本方案旨在分享我们分离小鼠冠状动脉内皮细胞的方法，以便进行成像或分子生物学实验。
本文内容
摘要
摘要
内皮细胞衬在血管内壁，对血管张力、血管通透性以及新生血管形成具有重要的调节作用。内皮细胞功能障碍与包括缺血性心脏病在内的多种心血管疾病的发生和发展密切相关。为了研究冠状动脉内皮细胞的功能与特性，首先需要进行细胞分离，并且要求获得高纯度和足够数量的细胞，以开展后续实验。本方案描述了一种高效分离成年小鼠冠状动脉内皮细胞的方法。将小鼠心脏解剖后剪切成小块，使用dispase和胶原酶II消化心脏组织，收集细胞并洗涤 ，随后与连接有抗CD31抗体的磁珠共同孵育。结合了内皮细胞的磁珠经多次洗涤后即可用于多种实验应用，包括成像和分子生物学实验。该方法可高效地从每颗心脏获得约104个细胞，纯度超过90%。
引言
多种心血管疾病和代谢性疾病的鼠类模型具有与患者相似的生理和分子变化。此外，对小鼠进行遗传改造是一种强大的工具，可帮助我们研究特定基因在疾病发生和发展过程中的致病作用。如今，许多实验室能够轻松构建细胞类型特异性的基因敲入或敲除小鼠，而检测特定细胞类型中 mRNA 和蛋白水平是确定小鼠是否真正实现遗传修饰的第一步。
内皮是一层由内皮细胞（ECs）构成的单层薄膜，衬于血管内壁。内皮细胞在调节血管张力、血管通透性以及新生血管形成中发挥关键作用1,2。内皮功能障碍是多种病理状态的标志，内皮功能的改变可导致多种心血管疾病3,4。因此，研究内皮细胞在生理和病理生理条件下的功能具有重要意义。
分离内皮细胞（ECs）有多种方法5-8，且分离方法需根据所用组织和物种进行优化。这是因为不同组织来源的内皮细胞在表面标志物和蛋白表达方面具有高度异质性9。内皮细胞的成功分离往往具有挑战性，需要一定程度的训练和实践经验。一旦掌握，本方案中提出的分离方法具有良好的稳定性和高效性。
本方法的总体目标是获得高质量和高数量的小鼠冠状动脉内皮细胞（MCECs）。尽管从单个心脏中收集到的细胞数量少于使用其他技术从其他组织中获得的细胞，但该技术仍能提供更高质量的细胞。最终细胞群体中内皮细胞的纯度超过90%。因此，该技术非常适合依赖高纯度分离内皮细胞的应用，例如细胞成像。
方案
对小鼠的研究已获得亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南进行。
注意：第1、2和3部分应在实验前一天完成，作为准备工作。
1. 溶液的配制
- CD31 缓冲液（50 ml）
- 将 50 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）加入 50 ml 离心管中。称取 0.05 g 牛血清白蛋白（BSA）和 0.037 g 乙二胺四乙酸（EDTA），加入该 50 ml 离心管中，将管子置于旋转仪上旋转约 1 小时，直至粉末完全溶解。调节 pH 至 7.4，经 0.2 µm 滤膜过滤至新的 50 ml 离心管中，4 ˚C 保存备用。
- 含 HEPES 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）（500 ml）
- 称取 1.1915 g HEPES，加入 HBSS 溶液中以配制 10 mM HEPES 溶液 ，充分混匀。测定 pH 值并调节至 7.4。过滤后于 4 ˚C 保存。
- 1× Kreb's 溶液（1 L）
- 将 100 ml 10× Kreb's 溶液 [表 1] 加入 1 L 三角烧瓶中的双蒸水中。称取 2.1 g 碳酸氢钠和 2 g D-葡萄糖，加入烧瓶中。混匀后定容至 1 L。
- 用 95% O2/5% CO2 混合气体向溶液中通气 30 分钟，并在生物安全柜内过滤溶液。4 ˚C 保存，实验期间保持冰上放置。
2. 准备磁珠
- 向每个 1.5 ml 离心管中加入 1 ml CD31 缓冲液（每份样品对应一管）。混匀羊抗大鼠 IgG 磁珠，并根据每份样品加入适量磁珠 [表 1]。剧烈振荡离心管 30 次，然后将离心管置于磁力架上静置 1 分钟 以进行沉降。在磁力架上打开管盖，将上清液倒入废液桶中。
- 向每根离心管中加入 1 ml CD31 缓冲液。向每根离心管中加入 2 µl 大鼠抗小鼠 CD31 抗体，并在 4 ºC 下旋转孵育过夜。
