髂内动脉注射法用于高效选择性建立微小骨转移模型

摘要

本文提供了经髂内动脉（IIA）注射的详细操作步骤，该技术可将癌细胞特异性地递送至后肢组织（包括骨骼），以建立实验性骨转移模型。尽管该方法最初是针对乳腺肿瘤模型建立的，但本方案可轻松扩展应用于其他类型的癌症。

摘要

髂内动脉（IIA）注射是一种在动物体内建立多种癌细胞转移病灶的有效方法。与广泛使用的经心腔注射和经胫骨注射相比，IIA注射具有多项优势。首先，它可将大量癌细胞特异性地输送至后肢骨骼，从而实现时空同步的早期定植事件，便于对播散性肿瘤细胞进行可靠定量和快速检测。其次，IIA注射将癌细胞注入血液循环系统，而不损伤局部组织，从而避免了炎症反应和伤口愈合过程对骨定植过程的干扰。第三，IIA注射在非骨器官中几乎不引起转移性生长，可防止动物因其他重要器官的转移而死亡，从而实现对惰性骨病变的持续监测。这些优势对于研究单个癌细胞向多细胞微转移灶的进展过程尤为有用，而这一过程在过去一直难以观察。当结合前沿的生物成像技术和骨组织学方法时，IIA注射可广泛应用于与骨转移相关的各类研究。

引言

转移灶导致了超过90%的实体瘤患者死亡。骨骼是多种癌症类型转移最常见的器官，尤其是乳腺癌和前列腺癌。临床诊断时，骨转移通常已进入晚期阶段，表现为溶骨性或成骨性骨质改变，并常伴有神经系统症状。

既往研究主要集中在明显的溶骨性骨转移^1-3，然而目前对于溶骨过程发生前骨骼中的微转移灶仍缺乏深入了解。这至少部分归因于缺乏合适的实验模型和研究方法。乳腺癌基因工程小鼠模型常发生肺转移，但骨转移效率较低⁴。同样，原位移植的肿瘤很少自发形成骨转移，仅有少数嗜骨性的4T1乳腺癌亚克隆以及过表达MSP的PyMT转基因小鼠模型为例外^5-7。胫骨内钻孔可将癌细胞递送至骨骼^8-10，但该方法同时会造成局部组织损伤和炎症反应。目前，心内注射乳腺癌细胞系是研究骨定植的主要方法^11-13。然而，将癌细胞注入左心室后，仅有少量细胞最终到达骨骼和骨髓，因此难以以可量化的方式追踪微小转移灶。

本研究建立了一种称为髂内动脉（IIA）注射¹⁴的技术，可将癌细胞选择性地递送至后肢组织，从而在不损伤局部组织的情况下，使癌细胞在骨组织和骨髓中富集。由于该方法具有骨组织特异性，还可为惰性癌细胞的定植提供充足时间，使其在动物因原发性肿瘤或其他重要器官转移灶死亡之前完成定植过程。结合生物发光成像、免疫荧光染色和骨组织形态计量学....

方案

所有动物实验均按照贝勒医学院的动物护理指南进行。

1. 细胞准备

注意：根据研究目的，可使用不同的癌细胞系进行IIA注射。在我们的研究中，已使用乳腺癌细胞系MCF7、4T1、4T07、MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-436以及前列腺癌细胞系C4-2。我们通常同时使用表达GFP和萤火虫荧光素酶的标记癌细胞进行研究，并在此展示来自GFP-荧光素酶标记的MCF7细胞系的部分数据。

1. 在含有10%胎牛血清和0.1 mg/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。
2. 在IIA注射前，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液消化80–90%汇合度的细胞。用预冷的PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于10 ml PBS中进行计数。通过在800 × g离心5分钟去除PBS。
3. 将细胞重悬于预冷的PBS中，浓度为5 × 10⁶ 个细胞/ml。
4. 每只小鼠IIA注射使用100 µl表达GFP和荧光素酶标记的癌细胞。
   注意：因此每只动物接受的细胞数量为5 × 10⁵。该数量可能需要根据细胞系的侵袭性进行调整。
5. 将细胞悬液置于冰上保存。
   注意：每隔几分钟可能需要轻微振荡以防止细胞聚集。对于某些细胞系（如....

