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方法文章

制备与分析 体外 三维乳腺癌替代模型

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DOI：

10.3791/54004

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2016年5月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

我们展示了一种生成三维乳腺癌替代模型的方法，该模型可通过灌注生物反应器系统进行培养，以提供氧气和营养物质。在培养完成后，将替代模型固定并经处理制成石蜡包埋样本，用于评估相关参数。本文详细说明了其中一项参数——细胞密度的评估方法。

摘要

三维（3D）培养是模拟细胞行为的一种更接近生理条件的方法 体外 优于二维培养。癌组织（包括乳腺癌组织）是由癌变的上皮细胞和基质成分（包括成纤维细胞和细胞外基质（ECM））构成的复杂三维组织。然而，大多数 体外 乳腺癌模型仅包含癌变的上皮细胞，忽略了间质成分，因此也缺乏肿瘤的三维结构 体内. 准确构建癌的三维模型对于深入理解肿瘤生物学特性、行为及其对治疗的反应至关重要。然而，由于培养环境中氧气和营养物质的供应受限，三维模型的培养时间及体积往往受到限制。本文介绍一种方法，将乳腺癌上皮细胞与间质成纤维细胞共同嵌入细胞外基质（ECM）中，构建包含间质成分的三维乳腺癌替代模型，该模型既可作为实体三维结构进行静态培养，也可利用灌注式生物反应器系统以持续供给氧气和营养物质。在完成初始构建和生长阶段后，该替代模型可用于临床前药物测试。此外，亦可通过调整模型中的细胞和基质组分，以研究多种生物学问题。培养结束后，模型样品经固定并按类似于临床乳腺癌标本的处理方式加工成石蜡包埋切片，用于后续目标参数的评估。文中以细胞密度这一参数为例，说明如何利用ImageJ和CellProfiler图像分析软件系统，对替代模型组织切片的显微照片进行分析，定量单位面积内有核细胞的数量。该指标可用于反映细胞数量随时间的变化，或不同培养条件及处理干预下细胞数量的改变情况。

引言

更准确模拟肿瘤结构和微环境的三维（3D）培养模型 在体 对于旨在解析细胞与其微环境之间复杂相互作用以及评估候选疗法有效性的研究具有重要意义。肿瘤的三维性影响氧气和营养梯度、药物暴露的均匀性、间质压力/血流以及三维结构1-4适当的间质微环境的存在有助于肿瘤的三维结构形成，并影响细胞与细胞外基质（ECM）之间的信号传导以及间质细胞与恶性上皮细胞之间的旁分泌信号交流。肿瘤三维结构及其微环境对细胞功能的影响已有充分研究，这两个因素均可改变细胞对药物的反应。1,3,5-8此外，二维（2D）培养与三维（3D）培养在细胞生长动力学、代谢速率和细胞信号传导方面存在差异，这些因素会影响细胞反应1,3,8-10.

体外实验中，可通过添加具有代表性的细胞外基质（ECM）组分和间质细胞群体来调控肿瘤替代微环境。恶性上皮细胞会受到细胞外基质以及肿瘤相关间质细胞的影响，这种影响可能是协同/保护性的，从而促进肿瘤进展；也可能是抑制性的，从而阻止肿瘤进一步扩散5,6,10。在这两种情况下，间质均可能通过旁分泌信号传导和/或通过增加肿瘤内的间质压力，影响治疗反应和药物递送效率，进而导致药物递送减少1,6。因此，在临床前模型中加入细胞外基质和间质细胞，将有助于重现那些在二维培养中难以有效模拟的肿瘤特征。

本文描述了一种建立包含模拟微环境（包括细胞外基质组分和基质细胞）的三维乳腺癌替代模型的方法。在乳腺癌中，基质细胞群体主要由癌症相关成纤维细胞（CAF）构成，而基质细胞外基质主要由Ⅰ型胶原组成，另含少量存在于基底膜中的基质成分，如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原。1,4,11-13. 因此，乳腺癌微环境的这些组分（即， CAF、胶原蛋白I型和基底膜）已整合到替代物中。该方法可用于生成实体、无灌注的3D替代物（图1A）或可进行调整，通过生物反应器系统使培养基灌注流经替代物（图1B）这里描述了这两种方法。也可根据需要对本方法进行修改，以包含其他间质成分（如肿瘤相关巨噬细胞），或通过调整细胞和细胞外基质成分来模拟其他实体瘤。