3. 高压灭菌
- 将所有手术器械和移液器吸头进行高压灭菌。将移液器吸头的末端剪裁，制备出四种不同直径的吸头，从最宽到最窄依次为约 3 mm、2.5 mm、2 mm 和 1.5 mm。在实验前一天完成吸头的剪裁，并在 121 ºC 温度下高压灭菌 30 分钟。
注意：第 4 至 11 步应在 实验当天进行。
4. 溶液的配制
- 配制含2%铁强化小牛血清（IFCS）的M199洗涤缓冲液。用于成像时，每只小鼠准备 30 ml。
- 配制酶溶液（每份样品10 ml）。 称取Dispase至终浓度0.6单位/ml，以及II型胶原酶至终浓度1 mg/ml，加入50 ml离心管中。加入M199培养基，在4 ºC旋转孵育15分钟。 在超净台内经0.2 µm滤器过滤至新的50 ml离心管中，4 ˚C保存备用。
- 配制含肝素的HBSS/HEPES溶液。 在15 ml离心管中加入10 ml含10 mM HEPES的HBSS，再加入100 μl肝素，混匀后4 ˚C保存备用。
5. 洗涤磁珠
- 从4 ºC旋转器中取出含有磁珠的离心管，转移至超净台。将离心管置于磁力架上，振荡1分钟。弃去上清液，向每根离心管中加入1 ml CD31缓冲液。
- 将离心管从磁力架上取下，剧烈振荡30次。再将离心管放回磁力架，重复此步骤，共洗涤3次。洗涤完成后，将离心管放回4˚C，继续旋转保存直至使用。
6. 解剖
- 以 0.1 ml 肝素对小鼠进行腹腔注射，以防止血液凝固。等待 10 分钟后，使用 0.01 ml 戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠。通过捏压小鼠足部检查其是否仍有痛觉反应。
- 将小鼠头朝上固定于聚苯乙烯板上，并用针固定四肢。使用镊子和剪刀从胸部上部沿至喉部剪开皮肤。
- 在膈肌上方的胸骨中央处做一切口，向两侧及喉部方向剪开肋骨，形成三角形切口以暴露心脏和肺。在膈肌上方剪断主动脉。
- 用镊子夹住胸腺但不牵拉，用剪刀小心剪断周围结缔组织，完整取出心脏和肺。将组织置于含 1× Krebs 液的烧杯中，用镊子轻轻晃动清洗，随后转移至含 1× Krebs 液的 6 cm 培养皿中。
- 使用剪刀和镊子分离肺叶。将一根无菌 20 G 导管插入主动脉，用 HBSS/肝素溶液冲洗冠状循环系统中的血液。在心室处做一小切口，轻轻晃动心脏以充分冲洗，然后将其转移至含有 M199 培养基的样品管中。将样品管置于冰上保存。
7. 组织消化
- 将心脏转移至含有10 ml酶溶液的6 cm培养皿中，用剪刀将其剪成小块。将培养皿置于37 ºC培养箱中孵育15分钟。用剪去末端的枪头反复吹打消化后的材料30次，使组织更易通过。
- 放回37 ºC培养箱中继续孵育15分钟。重复振荡三次，每次均使用移液器吸头，从最大孔径到最小孔径依次进行 每次孵育间隔15分钟。
- 最后一次15分钟孵育后，将样品取出并移至超净台中。使用孔径最小的移液枪头，将溶液上下吹打30次，并通过40 µm细胞滤筛转移至新的50 ml离心管中。
- 用10 ml洗涤缓冲液冲洗培养皿，使用 使用10 ml移液管转移至细胞滤筛中。将50 ml离心管放入离心机，在室温下以400 g离心10分钟。
8. 磁珠的洗涤与偶联
- 去除上清液时勿扰动沉淀。用5 ml洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
- 取一支先前准备好的含珠子的1.5 ml离心管，每次操作一支。将一支1.5 ml离心管放入磁力架中，轻轻振荡3次后打开管盖。
- 最后一次离心后，尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀。通过剧烈弹击离心管使细胞团块充分分散。
- 向50 ml离心管中加入1 ml洗涤缓冲液，用1 ml移液器混匀细胞。将1.5 ml离心管中的溶液弃去，从50 ml离心管中取1 ml细胞悬液加入珠子中。弹击离心管30次，然后在4 ºC旋转孵育30分钟。
9. 细胞培养/成像的准备工作
- 准备用于接种细胞的培养室。加入凝胶溶液（5% w/v，300 µl）至培养室孔中，以包被表面，并在37 ºC孵育30分钟。孵育后，移除凝胶并干燥表面。
