方法文章

制备与分析 体外 三维乳腺癌替代模型

DOI：

10.3791/54004

⸱

2016年5月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们展示了一种生成三维乳腺癌替代模型的方法，该模型可通过灌注生物反应器系统进行培养，以提供氧气和营养物质。在培养完成后，将替代模型固定并经处理制成石蜡包埋样本，用于评估相关参数。本文详细说明了其中一项参数——细胞密度的评估方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

三维（3D）培养是模拟细胞行为的一种更接近生理条件的方法 体外 优于二维培养。癌组织（包括乳腺癌组织）是由癌变的上皮细胞和基质成分（包括成纤维细胞和细胞外基质（ECM））构成的复杂三维组织。然而，大多数 体外 乳腺癌模型仅包含癌变的上皮细胞，忽略了间质成分，因此也缺乏肿瘤的三维结构 体内. 准确构建癌的三维模型对于深入理解肿瘤生物学特性、行为及其对治疗的反应至关重要。然而，由于培养环境中氧气和营养物质的供应受限，三维模型的培养时间及体积往往受到限制。本文介绍一种方法，将乳腺癌上皮细胞与间质成纤维细胞共同嵌入细胞外基质（ECM）中，构建包含间质成分的三维乳腺癌替代模型，该模型既可作为实体三维结构进行静态培养，也可利用灌注式生物反应器系统以持续供给氧气和营养物质。在完成初始构建和生长阶段后，该替代模型可用于临床前药物测试。此外，亦可通过调整模型中的细胞和基质组分，以研究多种生物学问题。培养结束后，模型样品经固定并按类似于临床乳腺癌标本的处理方式加工成石蜡包埋切片，用于后续目标参数的评估。文中以细胞密度这一参数为例，说明如何利用ImageJ和CellProfiler图像分析软件系统，对替代模型组织切片的显微照片进行分析，定量单位面积内有核细胞的数量。该指标可用于反映细胞数量随时间的变化，或不同培养条件及处理干预下细胞数量的改变情况。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

更准确模拟肿瘤结构和微环境的三维（3D）培养模型 体内 对于旨在解析细胞与其微环境之间复杂相互作用以及评估候选疗法有效性的研究而言，这些因素至关重要。肿瘤的维度特性会影响氧气和营养物质的梯度分布、药物暴露的均匀性、间质压力/血流以及三维结构1-4适当的间质微环境的存在有助于肿瘤的三维结构形成，并影响细胞与细胞外基质之间的信号传导以及间质细胞与恶性上皮细胞之间的旁分泌信号交流。肿瘤三维结构及其微环境对细胞功能的影响已有充分研究证实，这两个因素均可改变细胞对药物的反应。1,3,5-8此外，二维（2D）培养与三维（3D）培养在细胞生长动力学、代谢速率和细胞信号传导方面存在差异，这些因素均会影响细胞反应。1,3,8-10.

体外实验中，可通过添加具有代表性的细胞外基质（ECM）组分和间质细胞群体来调控肿瘤替代微环境。恶性上皮细胞会受到细胞外基质和肿瘤相关间质细胞的影响，这种影响可能是协同/保护性的，促进肿瘤进展；也可能是抑制性的，阻止肿瘤进一步扩散5,6,10。在这两种情况下，间质均可能通过旁分泌信号传导和/或通过增加肿瘤内部的间质压力，影响治疗反应和药物递送效率，从而导致药物递送减少1,6。因此，在临床前模型中加入细胞外基质和间质细胞，将有助于重现那些在二维培养体系中难以有效模拟的肿瘤特征。