对于本文所述的乳腺癌替代模型，我们采用了 MDA-MB-231 (231) 乳腺癌细胞系以及先前从人乳腺癌组织中分离得到的癌相关成纤维细胞（CAF）14，以及由90% I型胶原（6 mg/ml）和10%生长因子减少的基底膜物质（BM）组成的细胞外基质（ECM）。该替代模型可在8孔腔室载玻片中培养（固体替代模型），或使用生物反应器系统以实现持续营养灌注（灌注式替代模型）。任何能够容纳含细胞ECM体积的灌注式生物反应器系统均可使用15以我们的生物反应器系统为例，介绍组织替代物的制备过程。该系统为自主研发，尚未商业化。由于本文重点在于三维组织替代物的制备与分析，因此未对生物反应器系统的制造与组装细节进行详述。然而，该系统及其开发过程的详细描述已有文献发表。16在此生物反应器系统中，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）流道来容纳替代物，该替代物由PDMS泡沫支撑（泡沫制备方法类似于Calcagnile所描述的方法）。 等17）。该体积内贯穿有4条微通道（每条 400 µm 直径）通过微生理泵持续灌注培养基，以为类器官提供氧气和营养物质。

对替代物进行恰当分析，对于获取有关细胞在应对处理或其他操作时功能的相关信息至关重要。替代物可通过多种方法进行分析，包括使用共聚焦显微镜或其他无创成像手段对完整替代物进行直接成像，通过检测条件培养基或灌流液中的分泌产物进行间接细胞分析，或在固定和石蜡包埋处理后对组织切片进行分析。其中一项可在组织切片上评估的参数是细胞密度。本文介绍一种利用半自动图像处理技术，对经苏木精-伊红（H&E）染色的替代物组织切片显微照片进行分析，以测定细胞密度（即 每单位截面积内的有核细胞数量）的方法。细胞密度可作为反映细胞数量随时间变化，或因不同生长条件和处理而产生变化的相对指标。

细胞培养中的实体与灌注装置；流动通道、实验示意图；组织分析。
图1. 三维结构与生物反应器系统。A） 生成实体三维替代物的流程示意图。上图：包含细胞外基质（粉红色）、上皮癌细胞（黄色）和癌相关成纤维细胞（CAF，橙色）的实体三维结构示意图；下图：含有替代物的8孔板的俯视图。B） 生成灌注式三维替代物的流程示意图。上图：具有通道结构的三维结构示意图，允许培养基灌注，其中包含细胞外基质（粉红色）、上皮癌细胞（黄色）和CAF（橙色）；中图：含PDMS泡沫（黑色箭头）的PDMS流动通道图像，用于注入细胞+ECM混合物，并插入直径为400 µm的聚合物涂层不锈钢丝（粉色箭头）；下图：PDMS流动通道中包含一个替代物，并连接至生物反应器系统以实现连续培养基灌注（未显示蠕动泵和培养基储液罐）。C） 培养后对实体和灌注式替代物进行处理的各步骤图像。左图：含有样本处理凝胶和替代物的冷冻模具图像；中图：包含固定并处理后替代物的石蜡包埋块图像；右图：载玻片上替代物的苏木精-伊红（H&E）染色组织切片图像。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 细胞培养

