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高速多色结构光照明显微镜在全内反射荧光成像中的应用指南

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DOI：

10.3791/53988

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2016年5月30日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

本文内容

摘要

本文提供了用于组装和操作结构化照明显微镜（采用全内反射荧光照明，TIRF-SIM）的详细指南，以实现多色光学超分辨率成像，用于观察动态生物过程。

摘要

采用结构光照明显微镜（SIM）的光学超分辨率成像技术是化学与生物医学科学中用于可视化分子水平过程的关键技术。尽管市面上已有商用SIM系统，但实验室自主设计的定制化系统在成像保真度和速度方面通常可超越商用系统——后者通常侧重于易用性和通用应用。本文提供了一套详尽的指南，用于构建一种采用全内反射（TIR）照明的SIM系统，该系统可在三种荧光通道下以高达10 Hz的帧率进行成像，分辨率达到100 nm。由于结合了SIM与TIRF技术，该系统相比其他竞争技术可提供更优的图像对比度。为实现上述性能指标，系统采用了多种光学元件，以实现对所有可用激发波长的照明光偏振态和空间结构的自动化控制。文中详细阐述了硬件实现与控制方法，重点在于实现激发光图案生成、波长切换、偏振态调控与相机控制之间的精确同步，以最大限度提升图像采集帧率。本文还提供了系统准直与校准的逐步操作方案，并在理想测试样品上验证了可实现的分辨率提升效果。最后，通过活细胞实验展示了该系统实现视频速率超分辨率成像的能力。

引言

在过去的五年中，超分辨率显微技术日趋成熟，并已从专业的光学实验室逐步普及至生物学家手中。目前，针对实现光学超分辨率的三种主要技术——单分子定位显微技术（SMLM）、受激辐射损耗显微技术（STED）和结构光照明显微技术（SIM）——均已推出商用显微镜解决方案。1,2单分子定位显微镜（SMLM），例如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM），已成为最受欢迎的技术，主要得益于其光学装置的简便性以及实现高达20 nm空间分辨率的潜力。然而，超分辨率显微镜 通过 单分子定位存在一种内在的权衡：可达到的空间分辨率依赖于积累足够数量的单个荧光分子定位事件，因而限制了时间分辨率。因此，在活细胞中对动态过程进行成像变得困难，因为必须充分采样目标结构的运动以避免运动伪影，同时又需在该时间内获取足够的定位事件以重建图像。为了满足这些要求，活细胞单分子定位显微成像（SMLM）实验通过大幅提高激发光功率来获得所需的荧光分子光开关速率提升，但这反过来会导致光毒性和氧化应激，从而限制样本的存活时间及其生物学相关性3.

相较于SIM和SMLM，STED的一个显著优势在于其能够在较厚的样品中实现超分辨率成像，例如在深度达120 µm的脑片组织切片中实现了约60 nm的横向分辨率4。使用SMLM或SIM的单物镜系统在如此深度进行成像是不可行的，但通过单分子光片显微镜或晶格光片显微镜则可实现5。STED还已实现视频速率成像，并被用于绘制突触囊泡的运动轨迹，尽管目前仍局限于小视场的成像6。

在需要对多个时间点进行高时间分辨率成像的细胞生物学和分子自组装反应7-12应用中，结构光照明显微镜（SIM）尤为适用，因其成像不依赖于特定荧光探针的光物理特性。尽管SIM具有这一固有优势，但迄今为止其应用主要局限于固定细胞或缓慢动态过程的成像。这主要是由于现有商用SIM系统的局限性所致：这些仪器的图像采集帧率受限于用于生成所需正弦照明图案的光栅旋转速度以及偏振保持光学元件的性能。新一代商用SIM仪器虽已具备快速成像能力，但其价格极为昂贵，仅大型核心成像设施才可负担。

本方案提供了一种用于成像薄样品及活细胞基底表面附近快速过程的灵活SIM系统的构建指南。该系统采用全内反射荧光（TIRF）技术生成照明图案，其光穿透深度不超过约150 nm13 这极大地降低了离焦背景信号。将SIM与TIRF结合的想法几乎与SIM本身一样古老。14 但在2006年之前未在实验中实现15第一步 体内 2009年报道了利用TIRF-SIM获得的图像16 实现11 Hz的帧率以观察微管蛋白和驱动蛋白的动力学，已有研究报道了双色TIRF-SIM系统17,18最近，有研究提出了一种单色双光束SIM系统的构建与使用指南，其帧率可达每秒18帧。19,20.

本文介绍的系统能够在三种颜色下以20 Hz实现SIM超分辨率成像，其中两种颜色可进行TIRF-SIM操作。整个系统基于倒置显微镜框架构建，配备电动xy平移台和压电驱动的z轴载物台。为了生成TIRF-SIM所需的正弦激发图案，该系统采用铁电型空间光调制器（SLM）。在SLM上显示二进制光栅图案，其产生的±1级衍射光经滤波、中继后聚焦至物镜的全内反射（TIR）环上。通过改变SLM上显示的图像，实现光栅的相位移动和旋转。本方案详细描述了此类激发光路的搭建与准直方法、发射光路的准直步骤，并提供了用于确保最佳准直状态的测试样品。此外，还阐述了在高速TIRF-SIM中与偏振控制和组件同步相关的特定问题与挑战。

设计考虑因素与限制条件

在组装本方案中介绍的TIRF-SIM系统之前，需考虑若干决定光学元件选择的设计约束。所有光学元件的缩写均参照图1。

空间光调制器（SLM）

本实验装置中采用二元铁电空间光调制器（SLM），因其能够实现亚毫秒级的图案切换。虽然也可使用灰度向列相SLM，但其切换速度显著降低。在二元相位SLM中，每个开启或关闭的像素将分别为入射平面波前引入π或0的相位偏移，因此若在SLM上显示周期性光栅图案，则其将作为相位衍射光栅工作。