本文描述了一种在三维空间中构建包含可重现微环境（包括细胞外基质成分和间质细胞）的乳腺癌替代模型的方法。在乳腺癌中，间质细胞群体主要由癌症相关成纤维细胞（CAF）构成，而间质细胞外基质主要由Ⅰ型胶原组成，此外还含有少量基底膜中的基质成分，如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原。1,4,11-13因此，乳腺癌微环境的这些组分（即， CAF、胶原蛋白I和基底膜）已整合到替代物中。该方法可用于生成实体、无灌注的3D替代物（图1A）或可通过生物反应器系统对替代物进行培养基灌注来实现图1B）此处描述了这两种方法。该方法也可根据需要进行修改，以包含其他间质成分（如肿瘤相关巨噬细胞），或通过调整细胞和细胞外基质成分来模拟其他实体瘤。

对于本文所述的乳腺癌替代模型，我们采用了 MDA-MB-231 (231) 乳腺癌细胞系、先前从人乳腺癌组织中分离得到的癌相关成纤维细胞（CAF）14，以及由 90% I 型胶原蛋白（6 mg/ml）和 10% 生长因子减少型基底膜物质（BM）组成的细胞外基质（ECM）。该替代模型可在 8 孔腔室载玻片中培养（静态替代模型），也可使用生物反应器系统以实现持续营养灌注（灌注式替代模型）。任何能够容纳含细胞 ECM 体积的灌注式生物反应器系统均可使用15。作为示例，我们描述了在本实验室生物反应器系统中制备组织替代模型的方法。该系统为本实验室自主研发，尚未商业化。由于本文重点在于 3D 组织替代模型的制备与分析，因此未对生物反应器系统的制造与组装细节进行详述。然而，该系统及其开发过程的详细描述已有文献发表16。在此生物反应器系统中，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）流道容纳替代模型，并由 PDMS 泡沫提供支撑（制备方法类似于 Calcagnile 等17 所述）。该空间内贯穿 4 个微通道（直径均为 400 µm），通过微生理泵持续灌注培养基，为替代模型提供氧气和营养物质。

对替代指标的适当分析对于获取有关细胞功能在治疗或其他干预措施下反应的相关信息至关重要。替代指标可通过多种方法进行分析，包括使用共聚焦显微镜或其他非侵入性成像手段对完整的替代指标进行直接成像，通过检测条件培养基或灌流液中的分泌产物进行间接细胞分析，或在固定和石蜡包埋处理后对组织学切片进行分析。可在组织学切片上评估的参数之一是细胞密度。本文介绍一种测量细胞密度的方法（即， 每单位截面积的有核细胞数）利用对经苏木精-伊红（H&E）染色的替代组织学切片显微照片应用半自动图像处理技术进行分析&E）细胞密度可作为指示细胞数量随时间变化或因不同生长条件和处理而产生相对变化的指标。

实体组织与灌注组织示意图；用于扩散分析和组织检测的流动通道实验。
图1. 三维结构与生物反应器系统。A）生成实体三维替代物的流程示意图。顶部：包含细胞外基质（粉红色）、上皮癌细胞（黄色）和癌症相关成纤维细胞（CAF，橙色）的实体三维结构示意图；底部：含有替代物的8孔腔载玻片的俯视图。B）生成灌注型三维替代物的流程示意图。顶部：具有通道的三维结构示意图，允许培养基灌注，其中包含细胞外基质（粉红色）、上皮癌细胞（黄色）和CAF（橙色）；中部：含PDMS泡沫（黑色箭头）的PDMS流动通道图像，用于注入细胞+ECM混合物，并插入直径为400 µm的聚合物包被不锈钢丝（粉色箭头）；底部：含替代物的PDMS流动通道图像，已连接至生物反应器系统以实现持续培养基灌注（未显示蠕动泵和培养基储液器）。C）实体型与灌注型替代物培养后处理步骤的图像。左侧：含有样本处理凝胶和替代物的冷冻模具图像；中部：含有固定并处理后替代物的石蜡包埋块图像；右侧：载玻片上替代物的苏木精-伊红（H&E）染色组织学切片图像。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 细胞培养

