模式蓝藻物种中标记和无标记突变体的构建

摘要

向蓝细菌中引入多种基因组修饰是开发用于工业和基础研究菌株的关键工具。本文描述了一种在模式蓝细菌物种集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）中产生无标记突变体，以及在聚球藻（Synechococcus sp. PCC7002）中产生有标记突变体的系统。

摘要

蓝细菌是具有重要生态意义的生物，也是生产生物燃料和有用工业产品的潜在平台。对蓝细菌进行遗传操作，特别是对集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）和聚球藻（Synechococcus sp. PCC7002）等模式生物的操作，是基础与应用研究中的关键工具。无标记突变体的构建是一种尤为强大的技术，其过程首先通过插入抗生素抗性盒（一段包含一个或多个基因的可操作DNA片段）对菌株染色体进行修饰，随后利用负筛选标记将该抗性盒移除。无标记突变体可进行多次遗传操作，从而可在同一菌株中引入任意数量的遗传改变。此外，突变菌株中不含编码抗生素抗性蛋白的基因具有优势，可避免耐药生物逃逸至环境中的风险。然而，科学文献中对蓝细菌反复进行遗传操作的详细方法描述尚不充分。本文中，我们全面介绍了这一技术，并已成功应用于构建具有多个基因缺失、目标基因单点突变以及插入新型基因盒的突变体。

引言

蓝细菌是一类进化历史悠久且种类多样的细菌门类，几乎存在于地球上的所有自然环境中。在海洋生态系统中，它们尤为丰富，并在多种营养循环中发挥关键作用，每年约占海洋中碳固定量的一半¹、氮固定量的大部分²，以及数亿吨碳氢化合物的生成³。真核藻类和植物中负责光合作用的细胞器——叶绿体，很可能起源于被宿主生物吞噬的一类蓝细菌⁴。蓝细菌已被证明是研究光合作用、电子传递⁵及多种生化途径的有用模式生物，其中许多途径在植物中是保守的。此外，由于蓝细菌能够利用太阳能将水和CO₂高效转化为生物量⁹，它们正越来越多地被用于食品、生物燃料⁶、电能⁷和工业化合物⁸的生产。许多蓝细菌种类可在非耕地上使用极少营养物质和海水进行培养，表明其有望大规模培养而不影响农业生产。某些种类还可提供天然产物，包括抗真菌、抗菌和抗癌化合物^10,11。

获得突变体的能力对于理解蓝细菌的光合作用、生物化学和生理学至关重要，同时也是开发工业用途菌株的基础。大多数已发表的研究通过将抗生素抗性盒插入目标位点来构建基因改造菌株。这种方法限制了可在同一菌株中引入的突变数量，因为在蓝细菌中可用的抗生素抗性盒种类有限。含有赋予抗生素抗性基因的菌株不能用于开放池塘中的工业生产，而开放池塘很可能是生产生物燃料和....

方案

1. 培养基的制备

1. 根据 Castenholz（1988）的方法配制 BG11 培养基¹⁷。
   1. 配制 100 倍浓缩的 BG11、微量元素和铁储备液（表 1）。
   2. 分别配制磷酸盐储备液、Na₂CO₃ 储备液、N-[三(羟甲基)甲基]氨基乙烷磺酸（TES）缓冲液和 NaHCO₃ 溶液（表 1）。
   3. 对磷酸盐和 Na₂CO₃ 储备液进行高压灭菌。使用 0.2 µm 滤膜对 TES 缓冲液和 NaHCO₃ 溶液进行过滤除菌。
   4. 通过混合 976 ml 水、10 ml 100x BG11、1 ml 微量元素溶液和 1 ml 铁储备液配制 BG11 培养基，并对溶液进行高压灭菌。待溶液冷却至室温后，加入 1 ml 磷酸盐储备液、1 ml Na₂CO₃ 储备液和 10 ml NaHCO₃ 溶液。
   5. 对于固体 BG11 培养基，取一个烧瓶加入 15 g 琼脂和 700 ml 水；另取一个烧瓶加入 3 g Na₂S₂O₃、226 ml 水、10 ml 100....

结果

质粒设计对于成功构建标记与非标记突变体至关重要。 Figure 1 展示了质粒A和B的示例，这些质粒用于在集胞藻（Synechocystis）的cpcC1和cpcC2基因中构建缺失突变体。 Synechocystis genes cpcC1 and cpcC2¹³在这两种情况下，5' 和 3' 侧翼区域均约为 900-1,000 bp。虽然我们成功试验过的最小侧翼区域约为 500 bp，但也可以使用更短的侧翼区域。质粒 B 还可以在 5' 和 3' 侧翼区域（约 1 kb）之间包含一个基因盒，或是天然基因序列的修饰版本。' and 3' 侧翼区域长度约为900-1000 bp。虽然我们已成功验证的最小侧翼区域长度约为500 bp，但也可使用更短的侧翼区域。质粒B的5'端和3'端约1 kb侧翼区域之间还可包含一个基因盒。' and 3' 约1 kb的侧翼区域或经修饰的天然基因序列版本。

讨论

构建无标记突变体最关键的步骤包括：1）精心设计质粒，确保仅目标区域发生改变；2）保持样品无菌，尤其是在蔗糖培养基上培养时；3）将转化后的细胞首先接种于不含抗生素的BG11琼脂平板上，用于获得有标记的突变体，24小时后再添加含抗生素的琼脂；4）在接种于含蔗糖的BG11琼脂平板前，将有标记的突变体连续培养满4天；5）确保有标记的突变体已完全分离；6）充分验证突变株的基因型。对于最后一步，可设计额外的引物以扩增缺失区域的一部分，从而确认该区域已被删除。Southern印迹法虽然操作繁琐，也可用于验证。然而，根据我们的经验，本文所述方法已足以正确验证突变体。该方法也曾成功用于构建集胞藻Synechococcus elongatus PCC7942的有标记突变体，但对该蓝细菌进行多次转化仍具有挑战性。

如果无法分离出标记突变体，则需采用不同的环境条件，如高 CO₂，弱光（<20 µmol 光子 m⁻² s⁻¹^-2 秒^-1）或其他营养物质（即 葡萄糖）可以进行检测。例如，添加葡萄糖对于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4·7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
柠檬酸	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2·4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4·7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4·2H2O	Sigma	331058
CuSO4·5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2·6H2O	Sigma	239267
柠檬酸铁铵	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
氰钴胺	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto琼脂	BD	214010
蔗糖	Fisher	SUC001
90 mm 三重通气培养皿	Greiner	633185
0.2 µm 滤膜	Sartorius	16534
100 ml 锥形瓶	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm × 38 m	Bemis	FIL003
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Phusion	F-530
琼脂糖	Melford	MB1200
DNA 纯化试剂盒	MoBio	12100-300
限制性内切酶	NEB
T4 DNA 连接酶	Thermo Scientific	EL0011
LB 肉汤培养基	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
硫酸卡那霉素	Sigma	60615
氨苄青霉素	Sigma	A9518
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0503
14 ml 圆底管	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶	Promega	M7805
425-600 µm 玻璃珠	Sigma	G8772
甘油	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
荧光灯管	Gro-Lux	69
HT multitron 光生物反应器	Infors