小鼠前列腺显微解剖与外科去势手术

摘要

本文描述了实验室小鼠前列腺显微解剖和手术去势的实验方案。我们还展示了由这些方案产生的代表性结果。最后，我们讨论了这些方案的优势和应用。

摘要

小鼠模型被广泛用于研究前列腺癌及其他疾病。小鼠是研究前列腺的优良模型，已被用作探索人类前列腺发育与疾病的替代模型。前列腺显微解剖技术可在无其他组织污染的情况下，对前列腺各叶的解剖结构、组织学特征及细胞特性进行一致性的研究。睾酮影响前列腺的发育与疾病进程。雄激素剥夺疗法是前列腺癌患者的常见治疗手段，但许多前列腺肿瘤会发展为去势抵抗性。对小鼠模型实施手术去势，可研究前列腺的去势抵抗性及其他激素生物学特征。该操作可与睾酮重新引入（即前列腺的激素再生）相结合，是研究前列腺中干细胞谱系的有力方法。前列腺显微解剖与手术去势相结合，为前列腺发育与疾病的稳健、一致性研究开辟了多种可能性。本文描述了实验室小鼠中前列腺显微解剖与手术去势的技术方案。

引言

前列腺是美国男性中最常见的癌症发生部位。每年约有22万名男性被诊断出患有前列腺癌，其中约27,000名男性将死于该疾病¹。在美国，男性一生中被诊断为前列腺癌的风险约为七分之一¹。良性前列腺增生（BPH）是一种与年龄相关的非癌性前列腺增大，也是一种普遍存在的疾病，影响超过80%的80岁以上男性²。因此，前列腺一直是大量研究的重点。

小鼠模型已被广泛用于前列腺疾病的研究³。总体而言，小鼠前列腺是人类前列腺的良好代表⁴，但小鼠与人类在前列腺的解剖结构和生理特性方面存在相似性和差异性⁵。在两个物种中，前列腺均位于膀胱底部，包绕尿道。人类前列腺为单一腺体，分为四个区域：中央区、移行区、外周区和前纤维肌性基质。相比之下，小鼠前列腺由围绕尿道分布的三对叶组成：前叶、腹叶和背外侧叶。在细胞水平上，主要区别在于人类基底细胞与腔面细胞的比例约为1:1，而小鼠中该比例为1:4⁶。小鼠间质与人类也有所不同——人类具有更发达的平滑肌组织，而小鼠前列腺的肌层则明显更薄。正确识别、分离和处理小鼠前列腺对于开展小鼠前列腺研究至关重要。

激素水平显著影响人类和小鼠前列腺的发育与稳态。尽管雌激素似乎在前列腺发育中发挥作用⁷，但前列腺中最重要的激素是睾酮。睾酮对腺体的发育和维持至关重要。无论是通过物理还是化学手段去势后，成年前列腺中约90%的腔面细胞会发生凋亡，腺体随之萎缩。如果在去势条件下重新引入睾酮，前列腺能够自我再生至完全功能状态。睾酮似乎也驱动前列腺癌的发展，因此雄激素剥夺疗法是一种常用的治疗策略。然而，许多前列腺癌会发展为对雄激素剥夺产生耐药性。此外，接受雄激素剥夺治疗的前列腺癌患者会经历反复的去势与再生循环。在小鼠模型中，手术去势结合重新给予睾酮以实现前列腺的激素性再生，是研究去势抵抗性以及睾酮循环对前列腺影响的重要工具。