  1. 将BM组分在4 °C条件下过夜解冻，或置于冰上解冻。
  2. 将培养基预热至37 °C。为同时支持231细胞和CAF的生长，使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
    注意：所用培养基取决于细胞类型及实验目的。
  3. 从接近汇合的231细胞培养皿（10 cm）中移除培养基，加入1.5 ml胰蛋白酶/EDTA溶液。在37 °C孵育1至3分钟，并观察细胞脱落情况。当细胞开始变圆并从培养皿表面脱离时，加入3 ml含血清的培养基终止反应。用移液器将培养基和细胞转移至15 ml锥形管中。
  4. 在150 × g条件下离心5分钟，收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml培养基中。
  5. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞浓度进行计数。细胞活力应高于90%。
  6. 对拟用于类器官模型的其他细胞类型重复上述操作。本方案所述的类器官模型中，需对CAF细胞重复此过程。
  7. 根据所需细胞数量，确定每种细胞悬液的适当体积。
    注意：本方案所述的类器官模型中，每100 µl细胞外基质（ECM）中接种2.1 × 106个细胞，上皮细胞与成纤维细胞的比例为2:1（即每100 µl ECM中含1.4 × 106个231细胞和7 × 105个CAF）。该细胞密度为适宜的起始点；然而，最佳细胞密度将取决于细胞类型、培养时间及实验目标。
  8. 将每种细胞悬液的适当体积分别加入15 ml锥形管中（每种细胞类型使用单独的管子）。在150 × g条件下离心5分钟。
  9. 离心后，弃去上清液，将一种细胞类型重悬于细胞培养级水（178.8 µl，见表1），另一种细胞类型重悬于10倍浓缩DMEM（100 µl，见表1，含酚红以监测pH值）。将含有细胞的管子置于冰上，并立即进行后续ECM的制备。应尽量缩短细胞在水中的停留时间，以维持细胞活力。
    注意：10倍浓缩DMEM和细胞培养级水均为ECM的必需组分；因此，我们选择将细胞分别重悬于这两种溶液中。此处我们任意选择将231细胞重悬于细胞培养级水中，而CAF重悬于10倍浓缩DMEM中，但两种细胞类型均可任选其一进行重悬。

2. ECM 中细胞的制备（6 mg/ml 牛 I 型胶原 + 10% BM）

注意：选择由90% I型胶原和10%基底膜（BM）组成的细胞外基质（ECM）来模拟侵袭性乳腺癌，因为该恶性肿瘤的肿瘤间质主要由I型胶原构成，而基底膜成分（如层粘连蛋白、IV型胶原和entactin）仅占细胞外基质的一小部分12,13,18,19。

  1. 在冰上，按顺序将 表1 所列组分加入一个 2 ml 微量离心管中。
    注意：此用量足以制备 8 个固体替代物，或使用本文所述的生物反应器系统制备 4 个灌注替代物。
ECM 中细胞的制备
（6 mg/ml 牛 I 型胶原蛋白 + 10% 基底膜）
178.8 µl含有预定数量 231 细胞（如上确定）的细胞培养级水
606 µl 胶原蛋白 I（10 mg/ml 牛源），逐滴加入
100 µl 基底膜，已解冻
100 µl10x DMEM（含酚红），含有预定数量的 CAF（如上确定）
15.2 µl 7.5% (v/v) 碳酸氢钠，逐滴加入

表1. 细胞在细胞外基质中的制备。

  1. 用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。利用10x DMEM中的酚红监测pH水平。检查混合物是否呈现橙色/粉红色，表明pH值约为7。如果pH过低（颜色过黄），则缓慢逐滴加入额外的7.5%碳酸氢钠（每滴约5 µl），直至达到合适的颜色。
    1. 将混合物置于冰上，并快速操作，以防止细胞外基质（ECM）过早聚合。