  1. 将BM组分在4 °C条件下过夜解冻，置于冰上。
  2. 将培养基预热至37 °C。为同时支持231细胞和CAF的生长，使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
    注意：所用培养基取决于细胞类型及实验目的。
  3. 从接近汇合的231细胞培养皿（10 cm）中移除培养基，加入1.5 ml胰蛋白酶/EDTA溶液。在37 °C孵育1至3分钟，并观察细胞脱落情况。一旦细胞开始变圆并从培养皿表面脱离，立即加入3 ml含血清的培养基以终止反应。用移液器将培养基和细胞转移至15 ml锥形管中。
  4. 在150 × g条件下离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml培养基中。
  5. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对单位体积内的细胞数量进行计数。细胞活力应高于90%。
  6. 对拟用于类器官模型的其他细胞类型重复上述操作。对于本文所述的类器官模型，需对CAF细胞重复此过程。
  7. 根据目标细胞数量，确定每种细胞悬液所需的适当体积。
    注意：对于本文所述的类器官模型，每100 µl细胞外基质（ECM）中接种2.1 × 106个细胞，上皮细胞与成纤维细胞的比例为2:1（即每100 µl ECM中含1.4 × 106个231细胞和7 × 105个CAF），该细胞密度可作为良好起点；然而，最佳细胞密度将取决于细胞类型、培养时间及实验目标。
  8. 将每种细胞悬液的适当体积分别加入15 ml锥形管中（每种细胞类型使用单独的管子）。在150 × g条件下离心5分钟。
  9. 离心后，弃去上清液，将一种细胞类型重悬于细胞培养级水（178.8 µl，见表1），另一种细胞类型重悬于10倍浓度DMEM（100 µl，见表1，含酚红以监测pH值）。将含有细胞的管子置于冰上，并迅速进行后续ECM的制备。应尽量缩短细胞在水中的停留时间，以维持细胞活力。
    注意：10倍浓度DMEM和细胞培养级水均为ECM的必需组分；因此，我们选择将细胞分别重悬于这两种溶液中。此处我们任意选择将231细胞重悬于细胞培养级水中，CAF重悬于10倍浓度DMEM中，但任一种细胞均可使用任一溶液重悬。

2. ECM 中细胞的制备（6 mg/ml 牛 I 型胶原 + 10% BM）

注意：选择由90% I型胶原蛋白和10%基底膜（BM）组成的细胞外基质（ECM）来模拟侵袭性乳腺癌，因为此类恶性肿瘤的肿瘤间质主要由I型胶原蛋白构成，而基底膜成分（如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白和内连蛋白）仅占细胞外基质的一小部分12,13,18,19。

  1. 在冰上，按顺序将 表1 所列组分加入一个 2 ml 微量离心管中。
    注意：此用量足以制备 8 个固体替代物，或如使用本文所述的生物反应器系统，可制备 4 个灌注替代物。
ECM 中细胞的制备
（6 mg/ml 牛 I 型胶原蛋白 + 10% 基底膜）
178.8 µl含有预定数量 231 细胞（如上确定）的细胞培养级水
606 µl 胶原蛋白 I（10 mg/ml 牛源），逐滴加入
100 µl 基底膜，已解冻
100 µl10x DMEM（含酚红），含有预定数量的 CAF（如上确定）
15.2 µl 7.5% (v/v) 碳酸氢钠，逐滴加入

表1. 细胞在细胞外基质中的制备。

  1. 用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。利用10x DMEM中的酚红监测pH水平。检查混合液是否呈橙色/粉红色，表明pH值约为7。如果pH过低（颜色过黄），则逐滴缓慢加入额外的7.5%碳酸氢钠（每滴约5 µl），直至达到合适的颜色。
    1. 将混合液置于冰上，并快速操作，以防止细胞外基质（ECM）过早聚合。