全内反射（TIR）

为了实现全内反射并产生渐逝场，激发光束在玻璃-样品界面的入射角必须大于临界角 figure-introduction-1这决定了所需的最小入射角，从而也确定了隐逝照明图案的最大间距（即周期）。最大入射角 figure-introduction-2 （接受角）受限于物镜的数值孔径（NA），该值可根据定义计算得出 figure-introduction-3这决定了根据阿贝公式可实现的最小图案间距 figure-introduction-4 连接NA与波长 figure-introduction-5 最小图案间距 figure-introduction-6. 实际上，数值孔径为1.49的油浸TIRF物镜产生的入射角最大约为 79° 样品上使用488 nm激发波长时的最小图案周期为164 nm。这两个角度定义了物镜后焦面上的一个环形区域，在该区域内仪器可实现全内反射（TIR）照明。即TIR环）中，两个激发焦点必须被精确定位并精确旋转，以生成每种照明模式。

TIRF-SIM 图像的重建需要每个图案旋转至少采集三个相位移动，因此 SLM 图案周期必须能被 3 整除（参见 图1）。例如，488 nm 照明对应的周期为 9 个像素，640 nm 照明对应的周期为 12 个像素。有关 SLM 图案设计的全面讨论，包括利用剪切光栅对图案间距进行亚像素优化的方法，可参见 Kner 之前的研究所述。 等16 和 Lu-Walther 等20 两个激发焦点的位置必须位于所有波长的全内反射环内，然而衍射角的 ±1 级衍射光的波长依赖性决定了来自空间光调制器（SLM）的衍射效率。对于标准结构光照明显微镜（SIM），多色成像可通过针对最长波长优化光栅周期来实现，而对较短波长通道的性能下降则在可接受范围内。然而，在全内反射荧光结构光照明显微镜（TIRF-SIM）中，针对某一波长进行优化意味着另一波长的焦点将不再位于全内反射（TIR）环内。例如，当使用9像素的光栅周期时，488 nm波长的焦点位于物镜后焦面直径的95%处，处于TIR环内，足以实现TIRF激发；但对于640 nm波长，相同的周期会导致焦点移出后焦面光阑。因此，必须针对每种激发波长采用不同的像素图案间距。

TIRF-SIM 激光激发光路的准直对显微镜主体中二向色镜（DM4，见图 1）位置的微小变化极为敏感，其敏感程度远高于传统SIM。不建议使用旋转滤光片转轮，而应采用一个固定位置的多波段二向色镜，并专门针对所用的激发波长进行设计。必须使用最高质量的二向色镜，这类镜片需要至少3 mm厚的基底，制造商通常将其标称为“成像平面”（imaging flat）。所有其他类型的基底都会在TIRF-SIM中引起不可接受的像差和图像质量下降。

偏振控制

为实现TIRF-SIM，必须使激发光的偏振态与照明图案同步旋转，从而相对于光轴在物镜瞳平面内始终保持方位角偏振。即. s偏振)。偏振控制光学元件的准直将取决于所使用的具体光学元件，例如Pockels盒21，或置于电动旋转台中的半波片22. 在本方案中，使用了一种定制的液晶可变延迟器（LCVR），设计用于提供全波（2π在488至640 nm波长范围内，可采用液晶相位延迟器实现快速（约毫秒级）切换。若使用液晶相位延迟器，必须选用高质量元件：标准元件通常在相机曝光时间内无法保持稳定的相位延迟，导致照明图案模糊及调制对比度降低。此外，液晶相位延迟器对温度高度敏感，需具备内置温度控制功能。

同步化

激光器必须与空间光调制器（SLM）同步。二进制铁电型 SLM 通过在开启状态和关闭状态之间切换实现内部平衡。像素仅在其开启或关闭状态时起到半波片的作用，而在帧间切换期间则不具备此功能。因此，应仅在 SLM 的 LED Enable 信号指示的开启/关闭状态下才启动激光器，以避免因像素处于中间状态而导致图案对比度下降。如果激光器无法进行数字调制，也可使用声光调制器（AOM）作为快速快门替代。

镜头的选择

根据这些约束条件，可以确定将空间光调制器（SLM）平面按所需照明模式投影到样品平面所需的缩小倍率。这使得能够计算成像中继望远镜中的两片透镜L3和L4以及激发聚光镜L5的焦距。在本系统中，使用100倍、数值孔径1.49的油浸物镜，激发波长为488 nm和640 nm，因此L4和L3的焦距分别为300 mm和140 mm，L5的焦距为300 mm，总缩小倍率为357倍，相当于在样品平面上SLM像素尺寸为38 nm。使用该组合透镜时，SLM上用于488 nm照明的光栅周期为9像素，用于640 nm的为12像素，在样品上产生的图案间距分别为172 nm和229 nm，对应的入射角分别为70°和67°。对于玻璃-水界面，临界角为61°，且与波长无关，因此这两种图案间距均可实现两种波长的全内反射荧光（TIRF）激发。配备校正环的物镜可用于校正由盖玻片厚度变化或在37 °C下操作时引入的球面像差。

图像重建

获取原始SIM数据后，通过计算可在两步过程中生成超分辨率图像。首先，必须确定每幅图像的照明图案；其次，需将SIM频谱的各个组分进行分离并适当重组，以使有效光学传递函数（OTF）的支持范围加倍（见图6，插图）。

精确了解投射照明模式至关重要，因为必须尽可能准确地分离出超分辨频率分量，以避免因重叠分量的残余部分导致的伪影。我们确定照明模式的参数 事后 根据 Gustafsson 介绍的方法，从原始图像数据中 等.23 简而言之，需为每个二维正弦波的归一化描述确定一组相应的照明参数 figure-introduction-7 激发模式 figure-introduction-8:

figure-introduction-9

其中，figure-introduction-10 和 figure-introduction-11 分别描述了每幅独立图像 m 的条纹对比度和图案起始相位。波矢的分量 figure-introduction-12 和 figure-introduction-13 仅随图案取向 figure-introduction-14 的不同而变化，其余情况下可视为恒定。为粗略确定波矢的分量，需对原始图像频谱进行互相关运算，并通过对互相关图像之一施加亚像素位移以优化重叠度，从而进一步精修结果。该过程通过乘以实空间相位梯度 figure-introduction-15 实现，该梯度可在频域中引入亚像素位移。需要注意的是，在实际进行图案估计之前，获得波矢的合理初值估计非常有益，可通过成像荧光微珠层来实现此估计。

