建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

摘要

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。

摘要

持续的肝纤维化伴随细胞外基质（ECM）蛋白的不断积聚，会导致肝脏细胞功能丧失，进而引发肝硬化及肝细胞功能障碍。在多种肝脏损伤因素中，酒精滥用可导致严重的健康问题，包括肝功能衰竭和肝细胞癌。然而，针对酒精刺激后再生肝细胞的内源性细胞来源，目前尚未得到充分研究。此外，关于酒精诱导损伤后肝细胞再生的有效模型也鲜有报道。我们近期报道了一种在斑马鱼中建立的乙醇（EtOH）诱导肝纤维化模型，在该模型中，肝前体细胞（HPCs）在纤维化刺激存在的情况下，于几乎完全丧失肝细胞后再生为新的肝细胞。进一步地，利用该模型进行的小分子化合物筛选，我们鉴定出多种可促进肝细胞再生的小分子。本文详细描述了在斑马鱼中建立乙醇诱导肝纤维化模型以及利用该模型进行化合物筛选的具体操作步骤。该方案将成为解析纤维化肝脏中肝细胞再生分子与细胞机制的关键工具。此外，这些方法将有助于在活体（in vivo）条件下发现治疗慢性肝病的新型治疗策略。

引言

尽管肝细胞（肝脏主要的实质细胞类型）具有显著的再生能力¹，但在慢性肝衰竭情况下，这种能力会受到损害，从而导致依赖肝前体细胞（HPC）的再生过程²。

慢性肝损伤主要源于酒精滥用、慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染³以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）⁴。这些因素导致持续性的肝纤维化，其特征是细胞外基质（ECM）蛋白的积聚。持续的ECM积聚通过形成纤维瘢痕组织破坏正常的肝组织结构⁵，进而导致肝硬化，具有较高的发病率和死亡率。目前已有多种尝试主要通过抑制促纤维化细胞因子和活化的肌成纤维细胞来减轻纤维化反应⁶。其中，活化的肌成纤维细胞主要来源于肝星状细胞（HSCs），后者是肝脏中主要的非实质细胞，负责肝瘢痕的形成⁴。然而，在持续存在促纤维化损伤的情况下，利用包括肝前体细胞（HPCs）在内的内源性细胞来源促进肝细胞再生的再生疗法仍有待进一步研究。

已有多种哺乳动物肝纤维化实验模型被报道。反复注射四氯化碳（CCl₄）已广泛用于诱导小鼠和大鼠模型的肝纤维化⁷。当高脂（HF）饮食与酒精联合使用时，可显著上调促纤维生成基因的表达并导致肝纤维化⁸。尽管脂肪变性（脂质积聚）是由急性酒精暴露引起的，但它会使肝脏更容易受到更严重的肝损....

方案

斑马鱼的饲养和繁殖采用标准方案进行，该方案符合美国国立卫生研究院的标准，并已获得佐治亚理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。 

1. 溶液的配制

1. 准备 20 L 的卵水（可与“胚胎培养基”互换使用），用于维持斑马鱼胚胎/幼鱼。将 1.5 g CaSO₄ 和 6 g 即用型海盐溶解于 250 ml 蒸馏水中，倒入盛有 20 L 蒸馏水的试剂瓶中并充分混匀。
2. 制备 1 L 1-苯基-2-硫脲（PTU）储备液（20 倍浓度）。将 0.6 g PTU 粉末溶于 1 L 蒸馏水中。使用时每 20 ml 胚胎培养基中加入 1 ml 储备液，终浓度为 0.003%，作为工作液。
   注意：PTU 在吸入或皮肤接触后可能引起全身毒性。请依照适当的操作规范进行配制和使用。
3. 制备 1 L 乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（Tricaine）储备液（20 倍浓度）。将 4 g Tricaine 粉末溶于蒸馏水中，加入 1 M Tris 缓冲液（pH 9）调节 pH 至 7，再用蒸馏水定容至 1 L。分装为 50 ml 份量，于 -20 °C 保存。使用前解冻。
   注意：Tricaine 可导致感觉丧失。请依照适当的操作规范进行配制和使用。
4. 制备 100 ml 幼鱼用甲硝唑（MTZ）工作液。将 0.25 g MTZ 粉末溶于含 0.1% 二甲基亚砜（DMSO）的 100 ml 胚胎培养基中，配制成新鲜的 1....