3. 替代物制备

  1. 用于固体三维培养（图1A）：
    1. 在细胞培养罩内使用无菌操作技术，标记无菌8孔板盖子，以标明替代模型中的实验变量。
    2. 将8孔板保持在冰上以防止细胞外基质（ECM）过早聚合，缓慢将100 µl细胞+ECM混合物移液至8孔板的每个孔中。
      注意：先将细胞+ECM混合物移液至孔的边缘有助于在孔内更均匀地分布混合物。
    3. 将替代模型在37 °C、5% CO2条件下孵育45分钟，以促进ECM聚合。
    4. ECM聚合完成后，向每个孔中加入100 µl培养基，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育至实验结束，每两天更换一次培养基。
  2. 用于生物反应器系统中的灌注三维培养（图1B）：
    1. 使用适用于所用生物反应器的特定方法，对所有用于三维培养设置的生物反应器组件（即生物反应器、管路、镊子以及生物反应器组装所需的接头）进行灭菌。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，采用高压蒸汽灭菌（例如，121.1 °C下暴露12分钟，随后干燥15分钟）与70%乙醇中孵育1小时相结合的方式进行灭菌。
    2. 准备并组装用于容纳替代模型的生物反应器部分。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，使用镊子将PDMS泡沫支架插入PDMS流道管中。将四根（400 µm）聚合物涂层不锈钢丝推入PDMS泡沫中，以形成平行的微通道。
    3. 在细胞培养罩内，使用无菌操作技术及带有26号针头的注射器，将细胞+ECM混合物注入灌注式生物反应器中设计用于容纳细胞的区域。随后立即进入下一步操作。
    4. 为确保细胞在替代模型中分布更均匀，将容纳替代模型的生物反应器组件置于50 ml圆锥形离心管中（置于细胞培养罩内），在37 °C条件下以约18 rpm持续旋转孵育45分钟，以促进ECM聚合。
      注意：旋转可在带有旋转装置的培养箱或杂交炉等设备中完成，例如将杂交炉设定为37 °C。
    5. 根据制造商说明书，将含有替代模型的生物反应器组件连接至灌注泵。
      注意：该步骤的具体操作将因所使用的生物反应器和泵的不同而有所差异。
      1. 对于本实验所用的示例生物反应器系统，在将生物反应器组件连接至泵之前，需先移除不锈钢丝。
    6. 在37 °C、5% CO2的培养箱中启动培养基灌注（总体流速为167.1 µl/min；微通道壁面剪切应力为1 dyne/cm2）。
      注意：培养基灌注速率可根据生物反应器设置以及实验目标和设计进行调整。
    7. 在整个实验期间持续进行培养基灌注，每七天更换一次培养基。

4. 替代固定与处理（图1C）

  1. 标记用于替代物固定的冻存模具和塑料组织包埋盒。
  2. 接下来，将替代物包埋于标本处理凝胶中，该凝胶为一种水性材料，在较高温度下呈液态，但在室温下会凝固。标本处理凝胶有助于在处理过程中保持替代物的完整性，并有利于组织学切片14,20-22。
    1. 将标本处理凝胶置于60 °C水浴中熔化至液态，并保持该温度直至使用。将含有替代物的生物反应器转移至生物安全柜中。
    2. 用移液器吸取约300 µl标本处理凝胶，加入已标记的冻存模具底部（图1C，左图）。
    3. 使用手术刀片（推荐10号）和镊子小心地将替代物从生物反应器或8孔腔载玻片的孔中取出，并放入含有标本处理凝胶的冻存模具中。
      注意：可使用不同颜色的组织标记染料（参见材料/设备列表中的具体示例）对替代物进行标记，从而可在同一个组织包埋盒中容纳多个样本并加以区分。
    4. 用移液器吸取约300 µl标本处理凝胶覆盖冻存模具中的替代物，并在4 °C孵育30分钟以使其凝固。
    5. 待标本处理凝胶完全凝固后，将含有替代物的凝胶块从冻存模具中取出，并放入组织包埋盒中。
  3. 将含有替代物的组织包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林中，在室温下固定10至12小时，以确保完全固定。
  4. 固定完成后，将含有替代物的组织包埋盒转移至70%乙醇中，直至进行石蜡包埋。
    注意：将替代物从福尔马林转移至乙醇可避免福尔马林过度固定，后者可能导致某些抗原表位免疫反应性的丧失23。在乙醇中的保存时间无严格要求。若替代物将用于免疫组织化学或免疫荧光染色，则更换固定剂尤为关键。固定后的替代物现已准备好进行石蜡包埋（图1C，中图）。该步骤通常在配备适当的组织学实验室中的组织处理仪中完成。由于替代物体积小且结构脆弱，建议采用较短的处理程序24