3. 替代物制备

  1. 对于三维固体培养（图1A）：
    1. 在细胞培养超净台中采用无菌操作技术，标记无菌8孔腔室载玻片的盖子，以标明类器官实验中的不同处理条件。
    2. 将腔室载玻片保持在冰上以防止细胞外基质（ECM）过早聚合，缓慢地将100 µl细胞+ECM混合物移液至8孔腔室载玻片的每个孔中。
      注意：先将细胞+ECM混合物沿孔边缘移液有助于其在孔内更均匀分布。
    3. 将类器官置于37 °C、5% CO2条件下孵育45分钟，以促进ECM聚合。
    4. ECM聚合完成后，向每孔加入100 µl培养基，并在实验期间持续于37 °C、5% CO2条件下孵育，每两天更换一次培养基。
  2. 对于生物反应器系统中的灌注式三维培养（图1B）：
    1. 使用适用于所用生物反应器的特定方法，对所有用于三维培养的生物反应器组件进行灭菌（例如，生物反应器本体、管路、镊子以及组装所需的连接件）。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，采用高压蒸汽灭菌（例如，121.1 °C下暴露12分钟，随后干燥15分钟）并结合70%乙醇中孵育1小时的方法。
    2. 准备并组装生物反应器系统中用于容纳类器官的部分。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，使用镊子将PDMS泡沫支架插入PDMS流道管中，并将四根（400 µm）聚合物涂层不锈钢丝推入PDMS泡沫内，以形成平行微通道。
    3. 在细胞培养超净台中，采用无菌操作技术，使用带26号针头的注射器将细胞+ECM混合物注入灌注式生物反应器中设计用于容纳细胞的区域。随后立即进行下一步操作。
    4. 为确保类器官内细胞分布更加均匀，将容纳类器官的生物反应器组件置于50 ml锥形管中（置于细胞培养超净台内），并在37 °C孵育45分钟以促进ECM聚合，同时以约18 rpm持续旋转。
      注意：旋转可在配备旋转装置的培养箱或杂交炉等设备中完成，例如设置为37 °C的杂交炉。
    5. 根据制造商说明书，将含有类器官的生物反应器组件连接至灌注泵。
      注意：此步骤的具体操作将因所使用的生物反应器和泵型号不同而有所差异。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，在将生物反应器组件连接至泵之前，需先移除不锈钢丝。
    6. 在37 °C、5% CO2的培养箱中启动培养基灌注（总体流速为167.1 µl/min；微通道壁面剪切应力为1 dyne/cm2）。
      注意：培养基灌注速率可根据生物反应器设置以及实验目标和设计进行调整。
    7. 在整个实验期间持续进行培养基灌注，每七天更换一次培养基。

4. 替代物固定与处理（图1C）

  1. 标记用于替代物固定的冻存模具和塑料组织包埋盒。
  2. 接下来，将替代物包埋于标本处理胶中。标本处理胶是一种水性材料，在较高温度下呈液态，但在室温下会凝固。标本处理胶有助于在处理过程中保持替代物的完整性，并有利于组织学切片14,20-22。
    1. 将标本处理胶置于60 °C水浴中熔化至液态，并保持该温度直至使用。将带有替代物的生物反应器移至生物安全柜中。
    2. 用移液器吸取约300 µl标本处理胶，加入已标记的冻存模具底部（图1C，左图）。
    3. 使用手术刀片（推荐10号）和镊子小心地将替代物从生物反应器或8孔腔室载玻片的孔中取出，并放入含有标本处理胶的冻存模具中。
      注意：可使用不同颜色的组织标记染料（参见材料/设备清单中的具体示例）对替代物进行标记，从而可在同一个组织包埋盒中容纳多个样本并加以区分。
    4. 用移液器吸取约300 µl标本处理胶覆盖冻存模具中的替代物，于4 °C孵育30分钟使其凝固。
    5. 待标本处理胶完全凝固后，将含有替代物的凝胶块从冻存模具中取出，并放入组织包埋盒中。
  3. 将含有替代物的组织包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林中，在室温下固定10至12小时，以确保完全固定。
  4. 固定完成后，将含有替代物的组织包埋盒转移至70%乙醇中，直至进行石蜡包埋。
    注意：将替代物从福尔马林转移至乙醇可防止福尔马林过度固定，后者可能导致某些抗原表位免疫反应性的丧失23。在乙醇中的保存时间无严格要求。若替代物将用于免疫组织化学或免疫荧光染色，则更换固定剂尤为关键。固定后的替代物现已准备好进行石蜡包埋（图1C，中图）。该步骤通常在配备适当的组织学实验室中的组织处理仪中完成。由于替代物体积小且结构脆弱，建议采用较短的处理程序24

