医护理部门管控物品
#10 手术刀片	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	多个
3 号刀柄	Ted Pella, Inc	541-31	需高压灭菌
无菌手术巾	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
直头镊子	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	需高压灭菌
直头精细镊子	Fine Science Tools	11253-20	需高压灭菌
带齿精细镊子	Fine Science Tools	11253-25	需高压灭菌
4-0 Vicryl 丝线缝合线	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G 胰岛素注射器	BD	328418	多个
棉签（无菌）	VWR International Laboratory	89031-272
皮肤粘合剂	Henry Schein Animal Health	31477	用于手术部位皮肤闭合
耳标钳	Fine Science Tools	24220-00
耳标	Fine Science Tools	24220-50
D-荧光素	Gold Biotechnology	LUCK	避光并置于冰上
28 G 胰岛素注射器	BD	329410	用于眶内注射
多聚甲醛	Alfa Aesar	30525-89-4	用于组织固定
EDTA	OmniPur	4050	用于骨组织脱钙
名称	公司	目录编号	备注
设备
解剖显微镜	Leica	Leica S6E 立体显微镜
IVIS Lumina II 成像系统	Advanced Molecular Vision
名称	公司	目录编号	备注
抗体
抗-GFP 抗体 (JL-8)	Clontech	632381
抗-ALP 抗体	Abcam	ab108337
抗-Osterix 抗体	Abcam	ab22552