5. 切片与H&E染色（图1C，右侧面板）

  1. 将替代物处理成石蜡包埋块后，使用标准切片机对福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行切片24,25。
    注意：此步骤可在具备资质的组织学实验室或设备齐全且经验丰富的研究实验室中进行。组织切片的厚度可根据切片的预期用途而变化；然而，我们通常使用厚度为 5 µm 的切片。此处灌注替代物中使用的 PDMS 泡沫可轻松用切片机切片。
  2. 将切片置于普通玻璃组织学载玻片上。
  3. 切片后，在 58 °C 下烘烤组织切片 10–12 小时，以备进行苏木精和伊红（H&E）染色。烘烤可熔化石蜡，并使切片更牢固地附着于玻璃载玻片上。
  4. H&E 染色：
    1. 根据待染色载玻片的数量，使用柯氏瓶或玻璃染色缸设置 表 2 中所述的染色步骤。试剂准备好后，按顺序将切片依次通过各步骤，并按照以下时间进行孵育24。
    2. 使用封片介质为每张载玻片加盖盖玻片。
    3. 在成像前让封片介质充分干燥。
H&E 染色
步骤溶液时间
1Xylene5 min
2Xylene5 min
3Xylene5 min
4100% Ethanol5 min
5100% Ethanol5 min
695% Ethanol5 min
795% Ethanol5 min
8Tap Water5 min
9De-ionized Water5 min
10Hematoxylin 72115 min
11Tap Water5 min
12Clarifier*10 dips
*Richard Allan #7401 或 70% Ethanol + 0.5% HCl
13Tap Water5 min
14Bluing Reagent30 sec
15Tap Water5 min
1695% Ethanol10 dips
17Eosin-Y1 min
1895% Ethanol10 dips
1995% Ethanol10 dips
20100% Ethanol10 dips
21100% Ethanol10 dips
22100% Ethanol5 min
23Xylene10 dips
24Xylene5 min

表2. H&E 染色。

6. 测量细胞密度

  1. 使用明场显微镜在 400X 放大倍数下对替代组织的至少一张完整 H&E 染色组织切片进行成像，并将图像保存为 .tif 文件。
    注意： 所述图像处理仅在彩色图像上完成过。尽管尚未测试，但我们认为相同的处理方法也适用于灰度图像。
  2. 从布罗德研究所26（http://cellprofiler.org/download.shtml）下载 CellProfiler，从美国国立卫生研究院（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）下载 ImageJ，两者均可免费公开获取。
  3. 为测量每张图像中替代组织的面积，打开 ImageJ，选择“设置测量”（位于“分析”选项卡下），勾选“面积”，然后点击“确定”。
  4. 打开一张替代组织的图像（.tif 文件）。在 ImageJ 中使用多边形工具（见图 2），通过拖动鼠标并单击以创建锚点，沿图像中替代组织的区域进行勾画。以细胞外基质（ECM）的边缘作为参考。勾画完成后，在“分析”选项卡下选择“测量”。

细胞显微镜图像；分析区域选择；数字测量；生物研究工具。
图2. ImageJ 分析。ImageJ 处理界面截图。 请点击此处查看此图的高清版本。

  1. 对每个组织替代物图像重复上述操作。将测量结果及对应的图像编号保存至电子表格程序中。
  2. 将用于在 ImageJ 中测量面积的图像文件拖拽至“文件列表”中，上传至 CellProfiler。在“NamesAndTypes”输入模块中为导入的图像指定名称，并选择图像类型（即， “彩色图像”