5. 切片与 H&E染色（图1C，右侧面板）

  1. 将替代物处理成石蜡包埋块后，使用标准切片机对福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行切片24,25。
    注意：此步骤可在具备资质的组织学实验室或设备齐全且经验丰富的研究实验室中进行。组织切片的厚度可根据切片的预期用途而变化；然而，我们通常使用厚度为 5 µm 的切片。此处用于灌注替代物的 PDMS 泡沫可轻松用切片机进行切片。
  2. 将切片置于普通的玻璃组织学载玻片上。
  3. 切片完成后，在 58 °C 下烘烤组织切片 10–12 小时，以备进行苏木精和伊红（H&E）染色。烘烤可熔化石蜡，并有助于切片更好地黏附于玻璃载玻片。
  4. H&E 染色：
    1. 根据待染色载玻片的数量，使用柯氏瓶或玻璃染色缸设置 表 2 中所述的染色步骤。试剂准备好后，按顺序将切片依次通过各步骤，并按照下方所示时间孵育24。
    2. 使用封片介质为每张载玻片加盖盖玻片。
    3. 在成像前让封片介质充分干燥。
苏木精-伊红染色（H&E 染色）
步骤试剂时间
1Xylene5 min
2Xylene5 min
3Xylene5 min
4100% Ethanol5 min
5100% Ethanol5 min
695% Ethanol5 min
795% Ethanol5 min
8Tap Water5 min
9De-ionized Water5 min
10Hematoxylin 72115 min
11Tap Water5 min
12Clarifier*10 dips
*Richard Allan #7401 或 70% Ethanol + 0.5% HCl
13Tap Water5 min
14Bluing Reagent30 sec
15Tap Water5 min
1695% Ethanol10 dips
17Eosin-Y1 min
1895% Ethanol10 dips
1995% Ethanol10 dips
20100% Ethanol10 dips
21100% Ethanol10 dips
22100% Ethanol5 min
23Xylene10 dips
24Xylene5 min

表2. H&E染色。

6. 测定细胞密度

  1. 使用明场显微镜在400倍放大倍数下，对替代物的至少一张完整H&E染色组织切片进行成像，并将图像保存为.tif文件。
    注意： 此处描述的图像处理仅使用彩色图像完成。尽管尚未测试，我们认为相同的处理方法也适用于灰度图像。
  2. 从布罗德研究所26（http://cellprofiler.org/download.shtml）下载CellProfiler，从美国国立卫生研究院（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）下载ImageJ，两者均可免费公开获取。
  3. 为测量每张图像中替代物的面积，打开ImageJ，选择“设置测量值”（位于“分析”选项卡下），勾选“面积”，然后点击“确定”。
  4. 打开一张替代物的图像（.tif文件）。在ImageJ中使用多边形工具（见图2），通过拖动鼠标并单击以创建锚点，沿图像中替代物的区域进行勾画。以细胞外基质（ECM）的边缘作为参考。完成勾画后，在“分析”选项卡下选择“测量”。

显微镜图像分析；细胞计数；ImageJ 软件；高亮显示的细胞；生物学研究。
图 2. ImageJ 分析。ImageJ 处理界面截图。 请点击此处查看此图的高清版本。

  1. 对每个组织替代物的图像重复上述步骤。将测量结果及对应的图像编号保存至电子表格程序中。
  2. 将用于在 ImageJ 中测量面积的图像文件拖拽至 CellProfiler 的“文件列表”中以上传。在“NamesAndTypes”输入模块中为导入的图像指定名称，并选择图像类型（即“彩色图像”）。