结果

图1展示了髂总动脉（红色）和髂总静脉（蓝色）的解剖位置及其相互关系。

图2显示了在解剖显微镜下髂血管与神经的相对位置。如图2A所示，这些血管和神经位于腹膜壁正下方，在皮肤切开并推开腹膜后即可暴露。左侧为髂总静脉，相较于动脉更大且颜色更深；动脉位于中间，呈粉红色，虽比静脉细，但肌层更厚。静脉与动脉彼此平行且紧密相连。更靠右侧的是白色的腰骶干神经。图2B显示髂总血管已从周围结缔组织、肌肉和神经中分离出来，并用4-0丝线提起。图中同样标示了髂总静脉、动脉以及腰骶干神经。

图3 显示代表性结果 体内 和 离体 经髂动脉注射后的动物生物发光.......

讨论

尽管注射癌细胞的靶血管仅为髂动脉，但我们建议将双侧髂静脉和髂动脉从周围组织中分离出来，并作为一束一同提起。这是因为静脉与动脉之间存在广泛的接触，且静脉管壁较薄，容易破裂。因此，尽管仅需向动脉内注射癌细胞，但将两根血管一同提起可为成功注射节省时间和操作难度。如图2所示，可使用4-0丝线缝合来辅助此操作。该缝合线也可在发生出血时帮助止血。

IIA注射的大部分步骤需要在解剖显微镜下进行。小鼠的血管柔软且细小，这使得操作具有挑战性。然而，经过充分练习后，据我们的经验，成功率可达90 - 100%。

利用该技术，研究人员可以建立其感兴趣的癌细胞模型的骨定植模型，包括那些传统上被认为"非转移性"的细胞模型，MCF-7细胞即为一个典型例子。事实上，当MCF-7细胞进入骨微环境后，会经历短暂的休眠期，随后开始增殖并定植。在携带原位MCF-7异种移植瘤的动物中，极少能检测到自发性骨转移。然而，这种检测失败很可能源于播散性肿瘤细胞残留数量极少、定植启动缓慢，以及原位肿瘤更具侵袭性的生长（导致动物在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
青霉素/链霉素 两性霉素B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
胰蛋白酶/EDTA 溶液	HyClone	SH30042.01
45 μm 细胞筛	VWR International Laboratory	195-2545
含卡洛芬的 MediGel CPF	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		用于疼痛管理
丁丙诺啡	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		用于疼痛管理
雌二醇缓释丸	Innovative Research of America	SE-121
氯胺酮和赛拉嗪	贝勒医学院兽医护理部门管控物品
兽用软膏	贝勒医学院兽医护理部门管控物品		防止眼睛干涩
剃毛器	Oster	78005-050	适用于有毛小鼠
异丙醇	ACROS	67-63-0
聚维酮碘外科洗手液	贝勒医学院兽医护理部门管控物品
#10 手术刀片	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	多个
3 号刀柄	Ted Pella, Inc	541-31	需高压灭菌
无菌手术巾	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
直头镊子	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	需高压灭菌
直头精细镊子	Fine Science Tools	11253-20	需高压灭菌
带齿精细镊子	Fine Science Tools	11253-25	需高压灭菌
4-0 Vicryl 丝线缝合线	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G 胰岛素注射器	BD	328418	多个
棉签（无菌）	VWR International Laboratory	89031-272
皮肤粘合剂	Henry Schein Animal Health	31477	用于手术部位皮肤闭合
耳标钳	Fine Science Tools	24220-00
耳标	Fine Science Tools	24220-50
D-荧光素	Gold Biotechnology	LUCK	避光并置于冰上
28 G 胰岛素注射器	BD	329410	用于眶内注射
多聚甲醛	Alfa Aesar	30525-89-4	用于组织固定
EDTA	OmniPur	4050	用于骨组织脱钙
名称	公司	目录编号	备注
设备
解剖显微镜	Leica	Leica S6E 立体显微镜
IVIS Lumina II 成像系统	Advanced Molecular Vision
名称	公司	目录编号	备注
抗体
抗-GFP 抗体 (JL-8)	Clontech	632381
抗-ALP 抗体	Abcam	ab108337
抗-Osterix 抗体	Abcam	ab22552