移相图案间的相位步长为 figure-introduction-16, 即. figure-introduction-17，可以通过沿频率分量的傅里叶变换实现分离 "相位轴"全局相位 figure-introduction-18 以及条纹对比度 figure-introduction-19 然后可通过不同组分的复数线性回归来确定。各个分离的组分随后使用广义维纳滤波器进行合并。关于参数提取及广义维纳滤波器实现的详细描述，我们建议读者参考 Gustafsson 等23 使用相同算法的位置。

方案

1. 激发光路的布置与准直

  1. 在光学平台上标记各组件的位置（参见图1以了解光学装置的总体布局）。将物镜、透镜L3、L4、L5以及空间光调制器（SLM）彼此之间的距离设置为各自焦距之和，以确保SLM表面被中继成像到物镜的焦平面上。
  2. 将多边带二向色镜DM4插入显微镜框架的滤光片转轮中。
  3. 将第二个二向色镜DM3插入一个1"方形运动镜架中，并将其置于距聚光透镜L5一个焦距的位置。
    注意：该激发光路设计采用了两个相同的二向色镜DM3和DM4，它们来自同一批次生产，以确保具有相同的光学特性。二向色镜（DM4）的安装方式应使其s轴和p轴相对于显微镜内的二向色镜（DM3）互换，从而抵消由其双折射引入的任何偏振椭圆性（图1）。这种补偿对每个激发波长均有效。此步骤对于维持高调制对比度至关重要。
  4. 在将任何透镜插入激发光路之前，需精确定义系统的光轴。
    1. 从转轮上取下物镜（OB），并旋入一个对准工具。该工具由一个500 mm长的光学笼式系统组成，两端各有一个对准盘。
    2. 使用二向色镜DM3和一个临时对准镜（位于SLM大致位置处）引导来自激光器1的准直参考光束，使其穿过两个对准盘中心的孔。如图1所示，利用三面反射镜和二向色镜DM2，将激光器1的光束引导至临时对准镜。位于SLM位置的临时对准镜必须接近垂直于光轴。
      注意：使用激光器1作为参考光束，因为一旦激发光路就位，其他激光器可随后进行对准。
    3. 在粗略确定光轴后，移除对准工具。在光束进入显微镜本体前的光路中插入一个光阑，并将其与光束中心对齐。在光阑上附一张带小孔的白卡纸，小孔位于光阑中心。重新插入物镜（OB）。
      注意：此时从物镜出射的光束将高度发散，但物镜后表面会产生非常微弱的反射光，可在白卡纸上观察到。所有透镜（即使具有抗反射涂层）都会产生微弱的后向反射，可用于确保同轴对准。如果光束恰好垂直于透镜，则后向反射将穿过光阑中心。
    4. 反复调节两个反射镜（DM3和位于SLM位置的对准镜），使后向反射光点与入射光束在白卡纸上重合。暂时移除物镜（OB），并在天花板上标记激光光斑位置，以建立参考点。
    5. 沿平台螺纹孔在参考光束高度处安装一对光阑。光束应与光学平台表面平行。此时光轴已定义完成。
  5. 将聚光透镜（L5）大致置于距物镜一个焦距的位置。将该透镜安装在一个线性平移台上，使其沿参考光束方向移动。
  6. 调节聚光透镜的位置和角度，使从物镜出射的光束准直并击中天花板上的参考光斑。通过再次使用光阑和白卡检查后向反射，确认透镜与光束垂直。移除物镜（OB），插入成像中继望远镜的第二个透镜（L4）。
    注意：当光路中的透镜数量为偶数时，更容易实现光束的正确准直和无偏转。
  7. 使用线性平移台调节该透镜的位置和角度，以保持光束准直，并确保参考光束仍击中天花板上的标记点。
  8. 重新插入物镜（OB），并插入望远镜的第一个透镜（L3）。调节该透镜的位置和角度，确保光束准直且无偏转，方法如前所述。
  9. 将SLM芯片安装在万向架上，该支架可在不产生平移的情况下绕芯片表面中心旋转。
    注意：具体的安装设计取决于所使用的SLM型号。若SLM未附带支架，应将其固定在定制加工的铝板上，再将铝板连接至透镜万向架。
  10. 在透镜对准完成后，用SLM替换对准镜。调节SLM的位置，使参考光束位于SLM芯片中心；调节其角度，使光束穿过两个中继透镜（L3和L4）。检查参考光束是否仍击中天花板上的标记点中心。
  11. 使用开普勒式扩束器扩展并准直参考光束。
    1. 将两个透镜（L1和L2）安装在笼式系统中，以便于调节。
    2. 通过移除透镜并代之以光阑，将笼式系统与参考光束对准。
    3. 插入两个透镜，并调节L2的轴向位置，使用剪切干涉仪使扩束后的光束准直。L2应距SLM表面一个焦距。
    4. 检查扩束后的光束在经过两个中继透镜L3和L4后是否仍保持准直。在DM3后方不远处使用剪切干涉仪检查准直状态。
  12. 当激发光路已针对单一波长完成对准后，将另外两个激光器耦合进光路。利用光束合束二向色镜（DM1和DM2），引导每束光通过两个位于激发光路中心的光阑。

2. 偏振旋转器的对准

  1. 将液晶可变相位延迟器（LCVR）安装，使其快轴与入射偏振方向成45°角。
  2. 通过在交叉偏振器之间插入消色差半波片（HWP）和LCVR，使用HWP微调入射到LCVR的光束偏振角度。旋转HWP以最小化透射光功率。
    注意：为了使液晶相位延迟器（LCVR）充当可变偏振旋转器，其快轴必须精确对准入射垂直偏振光方向的45°角。LCVR在物理上已安装为45°，但这仅为粗略对准。使用HWP可确保入射偏振方向相对于LCVR快轴实现精确的45°对准。四分之一波片（QWP）将LCVR引起的倾斜椭圆偏振重新转换为线性偏振，其偏振角度由施加的电压控制24。
  3. 在LCVR后插入QWP，并旋转QWP，使其慢轴与入射偏振方向对齐，方法是在交叉偏振器之间最小化透射光功率。