结果

图1 展示了在斑马鱼幼体中建立乙醇诱导的纤维化肝模型的方法。为了优化斑马鱼幼体暴露于乙醇（EtOH）的实验方案，我们首先评估了乙醇的毒性。受精后2.5天（dpf）的幼体分别暴露于1%、1.5%或2%的乙醇浓度中24小时，随后进行24小时的乙醇与甲硝唑（MTZ）联合处理。2%乙醇处理导致高死亡率，而暴露于1%或更低浓度乙醇的幼体几乎全部存活，且纤维化改变轻微，仅偶见胶原等细胞外基质蛋白的沉积。根据这些结果，选择1.5%乙醇对幼体进行24小时预处理（2.5–3.5 dpf），随后在3.5–4.5 dpf期间同时给予MTZ处理24小时。图1A）。经EtOH/MTZ处理的幼鱼表现出形态学异常，包括躯干和尾部向上弯曲、心包水肿以及 swim bladder 无法充气。图1B）。我们使用了三种转基因品系来分析乙醇/甲硝唑处理后幼鱼肝脏中的纤维化改变：1） Tg(fabp10a:CFP-NTR)^gt1 该品系在肝细胞特异性启动子.......

讨论

我们在乙醇/甲硝唑（EtOH/MTZ）处理后的恢复期肝脏中观察到肝前体细胞（HPC）介导的肝细胞再生，表明即使存在大量包括纤维性I型胶原在内的细胞外基质（ECM）蛋白，HPC仍保持向肝细胞再生的能力。仅使用甲硝唑（MTZ）处理并未显著增加ECM蛋白的沉积，而仅使用乙醇（EtOH）处理则未诱导HPC活化。¹⁵通过联合使用乙醇（EtOH）和甲硝唑（MTZ）处理，我们能够研究纤维化肝脏中肝前体细胞（HPC）驱动的再生过程。由于接近完全的肝细胞清除会引发HPC介导的肝细胞再生，因此根据肝细胞特异性荧光缺失以及由聚集的NRCs导致的肝脏体积显著缩小这两项标准，对MTZ处理后的幼鱼进行筛选至关重要。在鱼类中，鳃和皮肤的血管可吸收酒精²⁴，因此无需让动物饮水 随意摄取 或需要像哺乳动物模型那样进行胃内灌注。我们将经乙醇（EtOH）处理后继而接受甲硝唑（MTZ）处理的成年斑马鱼分别饲养在无循环水的独立鱼缸中。每天必须将鱼转移至新鲜的乙醇溶液中，并盖上盖子以尽量减少乙醇的挥发。尽管在我们的实验方案中，48–72小时的乙醇/甲硝唑处理能有效诱导细胞外基质蛋白的合成，但这些鱼类并未发展出晚期纤维化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
半水合硫酸钙（CaSO₄·0.5H₂O）4)	顶体	AC385355000
硫酸镁（MgSO₄）4)	EMD	MX0075
1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES）	Sigma-Aldrich	P6757
乙二醇-双(2-氨基乙基醚)- N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	E3889
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
甲醛	Fisher Scientific	F79-500
甲硝唑（MTZ）	Sigma-Aldrich	M3761
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629
3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Amresco	E404	将一片药片溶于100 ml蒸馏水中
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2438
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
低熔点琼脂糖	Amresco	BP165
干细胞信号化合物库	Selleck Chemicals	L2100	10 DMSO 中的 mM 原液
ActiProbe-1K 文库	Timtec	ActiProbe-1K	10 DMSO 中的 mM 储存液
SB 415286	Selleck Chemicals	S2729	用DMSO溶解至10 mM
CHIR-99021	Selleck Chemicals	S2924	用DMSO溶解至10 毫摩尔（mM）
抗胶原蛋白 I 抗体	Abcam	ab23730	免疫染色使用比例为1:100，可与鱼类反应
AlexaFluor 647 驴抗兔 IgG (H+L)	分子探针	A31573	免疫染色使用比例为1:200
封片剂（Vectorshield）	Vector Laboratories	H-1400
100 mm 培养皿	VWR	25384-088
24孔板	VWR	10062-896
镊子	Fine Science Tools	11255-20	Dumont #55
载玻片	VWR	48312-003	75x25 mm
盖玻片	VWR	48366-045	18 mm
塑料封口膜	Fisher Scientific	22305654
铝箔	Fisher Scientific	1213100
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
振动切片机	Leica	VT1000 S
体视显微镜	Leica	M80
荧光显微镜	Leica	M205 FA
共聚焦显微镜	蔡司	LSM700