CellProfiler 界面；带有模块和生物数据处理文件列表的图像分析设置。
图 3. CellProfiler 示例流程。 在 CellProfiler 中设计用于测量有核细胞数量的流程图截图。请点击此处查看此图的高清版本。

  1. 创建一个分析流程，通过点击“调整模块”旁边的“+”号，添加以下模块，以计算每张图像中的细胞数量，图3，位于左侧面板底部）。添加以下每个模块。
    1. 选择“ColorToGray”（图4).
      1. 从下拉菜单中选择输入图像名称，命名输出图像，并选择原始图像类型（即， RGB（如果是彩色图像输入）。
        注意： 如果使用灰度图像，则无需此模块
    2. 选择“ImageMath”（图5).
      1. 选择“反相”操作，命名输出图像，并在“选择第一幅图像”选项卡中选择灰度图像。
    3. 选择“IdentifyPrimaryObjects”（识别初级对象）图6).
      1. 选择输入图像（经数学校正后的图像），命名要识别的主要对象（细胞核），并输入待测对象的直径范围（以像素为单位，约25至65）。选择“adaptive”阈值策略，阈值方法为“Otsu”，分类设置为“three classes”。其余参数均保持默认设置，不作更改。
        注意： 应通过在输入图像模块中打开图像，并使用测量长度工具测量细胞核（即主要对象）的直径，来确定最佳直径范围。
    4. 选择“IdentifySecondaryObjects”（图7).
      1. 选择输入图像（经数学校正后的图像），选择输入对象（细胞核），并命名待识别的对象（细胞）。选择“传播”方法以识别二级对象，采用“自适应”阈值策略，使用“Otsu”方法进行“双类”分割，以最小化“加权方差”。选择“不平滑”，阈值校正因子设为1，上下限分别设为0和1，正则化因子设为0.05。其他参数均保持默认设置，不做更改。
    5. 选择“MeasureObjectSizeShape”（图8).
      1. 选择细胞（二级对象）和细胞核（一级对象）作为待测量对象。
    6. 选择“FilterObjects”（图9).
      1. 命名输出对象，并选择细胞核（初级对象）作为要筛选的对象。
      2. 将接下来的两个参数保持默认设置。选择“AreaShape”作为按类别筛选的测量项，选择“FormFactor”作为测量参数。
      3. 选择“是”以使用最小测量值进行筛选，并输入最小值 0.52。
      4. 选择“否”以使用最大测量值进行筛选。
      5. 选择“是”以保留已过滤对象的轮廓，并为轮廓图像命名。
    7. 选择“ExportToSpreadsheet”（图10)
      1. 选择文件保存位置并将文件命名为“Output Files”。
    8. 分析流程生成后（步骤 6.7.1 至 6.7.7.1），在 CellProfiler 中启动“测试模式”，逐项评估每个步骤，包括测试图像中的细胞核是否被适当过滤，以确保所选参数能够最优地识别细胞。 图11 显示的是使用CellProfiler进行过滤后的输出图像，其中细胞核被正确识别（以绿色圈出），背景已被滤除。
    9. 当参数经评估并确定充分后，保存项目，然后点击“Analyze Images”。该项目可重复用于后续分析。
      注意： 参数设定后，程序将按顺序分析“文件列表”中的所有图像。这会导致每分析一幅图像就打开多个窗口，从而延长处理时间。
      1. 为避免处理时间过长，请点击“分析模块”部分中除“ExportToSpreadsheet”外所有模块的眼睛图标。
    10. 在 CellProfiler 完成所有替代图像的处理后，打开包含 CellProfiler 生成的图像数据的电子表格以及包含 ImageJ 测量面积的电子表格。复制 CellProfiler 电子表格中的过滤后细胞核数据（D 列）和图像标识符（R 列），并将其粘贴到包含测量面积数据的电子表格中。
    11. 计算该替代标志物每张图像中细胞核数量所有测量值的总和。
    12. 计算从每个替代物图像中获得的替代物面积测量值的总和。将测得的总面积除以1x106.
    13. 将上一步中获得的细胞核总数除以总面积测量值，得到每1×10的细胞数量6 像素2.