3. 发射光路的校准

  1. 使用载物台测微尺玻片和透射光粗略定位相机。
    1. 通过显微镜目镜对准分划板并聚焦，并将物镜固定在此位置。
    2. 大致居中相机，并移动相机位置，通过观察屏幕上的图像使分划板成像清晰。
      注意：若使用外部滤光轮，则滤光立方体中不含发射滤光片，因此在激光开启时不得使用目镜观察。
  2. 使用荧光微珠样品精细调节相机位置。
    1. 通过在1.5号盖玻片上铺展一滴100 nm多色荧光微珠液滴制备单层微珠样品。静置干燥以使微珠吸附于盖玻片表面，随后重新浸入水中。
    2. 将微珠样品置于物镜下并加入浸油。精细调节相机位置，使荧光微珠层处于焦点位置。一旦找到焦点，不得再调整物镜位置。
      注意：由于空间光调制器（SLM）必须位于与样品平面共轭的平面上，因此SLM、中继透镜和物镜的位置必须固定。如需调节焦点，应使用压电Z轴载物台轴向移动样品，而非移动物镜。
  3. 生成适当的SIM二值光栅图案作为位图文件。
    1. 对于2D/TIRF-SIM，生成一系列9个二值光栅图像：3种图案取向，每种包含3个等间距相位偏移。可通过数值方法（例如使用MATLAB）从施加相位偏移的旋转二维正弦波生成，然后进行阈值化处理以产生二值图像。示例代码参见补充代码文件。
    2. 为校准目的，还需为每种取向（如0°、60°、120°）生成经小圆形孔径窗口化的光栅图案，如图2所示。窗口化校准光栅无需外部触发，用户可通过SLM软件手动切换。
      注意：有关最优旋转角度及光栅图案生成代码的讨论，请参见参考文献16,20。
  4. 使用制造商提供的软件（例如MetroCon）将位图图像上传至SLM。
    1. 加载SLM控制软件，点击"Connect"。
    2. 在"Repertoire"选项卡中，点击"Load"以打开程序文件，并检查文件中包含的运行序列（Running Orders）数量。示例程序文件中包含五个运行序列。
    3. 点击"Send to Board"将程序文件上传至SLM。
    4. 等待位图图像上传完成，设备自动重启。
      注意：示例程序文件包含光栅位图图像及定义顺序的文件，作为补充代码文件提供。".repz"文件可使用ZIP压缩文件解压软件打开。
  5. 在SLM上显示第一种取向（例如0°）的窗口化校准光栅。
    1. 在SLM控制软件中，选择"Status"选项卡，输入运行序列编号（在示例文件中为运行序列"1"）。
    2. 点击"Select"将运行序列切换至校准光栅。
      注意：这将在样品平面上照亮一个较小的圆形区域。若SLM表面正确共轭于样品平面，则该区域边缘将清晰聚焦。光栅图案将在L3透镜焦点处产生多个衍射级次：来自SLM反射背板的零级反射、对应于光栅的-1和+1级次，以及由SLM器件内部结构（e.g. SLM像素内部布线的反射及像素边缘不规则性）引起的较弱高阶衍射级次。除-1和+1级次外，其余所有级次必须被滤除。
  6. 在L3焦点位置的光路中插入安装于x,y平移台上的空间掩模（SM），并相对于光轴调节其位置，仅允许所需的一级衍射光通过。在空间滤波器后方，仅可见两个圆形光斑。
    注意：空间掩模通过针头在铝箔上穿刺6个孔制成。孔径应足够大，以允许所有激光波长的一级衍射光通过。关于空间掩模的详细分析见参考文献20。
  7. 显示下一取向的校准光栅（60°，运行序列2），再次确保仅一级衍射光通过空间掩模，必要时调节其位置。
  8. 对最后一个取向（120°，运行序列3）重复上述步骤。
  9. 检查相机上荧光微珠层的图像。若两个圆形光斑未如图2所示重叠，则通过迭代调节物镜和相机位置来重新定位样品平面。
  10. 调节物镜位置使两束光重叠，此时图像将失焦；重新调节相机位置使图像恢复聚焦，并在仍可见两个圆斑时微调物镜。重复此过程，直至两束光完全重叠并形成一个清晰的圆形区域。
  11. 一旦样品平面位置确定，保持物镜位置固定不变。
  12. 为确认TIRF照明效果，成像荧光染料溶液，例如在488 nm激发波长下使用10 µM罗丹明6G溶液。
    1. 将染料样品调至焦点。若两束光以正确的TIRF角度入射，则可观察到单个分子且背景信号较低，同时圆形孔径边缘清晰聚焦。对齐与未对齐的TIRF光束示例见图2B-D。
    2. 依次显示各取向的窗口化光栅，确保三种取向均实现TIRF照明，且两束光在样品平面重叠。可通过调节二向色镜DM3来微调光束位置。
      注意：尽管由于轴向色差，不同波长的光聚焦位置略有差异，但这并非关键问题，可在使用第二波长激发前通过对样品位置施加恒定的z轴偏移进行校正。