本文将讨论并演示如何准确定位并显微解剖小鼠前列腺，以及如何对小鼠进行手术去势的正确操作技术。

方案

本方案符合并遵循约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会制定的指南。

1. 小鼠前列腺的显微解剖

1. 根据机构动物护理和使用指南，采用二氧化碳窒息法或其他经批准的方法处死小鼠。
2. 将小鼠仰卧固定在解剖板上，用大头针穿过四只脚掌进行固定。
3. 用70%乙醇喷洒腹部。
4. 用镊子夹住下腹部皮肤，使用剪刀在阴茎开口前方约1 cm处剪开皮肤和腹膜，注意不要损伤任何器官。
5. 从下腹部开始，沿腹部两侧向上剥离皮肤和腹膜至肋骨区域，暴露腹膜腔。
6. 辨认膀胱和泌尿生殖道，并通过轻轻移开脂肪和其他器官将其暴露出来。
7. 用镊子夹住靠近尿道基部的输精管，并将其撕离。
8. 对另一侧输精管重复此操作。
9. 用镊子小心夹住膀胱并向上提起，同时用剪刀在膀胱下方及腹侧前列腺以下（约在膀胱基部下方1 cm处）剪断尿道。
   注意：当膀胱被提起时，整个泌尿生殖道（包含膀胱、一段尿道、所有前列腺叶以及精囊）将随之被拉出，过程中可能会有一定阻力。
10. 将泌尿生殖道（UGT）放入盛有约5–10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的60–100 mm培养皿中。
11. 在解剖显微镜下进行后续操作。双手各持一把精细镊子。将镊子"像握笔一样"握住，并将前臂 rested 在实验台面上以保持稳定。
12. 使用精细镊子调整UGT的位置，使膀胱位于上方，尿道朝下，精囊位于膀胱两侧。
13. 用一把镊子夹住尿道，另一把镊子小心剥离脂肪组织，避免撕裂任何前列腺组织。注意：脂肪组织相对于周围组织呈现"发亮"的外观。
14. 去除脂肪后，用镊子撕开前列腺两个腹叶之间的结缔组织，将其分开。
15. 要分离其中一个腹叶，用一把镊子夹住该腹叶的尖端附近，另一把镊子尽可能靠近尿道处夹住其基部。在保持夹住叶基的同时，用另一把镊子夹住尿道，然后以稳定、平滑的动作将该叶从尿道上撕下。确保无前列腺组织残留在尿道上。根据下一步实验要求，将分离的叶放入相应的介质中：
    1. 如需进行组织学分析的固定和石蜡包埋，将组织放入10%中性缓冲福尔马林（NBF）⁸中。
    2. 如需冷冻保存和切片，将组织放入OCT等冷冻包埋介质中⁸。
    3. 如需进行单细胞分离用于培养或流式细胞术，将组织放入冷PBS中⁹。
16. 对另一个腹叶重复步骤1.15。
17. 要分离其中一个前叶，用镊子轻轻将该叶从精囊上拉开，注意不要刺破精囊。一旦该叶与精囊完全分离，按照步骤1.15中去除腹叶的方式将其移除。
18. 对另一个前叶重复步骤1.17。
19. 将剩余的泌尿生殖道翻转，使背侧前列腺可见。
20. 要分离其中一个背外侧叶，用镊子撕开两个背外侧叶之间的结缔组织，以及叶与精囊后部之间的结缔组织。以类似于步骤1.15中去除腹叶的方式移除该叶。
21. 对另一个背外侧叶重复步骤1.20。

2. 外科阉割

注意：本实验为存活手术，因此无菌操作、麻醉和疼痛管理对于本方案的伦理性和成功实施至关重要。须遵守所有机构动物护理和使用指南。手术过程中应使用外部热源（如循环水毯）以防止低体温。  动物未恢复足够意识以维持胸卧位时，不得无人看管。动物手术后未完全恢复前，不得将其放回其他动物中。所有手术器械在使用前须经高压灭菌。

