本实验方案的目的是利用可植入式遥测设备，在清醒且自由活动的小鼠中评估其系统性血压。
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摘要
摘要
在新型血管活性药物的研发过程中，动脉血压监测对于评估新药疗效至关重要。事实上，利用基因修饰小鼠探索新的潜在治疗靶点的研究，需要对全身动脉压变化进行可靠且长期的评估。目前，对自由活动小鼠进行长期血压测量的金标准是使用可植入式无线遥测发射器，该技术需要 动脉插管。该方法无需束缚、固定或麻醉动物，从而避免了在数据采集过程中因应激反应而引入的干扰和伪影。然而，由于小鼠动脉尺寸较小，通过导管插入法进行动脉血压监测具有较大技术难度。本文提供了一步一步的操作指南，详细说明在小鼠体内成功实施无线遥测发射器皮下植入及颈动脉插管的关键步骤。同时，我们还展示了术后恢复期后自由活动小鼠的长期血压监测实例。按照本操作流程，可实现对多只动物同时进行可靠的直接血压记录。
引言
高血压是心血管疾病的主要危险因素之一，可以说是在发达国家和发展中国家都面临的重要公共卫生问题1。已有多种实验性高血压动物模型被开发出来，用以模拟人类中观察到的高血压反应2。其中，活动性小鼠是一种研究高血压发生和发展过程的优良模型，可对长期暴露于高血压状态所产生的后果进行in vivo分析。
对小鼠进行血压（BP）监测已帮助研究人员揭示了与高血压和心力衰竭等疾病相关的生理学及病理生理学机制3,4。事实上，通过对小鼠基因组的操作，已成功构建出可用于研究高血压的转基因或基因靶向模型5,6。然而，即使对清醒小鼠进行轻微操作，也可能引发其兴奋，从而在数据采集过程中引入人为误差；而使用镇静剂或安定类药物则会显著影响血压7。这些因素在进行长期血压监测时尤为关键，必须予以充分考虑。
在小鼠中记录血压有多种方法，目前最常用技术之间的比较已在其他文献中讨论过8,9。然而，美国心脏协会（AHA）关于血压测量的建议指出，由于能够长时间直接测量血压，动脉内血压测量通常更受推荐10。结合动脉压直接测量的遥测技术是监测清醒且自由活动的实验动物生理功能的先进方法，同时可最大限度地减少应激及环境相关的人为干扰9,11。遥测技术能够自动采集多只清醒动物的血压、心率、体温和活动数据。
尽管该方法在许多实验室中正变得越来越流行，但在小鼠体内植入无线电遥测设备在技术上具有挑战性。本文展示了一种逐步操作的方案，说明如何在小鼠体内植入压力传感器。该技术包括将探头皮下插入小鼠体内，通过左侧颈动脉将导管引导至颈部并向前接近主动脉弓。远程采集的数据可实时显示在计算机屏幕上 ，同时也可存储数据用于"离线"分析。
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方案
伦理声明：本视频文章中提及的所有动物实验程序均经过动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准 在田纳西大学健康科学中心。
注意：整个手术过程中均应使用无菌显微外科器械。手术器械可通过红外灭菌器进行灭菌，最佳灭菌温度为 1,500 °F（815.6 °C）。遥测仪可重复使用，但在将其植入动物体内之前，必须根据制造商的说明对整个发射器进行灭菌，并确保导管尖端已使用制造商提供的专用凝胶重新填充。
1. 实验动物
- 所有实验均需获得动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。关于本操作后是否使用术后镇痛剂，强烈建议咨询所在机构的 IACUC 以了解具体要求。
- 将动物饲养在环境受控的房间内，室温为 21 °C，相对湿度为 60%，光照周期为 12 小时明/暗循环，并可自由获取食物和水。
注意：由于小鼠体内需要容纳遥测探头（直径约 1 cm，长度约 2 cm），建议使用体重 20 g 或以上的动物。
2. 麻醉与手术准备
- 使用精密天平称量小鼠体重 记录其 体重。请轻柔且安静地处理动物。
- 将动物放入诱导室并关闭。设置氧气流速为0.5 L/min，异氟烷浓度为4 - 5%。
- 当小鼠失去意识后，将其置于维持在36–37 °C的保温板上。通过鼻罩以2%异氟烷维持麻醉（保持流速在 0.5 L/min
- 使用脱毛膏去除颈部背面和腹面的毛发，以准备手术区域。
- 用手术擦洗液（聚维酮碘溶液）处理切口部位，与70%异丙醇交替使用，共进行3次。
3. 手术
- 将小鼠置于仰卧位。通过捏压足部检查反射，调整麻醉 直至 无反应。用手术刀在小鼠颈部下方做一条约1 cm的正中切口。在切口左侧，仔细分离皮肤与下方结缔组织，形成皮下间隙。
- 翻转小鼠，用手术刀在左侧肩胛骨后方的背部做一条长约1.5 cm的皮肤切口。沿动物体侧创建一个足够容纳装置的皮下囊袋。将发射器插入该囊袋中。
- 将一把小型止血钳从背部切口插入，并在皮下经隧道向颈部前方切口方向移动。使用该止血钳轻轻夹住一段无毒聚乙烯管（长4 cm × 内径1 mm）。
- 将止血钳连同聚乙烯管从隧道拉回，直至管子两端分别从腹部和背部切口穿出，然后松开止血钳释放管子。从背部将导管传感器插入管中，使压力传感导管的尖端经隧道穿过颈部。从颈部前方拉出并移除聚乙烯管，然后使用金属夹闭合背部切口。
- 使用无菌棉签小心分离下颌腺，并 用弹性固定钩牵拉左侧下颌腺。使用尖头弯镊，在气管左侧定位颈总动脉。 通过放置并固定无菌手术巾 保持手术区域无菌。
- 小心将血管从周围组织中游离出来，并轻轻分离沿颈总动脉走行的迷走神经（颜色偏白），使其与动脉分开。注意避免切割或损伤神经或动脉。
- 在游离出的颈总动脉段下方穿入三段不可吸收的7-0缝线。结扎头端缝线以阻断血流。牵拉靠近胸骨的缝线，暂时阻断来自主动脉的血流。
- 用中间的缝线打一个松结。 该结将用于固定导管于血管内。使用显微剪刀在头端缝线与胸骨侧缝线之间的动脉上剪一个小切口。
- 使用专用血管插管镊夹住导管，注意不要挤压导管，以防探针内的凝胶流失。用细尖弯镊轻轻夹住动脉，取出导管，并通过小切口将其插入血管内。
- 收紧围绕动脉的中间缝线结，然后轻柔推进导管。松开靠近胸骨侧的缝线，继续将导管向横主动脉方向推进。
- 观察导管上的标记，该标记可大致指示导管应插入的深度。到达指定位置后，轻柔收紧导管周围的上下两根缝线。导管通过缝线结固定于颈总动脉上。
- 使用不可吸收的5-0缝线闭合皮肤切口。缝合完成后，用组织粘合剂封闭切口。
4. 手术恢复与血压测量
- 密切观察动物是否恢复正常姿势和行为。在术后24小时期间，根据专职兽医的指导给予镇痛治疗。