4. 系统同步与校准

  1. 将微珠单层样品置于物镜上并调至焦点。
  2. 使用空间光调制器（SLM）的控制软件，依次显示第一种图案取向（0°）对应的3个相移图像。
    1. 使用SLM控制软件，切换到示例图库中的运行顺序4（Running Order 4）。
    2. 使用相机采集软件（例如HCImage）配置相机，使其在全局曝光期间输出两个信号：一个正向TTL触发信号和一个负向TTL触发信号。在相机软件中，进入"高级相机属性"，将输出触发类型1和2设置为"曝光"，输出触发极性1和2分别设置为"正向"和"负向"。
    3. 使用同轴电缆将相机的输出1和输出2分别连接至SLM的"触发"和"完成"输入端口。此时SLM已与相机同步。
  3. 采集一组3幅图像。
    1. 在"序列"面板中，选择"硬盘记录"作为扫描类型，并将帧数设置为3。
    2. 点击"开始"以采集3帧图像。每次曝光时，SLM图案将发生变化。图像中的荧光微珠在3幅图像之间会呈现明暗闪烁现象。闪烁程度反映了正弦照明图案的调制对比度。
  4. 使用自定义软件通过液晶可变相位延迟器（LCVR）调节激发激光的偏振方向，以实现方位角偏振，从而为当前图案取向获得最高的调制对比度。
    1. 加载LCVR校准软件。
    2. 分别输入最小电压为0、最大电压为8。
    3. 点击"扫描LCVR电压"以旋转偏振方向。
      注：LCVR的延迟量是温度的函数，即使在温度控制条件下，其值也可能逐日漂移。在此步骤中，通过在最小和最大电压之间扫描施加电压，经验性地确定最佳方位角偏振，该过程相当于旋转照射到样品上的偏振方向。对每个电压下的调制对比度进行计算25，并选用获得峰值对比度的电压用于后续步骤。
    4. 等待校准过程完成，并记录测得的电压值。
  5. 对剩余的两个图案取向（60°和120°）以及各激发波长重复此校准过程。
  6. 将相机曝光与LCVR、激光器、发射滤光片轮和压电z轴平台同步26。为此，使用高速数据采集（DAQ）板作为系统的主时钟源，并利用SLM的LED使能输出信号调制激光器（参见图3B）。
    注：具体实现方式取决于所用组件，但建议使用高速DAQ板进行数字触发同步，并通过软件控制的模拟电压调节LCVR。本方案中使用的控制软件可根据请求获取。
  7. 由于存在轴向色差，针对每个波长还需对样品台施加z轴偏移。
    1. 通过实验确定该偏移量：首先在多色微珠单层样品上使用第一个波长（例如 488 nm）调焦，然后切换至第二个波长（例如 640 nm），此时微珠将失焦。
    2. 重新对微珠调焦，并测量所需的z轴位置变化量。此后每次更换激发波长时，均可将该偏移量应用于压电z轴平台。
  8. 使用SLM控制软件，将SLM运行顺序切换至TIRF-SIM所需的全部9幅二值光栅图像序列。此即示例图库中的运行顺序0（Running Order 0）。
  9. 使用相机控制软件，采集微珠样品的9幅图像。
    1. 在相机软件的"序列"面板中，选择"硬盘记录"作为扫描类型，并将帧数更改为9。
    2. 点击"开始"以采集图像。
    3. 在"保存缓冲图像"窗口中选择图像类型为"TIFF"，点击确定，将采集的图像保存为TIFF文件。
  10. 使用商业或自定义软件，基于原始TIFF图像重建超分辨率图像，以验证其相对于标准TIRF的分辨率提升。
    注：对于本研究中的显微镜系统，我们使用了由本实验室及Shao Lin博士开发的自定义重建代码27。

结果

使用多色100 nm直径荧光微球成像，以比较标准TIRF与TIRF-SIM，并量化横向分辨率可达到的提升程度图 4A-B）。根据文献中所述的标准算法，将原始帧重建为超分辨率图像27,28可以看出，与TIRF相比，TIRF-SIM的横向分辨率明显显著提高。显微镜的点扩散函数（PSF）可通过成像单个亚衍射尺寸的荧光微珠来近似表示，因此可通过针对每个波长对单个微珠拟合二维高斯函数来量化PSF和分辨率。根据半高全宽（FWHM）平均值估算的显微镜分辨率，在488 nm和640 nm TIRF-SIM下分别为89 nm和116 nm（图4C）。这相比理论衍射极限情况，在两个波长下均实现了两倍的横向分辨率提升。荧光标记的淀粉样纤维也是展示分辨率倍增效果的优良测试样品。图 4D）。淀粉样纤维形成 体外 通过孵育 β用10%罗丹明衍生物染料（488 nm激发）标记淀粉样蛋白1周，随后通过全内反射荧光显微镜-结构光照明显微镜（TIRF-SIM）成像。参见参考文献12 如需更多信息。

具有高对比度的亚细胞结构，例如标记了 emGFP 的微管（图 5B、G）或 LifeAct-GFP（图 5D），非常适合用于 TIRF-SIM 成像，可获得高对比度的超分辨率图像。采用本方案中详述的装置进行 TIRF-SIM 成像，能够观察到位于细胞基底皮层附近的微管亚群，并可随时间推移观察微管的聚合与解聚过程（动态图 1）。并非所有样品都适用于 TIRF-SIM 成像，尤其是缺乏明确结构的低对比度样品。表达胞质 GFP 的细胞仅在质膜边缘提供高分辨率信息（图 5F、H 及 动态图 2），因此对于 TIRF-SIM 成像而言并非理想样品，因其重建结果本质上是叠加了伪影的 TIRF 图像。在这类样品中，对比度的提升通常归因于重建算法中的去卷积步骤。

高调制对比度对于成功的SIM成像至关重要。重建图像的傅里叶变换可以可视化SIM的光学传递函数（OTF）（图6A，插图）。若未通过偏振旋转器确保方位角偏振以最大化每个方向上的调制对比度，则样品中高频信息的调制将非常微弱，导致SIM通带中的信噪比降低。采用标准维纳滤波方法的重建算法将直接放大SIM通带中的噪声，最终得到的图像本质上仅是一幅叠加了六边形（或“蜂窝状”）振铃伪影的标准TIRF图像（图6A，右图）。一种可能的改进方法是根据样品类型，采用迭代29,30或盲源重建算法31,32以减少这些伪影。我们建议使用ImageJ插件SIMcheck，在重建前后对SIM数据质量进行评估33。