1. 在清洁无菌的台面上，使用适当方法麻醉小鼠（例如 吸入2%异氟烷），并将小鼠置于仰卧位。注意：可根据批准的动物实验方案，采用其他麻醉方法（如氯胺酮）。
2. 通过轻捏脚趾检查小鼠的反射反应。若无反应，进入下一步；若有反应，等待1–3分钟后再检查。使用电动剃刀剃除手术区域的毛发。
3. 采用70%乙醇与碘伏交替擦拭的方式，或根据机构兽医人员或实验动物护理与使用委员会（IACUC）推荐的程序，对小鼠腹部进行无菌准备。
4. 使用无菌手术刀，在下腹部正中距阴茎约1.5 cm的前方，沿中线做一道长约1 cm的垂直皮肤切口。
5. 在腹膜上做一小切口（<1 cm），注意避免损伤任何器官。
6. 使用无菌镊子夹住腹膜切口边缘，轻轻提起，以便观察其下方的腹腔。
7. 用另一把无菌镊子伸入腹腔，夹住位于膀胱侧方的左侧或右侧睾周脂肪垫。将脂肪垫经腹膜和皮肤切口拉出，直至睾丸随之脱出。此步骤中需小心，避免损伤其他组织或器官。
8. 使用电灼笔切断固定睾丸的脂肪垫。再用电灼笔缓慢切断睾丸动脉。注意：若切断睾丸动脉过快，可能导致大量出血，需对小鼠实施安乐死。
9. 切断脂肪垫和动脉后，移除睾丸及脂肪垫。
10. 对另一侧睾丸重复步骤2.6–2.9。 注意：另一种睾丸切除方法为手术结扎睾丸动脉，随后用剪刀剪断血管。
11. 使用可吸收缝线缝合腹膜。
12. 使用外科伤口钉合器闭合皮肤。
13. 给予镇痛药以控制疼痛，并将小鼠置于清洁笼盒中，在笼盒加热器上保温5–10分钟。密切观察小鼠是否有疼痛或出血迹象。

结果

通过前列腺显微解剖术从小鼠体内分离出全部六个前列腺叶（图1）。完整的泌尿生殖道（UGT）由所有前列腺叶、膀胱、精囊和尿道组成（图1a）。输精管连接于尿道，但在前列腺显微解剖过程中并非必需，因此可在移除UGT前通过切断尿道将其分离（图1b-1c）。泌尿生殖道在从腹腔取出后仍保持完整结构（图1d）。此时，UGT表面仍覆盖有脂肪组织，需将其清除以暴露前列腺叶（图1e）。在膀胱基底部围绕尿道可见全部六个前列腺叶（腹侧、前侧和背外侧成对分布）。随后可按照上述方案分离出纯净的前列腺组织（图1f）。这些前列腺叶可置于适当的培养基中以供后续分析。

阉割是指切除作为睾酮主要产生器官的睾丸。在小鼠中，睾酮的存在会持续到实施阉割为止，此时前列腺会发生退化（图...

讨论

前列腺显微解剖技术可实现小鼠前列腺叶特异性的实验与分析（图1）。在基因工程小鼠模型中，某些表型可能仅出现在某一前列腺叶中，而在其他叶中未见。此外，对于组织学分析，本方案可确保获得最大量的纯前列腺组织进行切片与染色，避免切片中混杂其他泌尿生殖道组织。最后，在单细胞实验中，该方案可实现近乎纯化的前列腺细胞的分离。上皮细胞富集试剂盒可进一步将前列腺上皮细胞与间质细胞分离纯化。显微解剖的局限性在于需要使用解剖显微镜，以及操作者需经过一定学习曲线，掌握在显微镜下使用精细镊子的技术。 alternatively，前列腺组织也可作为泌尿生殖道整体（UGT）的一部分直接进行组织学切片，从而无需显微解剖。然而，对整个UGT进行切片的缺点是切片中会包含其他组织，导致组织纯度降低。此外，在制备单个前列腺细胞群体时，必须将前列腺各叶从UGT中分离，以避免细胞污染。

手术去势是许多前列腺研究实验室的基础手术，对于研究睾酮对前列腺发育和疾病的影响至关重要。（图3）该方案操作快速（经验丰富的操作者通常约需5分钟），并能几乎完全清除循环中的睾酮。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术器械	Roboz	Various
甲醛	Sigma	F8775
OCT包埋剂	VWR	25608-930	必须置于干冰上冷冻，并储存在-80 °C
PBS	Life Technologies	10010
异氟烷	约翰·霍普金斯大学		也可从在线供应商处获得
电凝笔	Medline	ESCT002
丝线缝合线	AD Surgical	M-S330R19
外科伤口夹	Roboz	RS-9265