- 旋转30分钟后取出含有珠子/细胞的离心管，放入生物安全柜内的磁力架上。振荡2分钟，弃液后加入1 ml洗涤缓冲液。
- 将离心管从磁力架上取出，剧烈振荡30次，然后弹动30次。再放回磁力架上，振荡1分钟。重复此步骤4次，共完成5次洗涤，每次在磁力架上的振荡时间为1分钟。
- 最后一次洗涤后，取出一根离心管，每次处理一根。振荡30次，然后弹动30次。将其置于磁力架上，振荡1分钟。弃液后加入1 ml 20% IFCS EC培养基（预热至37 ºC）。
- 剧烈振荡30次，然后弹动30次。将移液器调整至500 µl，上下吹打10次。将500 µl悬液转移至每个培养室中。
- 置于37 ºC培养箱中过夜。次日，用含10% FBS的EC培养基洗涤细胞。
10. 准备 Western Blot（WB）样品
- 旋转1小时后取出含有珠子/细胞的离心管，置于磁力板上并振荡2分钟。弃去上清液，加入1 ml冰冷的HBSS。剧烈振荡30次，然后弹甩30次。重复此步骤两次，共洗涤3次，但每次在磁力板上的振荡时间改为1分钟。
- 最后一次洗涤后，将离心管放在磁力板上并振荡1分钟。用移液器吸除缓冲液，并采用先前所述方法11,12对细胞进行裂解以用于WB检测。收集的裂解液通常含有约30 µg蛋白质。
11. 成像
- 用培养基将细胞洗涤3次，每个孔最终体积为250 µl。向细胞中加入1.5 µl Dil-acLDL。从此步骤开始，将细胞置于避光环境中。
- 在37 ˚C孵育3.5小时。加入1.5 µl Hoechst，充分混匀后在37 ˚C继续孵育30分钟。用PBS洗涤细胞，随后在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。
- 用PBS洗涤两次，再在室温下用5% BSA-PBS封闭30分钟。接着用1% BSA-PBS洗涤两次。用1% BSA-PBS将BS-lectin-FITC稀释至浓度为2 µg/ml，并向每个孔中加入300 µl。
- 将培养板置于室温下的水平摇床上孵育30分钟。用PBS洗涤3次。
- 在荧光显微镜下观察细胞，FITC（凝集素染色，内皮细胞标志物，激发/发射波长488 nm/519 nm）曝光时间为200毫秒，DAPI（Hoechst，细胞核染色，激发/发射波长358 nm/461 nm）曝光时间为30毫秒，TRITC（acLDL染色，内皮细胞标志物，激发/发射波长557 nm/576 nm）曝光时间为300毫秒。使用20倍物镜采集图像。
结果
从小鼠心脏成功分离冠状动脉内皮细胞通常可获得约104个细胞，纯度超过90%，细胞呈鹅卵石状。为获得纯的内皮细胞群体，在整个实验方案中需格外注意确保无菌环境，避免任何污染。若细胞群体中出现拉长或增大的细胞，提示可能存在其他细胞类型的污染，如平滑肌细胞和成纤维细胞。通过使用内皮细胞表面标志物BS-Lectin和acLDL对细胞进行染色，来检测内皮细胞的纯度（图1）。在小鼠冠状动脉内皮细胞（MCEC）中，同时呈现两种染色阳性的细胞比例超过90%。该结果表明实验技术操作成功。
| PBS (10x) (1 L) | |||
| 材料 | MW | 质量 (g) | |
| NaCl | 58.44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na2HPO4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH2PO4 | 136.08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| 材料 | MW | 浓度 (mM) | 质量 (g) |
| NaCl | 58.44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl2•2H2O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO4•7H2O | 246.5 | 1.2 | 2.96 |
| NaH2PO4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EC 培养基 (20%) (500 ml) | |||