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图1：多色全内反射结构光照明显微镜（TIRF-SIM）系统的布局。 TIRF-SIM 显微镜由三个主要部分组成：光束生成单元、图案投射单元和检测单元。在光束生成单元中，三种不同的激光器通过二向色镜（DM1 和 DM2）被合束至同一光路，并经由四个光学元件进行偏振控制。首先，一个偏振片（P）确保每束激光的线性偏振态的纯净性。随后的三个光学元件用于快速、自动地旋转偏振方向，具体细节在正文中详述。之后，两片透镜（L1 和 L2）以望远镜结构扩展光束，使其匹配空间光调制器（SLM）的有源表面，并由 SLM 投射的二值光栅图案将光束衍射为三束子光束（示例见图中1-9格）。照明光相对于 SLM 图案的偏振态以箭头表示。第二组望远镜（L3 和 L4）缩小图案，并提供对 SLM 图案傅里叶平面的访问。在此平面处，使用空间掩模（SM）滤除来自 SLM 像素结构及其内部布线的中心成分和其他不需要的衍射成分。在剩余两束光被聚光透镜（L5）聚焦到物镜（OB）的后焦平面之前，系统中加入了两个二向色镜（DM3 和 DM4）。DM4 在荧光显微镜中起常规二向色镜的作用，用于分离激发光与发射光。然而，该镜片不可避免地会使激发光的偏振态产生椭圆性，这一效应可通过 DM3 进行补偿；DM3 是一个与 DM4 理想情况下同一批次的二向色镜。油浸全内反射物镜具有足够大的数值孔径（NA），可直接在盖玻片上激发两束反向传播的光波，这些光波被完全反射，从而在盖玻片上产生结构化的衰逝场。样品安装在 x-y-z 三维平移台上。检测通过同一物镜和 DM4 以透射方式完成，并通过安装在计算机控制滤光轮（EFW）中的带通发射滤光片进一步过滤。最后，图像由显微镜内部的管镜（L6）投射到 sCMOS 相机上。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：重叠光束的对准。 (A使用圆形孔径对 SLM 光栅图案进行窗口化处理有助于对准。若在相机上观察到两个不重叠的光束（左），则需通过迭代调节物镜和相机的轴向位置，重新调整样品平面的位置，直至形成单一的圆形照明光斑（右）。为产生 TIRF-SIM 所需的正弦激发图案，两束光必须完全重叠；若光束未完全重叠，则会减小干涉图案形成的视场范围。B 和 C) 激光束的入射角度对于TIRF-SIM至关重要。如果角度不正确，其中一束光将无法达到TIRF所需的角度，这一点在成像荧光染料溶液时很容易观察到。一束光的入射角大于临界角，从而形成圆形光斑；而另一束光则未达到临界角，导致图像左侧出现一条明亮的条纹（B). (D调整反射镜 DM3 的角度可确保两束光以相同的角度入射，可通过离焦物镜来验证：若对准正确，两束光 xz 投影的 z 荧光染料样品的成像堆栈应在焦点处显示两条对称相交的光束，且背景信号可忽略不计。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：不同系统组件的同步依赖关系。（A）为实现快速SIM成像，必须采用基于硬件的方案对系统各组件进行同步。（B）应使用数据采集卡（DAQ）作为主触发源。DAQ板卡发出的TTL信号被发送至sCMOS相机的外部输入端口，用于触发相机曝光。随后，相机的全局曝光输出信号触发空间光调制器（SLM）显示光栅图案，而SLM的LED使能输出信号则用于对激光激发进行数字调制，确保激光仅在SLM像素处于“开启”状态时发射。曝光完成后，相机的全局曝光输出信号用于将SLM图案切换至下一个光栅相位或角度。DAQ板卡还向液晶可变相位延迟器（LCVR）控制器输出模拟电压，以控制照明光束的线性偏振状态。该电压在完成每个图案角度下3个相位图像的采集后切换。在单波长下完成9幅图像采集后，DAQ板卡向发射滤光轮控制器输出信号，切换至下一个波长。DAQ板卡还通过向z轴压电控制器输出模拟电压，对样品施加z方向偏移。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：100 nm 多色荧光微球和荧光标记淀粉样纤维测试样品的全内反射结构光照明显微成像。（A 和 B）488 nm 与 640 nm 激发下，标准全内反射荧光显微（TIRF）与 TIRF-SIM 重建图像的比较。（C）对 TIRF-SIM 微球进行高斯拟合后得到的半高全宽（FWHM）直方图，显示预期的分辨率提升。（D）用10%罗丹明衍生物染料标记的β-淀粉样纤维在488 nm激发下的TIRF与TIRF-SIM成像对比。比例尺 = 1 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

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图5：活细胞TIRF-SIM成像。 HEK293细胞中微管（emGFP-微管蛋白）的常规TIRF与TIRF-SIM图像对比（A、B），COS-7细胞中丝状肌动蛋白（LifeAct-GFP）的对比（C、D），以及HEK293细胞中胞质GFP的对比（E、F）。B和F中的图像来自视频的单帧时间点。方框区域在（G、H）中放大显示。比例尺 = 3 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图6：偏振旋转器对重建微珠图像的影响。（A）若未使用LCVR等偏振旋转器，SIM通带中的信噪比偏低，导致重建的SIM图像中出现特征性的六边形伪影（右图）；（B）在2D-SIM中，结构照明显微的条纹图案在原始图像的傅里叶变换中可直接观察到（左图，激发空间频率已标出），因为它们位于发射光学传递函数（OTF）支持范围的半径之内；然而在TIRF-SIM中，这些图案位于OTF支持范围之外，因此不可见（右图）。在此情况下，必须按照本实验方案所述，使用稀疏的单层微珠来评估条纹调制对比度。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：基于空间光调制器的图案生成可实现其他成像模式，例如多焦点SIM。（A）在多焦点SIM（MSIM）中，空间光调制器（SLM）上显示的方形点阵（插图）在像平面上产生衍射极限焦点阵列。通过成像低浓度罗丹明6G的薄层以可视化这些焦点。该图案在样品上进行平移（B），采集的原始图像z堆栈经重建后生成一幅离焦光减少的图像（C）。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

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动画图1：HEK293细胞中emGFP-微管蛋白的时间序列视频。 利用TIRF-SIM可观察到emGFP标记的微管快速发生聚合与解聚。每帧原始图像的曝光时间为50毫秒（每帧SIM图像为450毫秒），采集时间间隔为0.5秒。所用曝光时间受限于荧光染料的亮度，而非相机或SLM的速度。请点击此处观看该视频。