- 待动物恢复后（术后5至7天），将其单独饲养于普通小鼠笼中，并将笼子置于遥测接收板上方。
- 通过将磁性装置短暂地放置在笼外靠近动物的位置，从外部启动或关闭植入式发射器"on"和"off"。
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结果
数据可通过接收器远程获取；轨迹可在计算机屏幕上显示以进行质量控制（图1a）。动物编号、舒张压和收缩压等详细信息也一并显示（图1b）。动脉血压可连续记录（24/7），或按预设的短时间间隔进行记录（即，每小时采集60秒）。数据可自动存储于硬盘中以供后续分析。下图显示了连续3天记录的平均血压数据（图2)，可以观察到黑暗与光照周期之间的昼夜节律变化。计算并绘制了血压变化和心率的平均值随时间的变化曲线。
图1. 四只植入遥测装置的小鼠的典型血压记录
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讨论
近十年来，可植入式遥测技术已显著改进；更小的探针尺寸使植入对动物的创伤更小，更长的电池寿命有助于降低成本，独立的遥测频率则消除了接收器之间的串扰。遥测技术被认为是采集自由活动动物多种生理参数的先进方法，可避免其他技术因使用束缚、人为干预或麻醉而带来的干扰8,9。
然而，该技术的一些缺点与仪器和软件的初始成本有关。发射器较为脆弱，容易损坏，且电池最终会耗尽，需要更换。 尽管公司提供低价维修损坏探针的服务，但对于一些实验室而言，费用仍可能过高。此外，该操作在技术上具有挑战性，需要经过练习才能获得可靠的血压测量结果。最后，手术后存在一定的死亡率，在我们实验条件下约为5%。 如果需要测试特定处理方法 或基因操作 影响了小鼠健康状况，则死亡率可能会显著上升。
以下关键因素对于成功实施该操作至关重要：在整个操作过程中，始终使用无菌生理盐水保持组织湿润。务必小心操作发射器； 切勿抓握压力传感器部位，以免导致凝胶泄漏或损坏发射器。插入导管时，应将中心缝线打成双结，否则可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH/NHLBI）[资助号 HL114869] 以及UTHSC对SM的支持资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小型动物麻醉系统 | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | 低流量小型动物麻醉系统 | |
| 加热垫和小鼠体温计 | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | 用于监测小动物体温并实现恒温控制 | |
| 双目显微镜 | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | 带臂杆支架和顶部LED光源的双目镜体 |
| 止血钳 | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | 用于夹闭血管或标记缝线 |
| 小型金属夹，7 mm，不锈钢 | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | 用于皮肤闭合 |
| 聚维酮碘溶液 | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% 聚维酮碘外用溶液 |
| 生理盐水溶液 | Abott Laboratories | 04930-04-10 | 用于防止组织干燥 |
| Nair（脱毛乳液） | 用于手术切口部位的毛发去除 | ||
| 编织丝线缝合线 | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | 规格 5.0、6.0、7.0 | |
| 乙醇 | 2716 | 70% 乙醇用于消毒 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tool | 15000-10 | 用于精细解剖 |
| 剪刀（侧向倾斜） | Fine Science Tool | 14063-011 | 3号手柄 |
| 手术刀片 | 2976-0 | 10号 | |
| 镊子（弯头） | Fine Science Tool | 11150-10 | 用于夹持组织 |
| 镊子（直头） | Fine Science Tool | 11151-10 | 用于夹持组织 |
| 持针器 | Fine Science Tool | 12002-12 | 用于缝合 |
| 精细尖头镊 | Fine Science Tool | ||
| 异氟烷 | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | 一种全身吸入性麻醉剂 | |
| 灭菌器 | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | 利用红外加热在5–10秒内对手术器械进行灭菌 |
| 纱布垫 | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | 用于伤口清洁、术前准备、擦洗或包扎 |
| 遥测设备 | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | 用于记录自由活动小鼠的血压 |
| 遥测接收系统 与计算机连接 | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| 导管管路 | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| 血管插管镊，13 cm，0.5 mm 外径 | World Precision Instruments | 503374 | 专用血管插管镊 |
| 组织粘合剂 | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | 用于闭合轻微伤口，通常可避免使用缝线和/或敷料 |
| 电子天平 | BB300 | 精密分析型实验室天平 |
参考文献
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