CellProfiler 软件界面，ColorToGray 模块，RGB 图像转换设置，数据分析工具。
图 4. CellProfiler 分析流程：将图像转换为灰度图像。 “ColortoGray”模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

CellProfiler 数据分析软件界面；图像处理工作流程，ImageMath 模块设置。
图 5. CellProfiler 分析流程：图像反相。 “ImageMath”模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

用于细胞核识别的CellProfiler界面；Otsu阈值法；图像分析设置
图6. CellProfiler分析流程：识别细胞核。 “IdentifyPrimaryObjects”模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

CellProfiler 工作流程软件、图像分析和对象识别参数、界面示意图。
图 7. CellProfiler 分析流程：细胞识别。“IdentifySecondaryObjects”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

显示用于细胞核和细胞测量的图像分析流程的 CellProfiler 软件界面。
图 8. CellProfiler 流程：测量对象。 “MeasureObjectSizeShape” 模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

CellProfiler 软件界面；细胞核对象筛选、图像分析模块、数据测量。
图 9. CellProfiler 分析流程：筛选对象。“FilterObjects”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

用于图像分析的 CellProfiler 软件界面；模块设置为将数据导出到电子表格。
图 10. CellProfiler 分析流程：数据导出。“ExportToSpreadsheet”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜下的细胞核检测、对象过滤结果、处理前后计数分析、图像处理
图11. 经过滤处理后 CellProfiler 的输出结果。 在 CellProfiler 中完成对象过滤后的输出界面截图。请点击此处查看该图的高清版本。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如上所述，制备了实体和灌注的3D乳腺癌替代模型，并培养7天。随后，对替代模型进行固定、脱水并包埋于石蜡中，切片后进行苏木精-伊红染色，步骤同上。测定每个替代模型中每单位面积的有核细胞数量（包括231细胞和CAF）。如图12所示，H&E染色切片的代表性显微照片显示，尽管在初始构建时两种替代模型中的细胞密度相同，灌注替代模型（图12A）中的细胞浓度明显高于实体替代模型（图12B）。这一细胞生长的视觉表现也通过CellProfiler分析得到证实：灌注替代模型（n=3）每单位面积的平均细胞数量（密度）高于实体替代模型（n=3）（图12C）。为获得图12C中的数据，需对每个替代模型的完整组织横截面进行成像，每个替代模型需采集多张图像，并按上述方法进行分析。随后，将每个替代模型的总核数除以其总面积（表示为每1×106像素2的核数），从而计算出每个替代模型的细胞密度...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，描述了一种三维（3D）培养方法，该方法结合了组织微环境的组分，包括细胞外基质（ECM）和人源间质成纤维细胞，在更接近模拟人类乳腺癌的三维空间中，促进形成可重现的3D形态结构。所描述的3D培养方法相较于传统的二维（2D）细胞培养更能代表人类疾病状态，因其将多种细胞类型整合于三维的ECM空间中。已有研究指出，这些参数（即， 多种细胞类型、细胞外基质和三维结构为研究生物过程提供了更为恰当的环境，因为组织结构、微环境信号以及三维空间特性均被纳入考虑。 1,8其他3D培养方法此前已有描述，包括将细胞培养于3D基质上方的方法29，类球体的生成30悬滴培养31，以及微流控装置的使用32尽管这些系统各自具有独特的优势，但总体上均未能包含基质成分、间质细胞群体或具有代表性的三维结构。本文所述的三维培养方法包含了上述所有参数，并可利用生物反应器系统进行构建，从而实现较长时间的培养，而这是使用固体三维培养难以达到的。此外，灌注式支架相比固体支架可提供更佳的生长效果。

该方...