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动画图 2：HEK293 细胞中胞质 GFP 的时间序列影片。 类似本例中对比度较低的样本并不适合作为 TIRF-SIM 成像的理想样本。在 TIRF 图像中可观察到逆向膜流动，但除细胞边缘外，TIRF-SIM 并未提供额外信息。TIRF-SIM 图像的采集参数为每幅原始图像曝光 50 毫秒（每幅 SIM 图像 450 毫秒），图像间隔为 5 秒。请点击此处观看该视频。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3)。请点击此处下载该文件。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (period9_001.bmp)。 请点击此处下载该文件。

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补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (period9_005.bmp)。请点击此处下载该文件。

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补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (period9_007.bmp)。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (period9_008.bmp)。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (period9_009.bmp)。 请点击此处下载该文件。

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补充代码文件： 示例 SLM 谱型文件（period9_mask_2.bmp）。请点击此处下载该文件。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件（period9_mask_3.bmp）。请点击此处下载该文件。

补充代码文件： 示例 SLM 谱系文件 (TIRF-SIM_example.rep)。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件：光栅生成示例代码（1/2）(generate_gratings.m)。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件：光栅生成示例代码（2/2）（circular_mask.m）。请单击此处下载该文件。

补充代码文件：用于计算调制对比度的示例代码（calculate_contrast.m）。请点击此处下载该文件。

讨论

与商用显微镜相比，本方案中详述的定制化全内反射荧光-结构光照明显微镜（TIRF-SIM）系统能够实现高速的多色超分辨率成像。作为一种超分辨率技术，SIM 的固有优势在于其时间分辨率不受荧光分子光物理特性的限制，而单分子定位显微镜（SMLM）或受激辐射损耗显微镜（STED）等其他方法则存在此类限制。与这些技术不同，SIM 不需要可光切换或可耗尽的荧光分子，因此多色成像更为简便。非 TIRF-SIM 系统（如光学切片 SIM 和多焦点 SIM）在实际应用中通常只能实现约 1.7 倍或更低的分辨率提升，而本方案中报道的系统可达到 2 倍的分辨率提升，且商用系统通常在速度和灵活性方面也不及本方案所介绍的系统。

实现该技术的两个主要难点在于：首先，必须将六束SIM光束精确定位在物镜后光瞳的全内反射（TIR）区域，这需要繁琐且耗时的光学对准过程；其次，为了在样品上产生高图案对比度，必须进行偏振旋转。对于低数值孔径（NA）的二维SIM系统，可通过谨慎选择线性偏振方向来避免偏振旋转，但对于TIRF-SIM25，这种方法已不可行。在高速多色成像中，必须采用电光偏振控制，这会增加系统的复杂性和成本。

该技术的局限性

与传统的全内反射荧光显微镜（TIRF）一样，TIRF-SIM 自然受限于对位于细胞基底膜上的生物结构和过程的观察，这些结构和过程只能被穿透深度为 150–200 nm 的隐逝场激发。尽管通常认为结构光照明显微镜（SIM）对细胞的光损伤低于 STED 或 SMLM，但其横向分辨率的倍增仍使得所需的光子数相比传统 TIRF 显微镜至少增加 4 倍5。在高帧率、短曝光时间的成像条件下，这种光子需求的增加要求使用更高的照明强度。虽然任何荧光染料均可用于固定样本或缓慢移动样本的 SIM 成像，但建议在活细胞成像中使用高亮度的荧光蛋白或具有增强光稳定性的新一代合成染料。

尽管该系统能够以超过20 Hz的SIM帧速率对单一颜色进行成像，但当前系统的多色成像受限于电动发射滤光片轮的切换时间。由于sCMOS相机芯片尺寸较大，因此可以采用多通带发射滤光片结合分光光学元件，实现多个波长的同时成像，而不会造成速度损失。另一种可行方案是交替使用不同的激发激光器，并采用多通带陷波滤光片来抑制激发光。本实现中使用的二元铁电空间光调制器（SLM）也并非最优选择。此类SLM的衍射效率非常低，大部分入射光位于零级反射光中，随后被空间掩模滤除。因此，在需要极高帧速率的应用中，成像速度受限于激光二极管的输出功率。此外，该SLM在偏离其设计波长550 nm的波长下，像素无法作为理想半波片工作，从而导致偏振态出现一定的椭圆性。虽然可通过额外使用液晶可变相位延迟器（LCVR）进行补偿，但更理想的解决方案可能是采用数字微镜器件（DMD）作为图案生成器。

可能的修饰

本文介绍的装置具有较高的灵活性，相较于商用仪器更易于修改，因此可实现其他成像模式，如三维结构光照明显微成像（3D-SIM）、快速二维结构光照明显微成像（fast 2D-SIM）、多焦平面结构光照明显微成像（MSIM）以及非线性结构光照明显微成像（NL-SIM）21,34,35。

2D-SIM 非常适用于成像相对扁平且快速移动的结构，例如细胞周边的内质网。周边内质网位于比全内反射荧光（TIRF）产生的渐逝场更深的细胞内部，但由于其结构较为扁平，可利用标准 2D-SIM 进行成像，且几乎无离焦背景干扰。此外，通过采用改进的光学切片重建算法以抑制离焦光信号，2D-SIM 的应用范围得以扩展至光学较厚的样品，尽管该应用无需实现轴向分辨率的倍增21。

在MSIM中，样品被稀疏的激发焦点阵列所照明36。该模式可通过简单移除空间掩膜（SM）并替换为偏振片来实现。此时，SLM作为振幅调制器工作。SLM上显示的二值SIM光栅可被替换为二维点阵，点的尺寸选择为与像平面上衍射受限焦点的尺寸相等。在图7A中，SLM上显示了一个4 × 4像素的方格阵列（插图），当该阵列被缩小投影到样品上时，会生成150 × 150 nm的衍射受限焦点，前提是SLM的物理像素尺寸为13.62 µm。通过在SLM上移动该点阵图案，可实现激发焦点的平移，该过程重复多次以照亮整个视场。对每个平移后的图案位置采集图像，随后对图像堆栈进行后处理，从而获得分辨率提高至多figure-discussion-1倍、且相比同等宽场图像背景离焦光更少的重建图像30。该成像模式适用于厚而密集的样品，而标准SIM难以应对这类样品，例如低对比度结构如染色的红细胞（图7C）；但由于每视场需要采集大量原始图像帧（本例中N = 168），成像时间有所增加。