| 材料 | 体积/质量 | ||
| M199 | 444.5 ml | ||
| 10 - 20 U/ml 肝素 | 500 µl | ||
| D-缬氨酸 | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| 青霉素/链霉素 | 5 ml | ||
| 单只小鼠实验所需磁珠用量 | |||
| 用于成像 | 5 µl | ||
| 用于 WB/PCR | 10 µl | ||
表1. 所用溶液的化学成分。
图 1. 小鼠冠状动脉内皮细胞（MCEC）的代表性图像。 荧光图像显示，从小鼠心脏分离的小鼠冠状动脉内皮细胞（MCEC）具有较高的内皮细胞群体纯度。通过红色的乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）摄取（A）和绿色的凝集素染色（B）检测MCEC的纯度。细胞核经Hoechst染色呈蓝色（C）。在MCEC中，同时呈现两种颜色的阳性细胞比例超过90%。标尺代表20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在研究中应用最广泛的内皮细胞是人脐静脉内皮细胞（HUVECs），因其取材方便且易于培养。然而，许多研究需要通过分离其他特定器官中的内皮细胞来建立更接近生理状态的模型10。内皮细胞在心脏组织中仅占极小比例，其分离与培养具有较大难度。
本方案中有三个关键步骤。第一步是充分灌注以清除血液。此步骤十分必要，因为血液中的白细胞也表达CD31作为细胞表面标志物，会与内皮细胞竞争CD31抗体的结合，此外血液中可能还存在其他内皮细胞，因此灌注对于防止此类细胞污染至关重要。第二个关键步骤是在整个分离过程中保持无菌环境。任何污染都会导致所获得的细胞数量显著减少。最后，第三个关键步骤是调整CD31缓冲液的pH值，若未正确调整，将降低细胞分离的效率。
在分离过程中，细胞质量最为重要。在培养基中加入适量肝素可抑制平滑肌细胞的生长。通过在培养基中添加D-缬氨酸可减缓成纤维细胞的增殖。内皮细胞可通过摄取Dil-AcLDL并结合BS-凝集素共染色进行鉴定，以检测细胞群体的纯度。内皮细胞表型不稳定，一旦从原始组织中分离并进行培养，其行为可能迅速发生变化。该技术的一个局限性在于，为确保细胞仍保持其表型，培养超过5天后不应再使用。强烈建议不要对细胞进行传代。原代细胞将提供稳定可靠 的结果。
总体而言，该技术可获得数量充足且纯度极高的细胞。在具备相应操作技能的情况下，分离过程可在6小时内完成。该方法是获取小鼠冠状动脉内皮细胞用于细胞培养或分子生物学实验的优良手段。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助（HL115578，授予 A. Makino）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan小鼠IgG磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| 大鼠抗小鼠CD31抗体 | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| 中性蛋白酶（Dispase） | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| 甘油 | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | P0044-1ml | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340-1 ml | |
| 肝素 | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-缬氨酸 | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
参考文献
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