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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阿拉巴马大学伯明翰分校代谢性骨病研究中心负责替代样本的组织学处理与切片工作。南方研究所（美国阿拉巴马州伯明翰市）为生物反应器系统的制造提供了支持。本研究由美国国防部乳腺癌研究计划（BC121367）提供经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco改良Eagle培养基1x（DMEM）Corning CellGro10-014-CV
胎牛血清（FBS）Atlanta BiologicalsS11150
0.25% 胰蛋白酶 + 2.21 mM EDTA 1×康宁25-053-CI
组织培养板，100 毫米CellTreat 科学产品229620无菌的
组织培养板，35 毫米CellTreat 科学产品229638用于PDMS泡沫的形成 
9" 玻璃移液管Fisher 13-678-20D无菌的
10 ml 移液管CellTreat 科学产品229210B无菌的
1,000 µ移液器吸头FisherBrand02-717-166无菌过滤
200 µ移液器吸头FisherBrand02-717-141无菌过滤
10 µl 移液器吸头FisherBrand02-717-158无菌过滤
15 ml 离心管CellTreat 科学产品229410无菌的
50 ml 离心管CellTreat 科学产品229422无菌的
1.5 ml 微量离心管FisherBrand05-408-129无菌的
台盼蓝Corning Cellgro25-900-CI无菌的
Sylgard 184电子显微镜科学公司24236-10PDMS 弹性体和固化剂。用于我们实验室自制的生物反应器。
PDMS泡沫由本实验室自制，用于本实验室的生物反应器。
高浓度牛I型胶原蛋白Advanced Biomatrix5133-AFibriCol ~10 mg/ml
生长因子减少型基质胶（基底膜）康宁354230基底膜材料
碳酸氢钠SigmaS8761
分子生物学级水FisherBP2819-1
DMEM 10x Sigma-AldrichD2429
Nunc Lab-Tek 培养皿腔室系统 赛默飞世尔科技1774028孔
生物反应器自制
弹簧回弹304不锈钢—涂覆聚四氟乙烯聚合物McMaster-Carr1749T19用于在我们自制设备中生成微通道的不锈钢丝  生物反应器系统。0.016" 直径
BioPharm Plus 铂金固化硅胶泵管，L/S 14MasterflexEW-96440-14用于我们内部生物反应器系统。管道内径：1.6 mm，软管接头尺寸：1/16 in。
2-停位导管套装，非扩口型PVC，1.52 毫米内径Cole-Parmer EW-74906-36用于我们内部的生物反应器系统（配备微型蠕动泵）。 
六通道精密微型蠕动泵Cole-ParmerEW-74906-04用于我们自主研发的生物反应器系统
结核菌素注射器BD医疗30962526 号 3/8 英寸针头；无菌
解剖组织镊FisherBrand13-812-365.5 英寸
迷你管旋转混匀仪Boekel Scientific260750替代旋转设备选项。与适用于50 ml离心管的转盘（货号 260753）配合使用
50 ml 离心管转盘博克尔科学公司260753与微型管旋转混合器配合使用
Bambino  杂交炉Boekel Scientific230301替代物旋转设备选项
组织学凝胶样本处理胶赛默飞世尔科技HG-4000-012步骤 5.2 中所述的标本处理凝胶
冷冻模具安温科学456615 mm × 15 mm × 5 mm
组织标记染料癌症诊断公司 03000P可用于标记替代物，  可将多个样本放入同一个组织包埋盒中 
铰链式组织包埋盒 FisherBrand22-272-416
甲醛Fisher23-245-685
GoldSeal 普通载玻片赛默飞世尔科技3048-002
二甲苯FisherX3P-1GAL
乙醇，200度（100%），USPDecon Laboratories, Inc.2805M
苏木精赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学7211
澄清器Thermo Scientific Richard-Allan Scientific7401
蓝染液Thermo Scientific Richard-Allan Scientific7301
伊红Y赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学7111
Cytoseal XYL 封片介质Thermo Scientific Richard-Allan Scientific83124
盖玻片Fisher Scientific12-548-5G

参考文献

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