小鼠冠状动脉内皮细胞的分离

摘要

本方案旨在分享我们分离小鼠冠状动脉内皮细胞的方法，以便进行成像或分子生物学实验。

摘要

内皮细胞衬在血管内壁，对血管张力、血管通透性以及新生血管形成具有重要的调节作用。内皮细胞功能障碍与包括缺血性心脏病在内的多种心血管疾病的发生和发展密切相关。为了研究冠状动脉内皮细胞的功能与特性，首先需要进行细胞分离，并且要求获得高纯度和足够数量的细胞，以开展后续实验。本方案描述了一种高效分离成年小鼠冠状动脉内皮细胞的方法。将小鼠心脏解剖后剪切成小块，使用dispase和胶原酶II消化心脏组织，收集细胞并洗涤 ，随后与连接有抗CD31抗体的磁珠共同孵育。结合了内皮细胞的磁珠经多次洗涤后即可用于多种实验应用，包括成像和分子生物学实验。该方法可高效地从每颗心脏获得约10⁴个细胞，纯度超过90%。

引言

多种心血管疾病和代谢性疾病的鼠类模型具有与患者相似的生理和分子变化。此外，对小鼠进行遗传改造是一种强大的工具，可帮助我们研究特定基因在疾病发生和发展过程中的致病作用。如今，许多实验室能够轻松构建细胞类型特异性的基因敲入或敲除小鼠，而检测特定细胞类型中 mRNA 和蛋白水平是确定小鼠是否真正实现遗传修饰的第一步。

内皮是一层由内皮细胞（ECs）构成的单层薄膜，衬于血管内壁。内皮细胞在调节血管张力、血管通透性以及新生血管形成中发挥关键作用^1,2。内皮功能障碍是多种病理状态的标志，内皮功能的改变可导致多种心血管疾病^3,4。因此，研究内皮细胞在生理和病理生理条件下的功能具有重要意义。

分离内皮细胞（ECs）有多种方法^5-8，且分离方法需根据所用组织和物种进行优化。这是因为不同组织来源的内皮细胞在表面标志物和蛋白表达方面具有高度异质性⁹。内皮细胞的成功分离往往具有挑战性，需要一定程度的训练和实践经验。一旦掌握，本方案中提出的分离方法具有良好的稳定性和高效性。

本方法的总体目标是获得高质量和高数量的小鼠冠状动脉内皮细胞（MCECs）。尽管从单个心脏中收集到的细胞数量少于使用其他技术从其他组织中获得的细胞，但该技术仍能提供更高质量的细胞。最终细胞群体中内皮细胞的纯度超过90%。因此，该技术非常....

方案

对小鼠的研究已获得亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南进行。

注意：第1、2和3部分应在实验前一天完成，作为准备工作。

1. 溶液的配制

1. CD31 缓冲液（50 ml）
   1. 将 50 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）加入 50 ml 离心管中。称取 0.05 g 牛血清白蛋白（BSA）和 0.037 g 乙二胺四乙酸（EDTA），加入该 50 ml 离心管中，将管子置于旋转仪上旋转约 1 小时，直至粉末完全溶解。调节 pH 至 7.4，经 0.2 µm 滤膜过滤至新的 50 ml 离心管中，4 ˚C 保存备用。
2. 含 HEPES 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）（500 ml）
   1. 称取 1.1915 g HEPES，加入 HBSS 溶液中以配制 10 mM HEPES 溶液 ，充分混匀。测定 pH 值并调节至 7.4。过滤后于 4 ˚C 保存。
3. 1× Kreb's 溶液（1 L）
   1. 将 100 ml 10× Kreb's 溶液 [表 1] 加入 1 L 三角烧瓶中的双蒸水中。称取 2.1 g 碳酸氢钠和 2 g D-葡萄糖，加入烧瓶中。混匀后定容至 1 L。
   2. ....

结果

从小鼠心脏成功分离冠状动脉内皮细胞通常可获得约10⁴个细胞，纯度超过90%，细胞呈鹅卵石状。为获得纯的内皮细胞群体，在整个实验方案中需格外注意确保无菌环境，避免任何污染。若细胞群体中出现拉长或增大的细胞，提示可能存在其他细胞类型的污染，如平滑肌细胞和成纤维细胞。通过使用内皮细胞表面标志物BS-Lectin和acLDL对细胞进行染色，来检测内皮细胞的纯度（图1）。在小鼠冠状动脉内皮细胞（MCEC）中，同时呈现两种染色阳性的细胞比例超过90%。该结果表明实验技术操作成功。

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PBS (10x) (1 L)
材料	MW	质量 (g)

讨论

在研究中应用最广泛的内皮细胞是人脐静脉内皮细胞（HUVECs），因其取材方便且易于培养。然而，许多研究需要通过分离其他特定器官中的内皮细胞来建立更接近生理状态的模型¹⁰。内皮细胞在心脏组织中仅占极小比例，其分离与培养具有较大难度。

本方案中有三个关键步骤。第一步是充分灌注以清除血液。此步骤十分必要，因为血液中的白细胞也表达CD31作为细胞表面标志物，会与内皮细胞竞争CD31抗体的结合，此外血液中可能还存在其他内皮细胞，因此灌注对于防止此类细胞污染至关重要。第二个关键步骤是在整个分离过程中保持无菌环境。任何污染都会导致所获得的细胞数量显著减少。最后，第三个关键步骤是调整CD31缓冲液的pH值，若未正确调整，将降低细胞分离的效率。

在分离过程中，细胞质量最为重要。在培养基中加入适量肝素可抑制平滑肌细胞的生长。通过在培养基中添加D-缬氨酸可减缓成纤维细胞的增殖。内皮细胞可通过摄取Dil-AcLDL并结合BS-凝集素共染色进行鉴定，以检测细胞群体的纯度。内皮细胞表型不稳定，一旦从原始组织中分离并进行培养，其行为可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Sigma	A3311-10G
EDTA	Fisher	BP120-500
HBSS	Fisher	SH3026801
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034-500G
碳酸氢钠	Sigma	S5761
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
DynaBeads pan小鼠IgG磁珠	Thermo Fisher Scientific	11035
大鼠抗小鼠CD31抗体	BD Biosciences	550274
IFCS	Fisher	SH30072.04
M199	Fisher	MT10060-CV
中性蛋白酶（Dispase）	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS02109
II型胶原酶	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS004176
甘油	Fisher	BP381-1
Igepal	Sigma	I3021-50 ml
磷酸酶抑制剂混合物	Sigma	P0044-1ml
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340-1 ml
肝素	Sigma	H3149-100KU
FBS	Fisher/Mediatech	MT35010CV
D-缬氨酸	Sigma	V1255-5G
EGS	Corning	356006
青霉素/链霉素	Fisher/Mediatech	MT-30-002-CI