最后，通过使用数值孔径高达1.7的油镜或增加405 nm光激活激光，并对空间光调制器（SLM）的光栅图案进行精细优化，可将该装置改造为支持高数值孔径线性全内反射荧光结构光照明显微（TIRF-SIM）或图案化激活非线性SIM（PA NL-SIM），如Li et al.最近所报道的那样35。

未来应用

SIM 仍然是一项快速发展的技术，未来将在生命科学领域实现诸多应用。该技术在速度、分辨率和对比度方面的提升，以及能够使用常规荧光染料的特点，使其在生物成像领域有望取代传统的多种显微镜系统，例如共聚焦和宽场显微平台。目前市场上已有技术指标出色的商用 SIM 系统，但其价格超出了许多研究实验室的承受能力；更重要的是，这些系统难以灵活地进行改造和升级，以整合领域内最新的研究成果。它们还缺乏“针对具体实验需求进行适配”的关键能力，而这往往是前沿生命科学研究中的重要瓶颈。本文所述系统将特别适用于研究细胞表面附近的动态过程， 体外 重建双层系统的研究，用于材料科学与物理科学中的表面化学研究 例如二维材料及其他众多应用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了以下机构的资助：利弗休姆信托基金、工程与物理科学研究理事会 [EP/H018301/1, EP/G037221/1]；阿尔茨海默病研究英国基金会 [ARUK-EG2012A-1]；惠康信托基金 [089703/Z/09/Z] 以及医学研究理事会 [MR/K015850/1, MR/K02292X/1]。我们感谢 E. Avezov 和 M. Lu 分别对 LifeAct-GFP 和胞质-GFP 细胞进行的转染实验，以及 W. Chen 对 HEK293 细胞培养物的制备。我们还感谢 K. O'Holleran 在显微镜设计方面的协助，以及 L. Shao 和 R. Heintzmann 提供的有益讨论和建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
488 nm 激光器TopticaiBeam SMART带数字调制功能
561 nm 激光器CoherentOBIS LS带数字调制功能
640 nm 激光器CoboltMLD带数字调制功能
长通二向色镜 Thorlabs用于合并激发光束
四波段二向色镜ChromaZT405/488/561/640rpc3 mm 厚，适用于全内反射成像，安装于 Olympus BX 滤光片盒中
四波段二向色镜ChromaZT405/488/561/640rpc与上述同一批次，25 × 25 mm
1" 方形运动学安装座Edmund Optics58-860
格兰-泰勒方解石偏振器ThorlabsGT5-A用于 LCVR 的对准
格兰-泰勒偏振器安装座ThorlabsSM05PM5
消色差半波片ThorlabsAHWP05M-600400–800 nm
旋转笼式安装座ThorlabsCRM1/M用于半波片
液晶可变波片Meadowlark OpticsSWIFT定制设计，可在 488 至 640 nm 范围内提供全波延迟。
LCVR 控制器Meadowlark OpticsD3060HV双通道高压控制器，用于液晶延迟器
消色差四分之一波片Meadowlark OpticsAQM-100-0545
旋转笼式安装座ThorlabsCRM1P/M用于四分之一波片
10 mm 消色差双胶合透镜ThorlabsAC080-010-A-ML用于扩束器
200 mm 消色差双胶合透镜ThorlabsAC254-200-A-ML用于扩束器
笼式 XY 平移装置ThorlabsCXY1
铁电空间光调制器Forth Dimension DisplaysM0787-00249    SXGA-3DM (IFF) 微型显示器 M249 型，1,280 × 1,024 像素，带驱动板
SLM 安装支架Forth Dimension DisplaysM0787-10014固定于定制的铝制安装座上
Ø50.8 mm 万向镜安装座ThorlabsGM200/M用于 SLM 安装
带旋转平台的双轴线性平移台ThorlabsXYR1/M用于 SLM 安装
导轨载具NewportM-PRC-3用于 SLM 安装
精密光学导轨NewportPRL-6用于 SLM 安装
300 mm 消色差双胶合透镜QioptiqG322 273 322 f = 300 mm，直径 31.5 mm
140 mm 消色差双胶合透镜QioptiqG322 239 322f = 140 mm，直径 31.5 mm
精密 XY 平移安装座ThorlabsLM2XY
透镜安装适配器ThorlabsSM2AD32用于将直径 31.5 mm 的透镜安装至 2" 安装座中
平移台Comar12XT65燕尾式，侧向驱动
带差分驱动的 XY 平移装置ThorlabsST1XY-D/M用于空间滤波器
旋转笼式安装座ThorlabsCRM1/M用于空间滤波器
300 mm 消色差双胶合透镜ThorlabsAC508-300-A-ML激发管镜
带 Z 轴压电顶板的自动 XY 载物台ASIPZ-2150-XYFT-PZ-IX71 配备 MS-2000 控制器
倒置显微镜机身OlympusIX-71
物镜OlympusUAPON100XOTIRF100X/1.49NA
高速滤光轮Prior ScientificHF110A配备 Prior ProScan III 控制器
带通发射滤光片SemrockFF01-525/30, FF01-676/29
sCMOS 相机HamamatsuORCA Flash v4.0
载物台式培养箱OKO LabH301-K-FRAME用于活细胞成像，配备 Bold Line 温度和 CO2 控制器
不锈钢光学支架柱ThorlabsTR 系列用于安装光学元件
支架柱固定座ThorlabsPH 系列用于安装光学元件
运动学镜片安装座ThorlabsKM100用于安装 1" 镜片
剪切干涉仪ThorlabsSI100
100 nm 荧光微球Life TechnologiesT-7279Tetraspeck
罗丹明 6GSigma Aldrich83697-250MG
8 孔玻璃底培养皿ibidi80827配备 #1.5 盖玻片
Nunc Lab-Tek II 多孔盖玻片培养皿Thermo Fisher Scientific155409配备 #1.5 盖玻片
0.01 mm 显微测微尺载玻片EMS68039-22
CellLight 微管蛋白-GFP，BacMam 2.0Thermo Fisher ScientificC10613

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