用于图像分析工作流程的 CellProfiler 界面；模块包括图像滤波和对象识别。
图3. CellProfiler 示例分析流程。 在 CellProfiler 中设计的用于测量有核细胞数量的流程截图。请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 创建一个分析流程，通过点击“调整模块”旁边的“+”号，添加以下模块，以计算每张图像中的细胞数量，图3，位于左侧面板底部）。添加以下每个模块。
    1. 选择“ColorToGray”（图4).
      1. 从下拉菜单中选择输入图像名称，命名输出图像，并选择原始图像类型（即， RGB（如果输入为彩色图像）。
        注意： 如果使用灰度图像，则无需此模块
    2. 选择“ImageMath”（图5).
      1. 选择“反相”操作，命名输出图像，并在“选择第一幅图像”选项卡中选择灰度图像。
    3. 选择“IdentifyPrimaryObjects”（图6).
      1. 选择输入图像（数学校正后的图像），命名待识别的主要对象（细胞核），并以像素为单位输入待测对象的直径范围（约25至65）。选择“adaptive”阈值策略，阈值方法为“Otsu”，分类数设为“three classes”。其他参数均保持默认设置，不作更改。
        注意： 应通过在输入图像模块中打开图像，并使用测量长度工具测量细胞核（即主要物体）的直径，来确定最佳直径范围。
    4. 选择“IdentifySecondaryObjects”（图7).
      1. 选择输入图像（经数学校正后的图像），选择输入对象（细胞核），并命名待识别的对象（细胞）。选择“传播”方法以识别二级对象，采用“自适应”阈值策略，使用“Otsu”方法进行“双类”分割，以最小化“加权方差”。选择“不平滑”，阈值校正因子设为1，上下限分别设为0和1，正则化因子设为0.05。其余参数均保持默认设置，不作更改。
    5. 选择“MeasureObjectSizeShape”（图8).
      1. 选择细胞（二级对象）和细胞核（一级对象）作为待测量对象。
    6. 选择“FilterObjects”（图9).
      1. 命名输出对象，并选择细胞核（初级对象）作为筛选对象。
      2. 将接下来的两个参数保持默认设置。选择“AreaShape”作为按类别筛选的测量参数，选择“FormFactor”作为测量参数。
      3. 选择“是”以使用最小测量值进行筛选，并输入最小值 0.52。
      4. 选择“否”以使用最大测量值进行筛选。
      5. 选择“是”以保留已过滤对象的轮廓，并为轮廓图像命名。
    7. 选择“ExportToSpreadsheet”（图10)
      1. 选择保存文件的位置，并将文件命名为“Output Files”。
    8. 在分析流程生成后（步骤 6.7.1 至 6.7.7.1），在 CellProfiler 中启动“测试模式”，逐项评估每个步骤，包括测试图像中的细胞核是否被适当过滤，以确保所选参数能够最优地识别细胞。 图11 显示的是使用CellProfiler进行过滤后的输出图像，其中细胞核被正确识别（以绿色圈出），背景已被滤除。
    9. 一旦参数被评估并确定为充分，保存项目，然后点击“Analyze Images”。该项目可重复用于后续分析。
      注意： 参数设定后，程序将开始依次分析“文件列表”中的所有图像。这将导致每分析一幅图像都会打开多个窗口，从而延长处理时间。
      1. 为避免处理时间过长，请点击“分析模块”部分中除“ExportToSpreadsheet”外所有模块的眼形图标。
    10. 所有模拟图像经 CellProfiler 处理后，打开包含 CellProfiler 生成的图像数据的电子表格以及包含 ImageJ 测量面积的电子表格。复制 CellProfiler 电子表格中的过滤后细胞核数据（D 列）和图像标识符（R 列），并将其粘贴至包含测量面积数据的电子表格中。
    11. 计算该替代标志物每张图像中细胞核数量的所有测量值的总和。
    12. 计算从每个替代物图像中获得的替代物面积测量值的总和。将测得的总面积除以 1x106.
    13. 将上一步中获得的细胞核总数除以总面积测量值，以得到每 1x10 的细胞数量6 像素2.

用于图像分析流程的 CellProfiler 软件界面，ColorToGray 模块设置，RGB 输入。
图 4. CellProfiler 流程：将图像转换为灰度图像。 “ColorToGray” 模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

CellProfiler 软件界面；图像分析工作流程；用于数据处理的 ImageMath 模块。
图 5. CellProfiler 分析流程：图像反转。 “ImageMath” 模块的截图。 请点击此处查看此图的高清版本。

用于图像分析的 CellProfiler 界面；通过图像处理中的自适应阈值进行细胞核检测设置。
图6. CellProfiler 分析流程：识别细胞核。 “IdentifyPrimaryObjects”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

使用 CellProfiler 软件进行细胞图像分析的设置；识别次级对象的过程。
图 7. CellProfiler 分析流程：识别细胞。“IdentifySecondaryObjects”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

用于细胞形态分析的 CellProfiler 软件界面；细胞核测量与泽尼克特征计算。
图 8. CellProfiler 分析流程：测量对象。 “MeasureObjectSizeShape” 模块的截图。 请点击此处查看该图的高清版本。

用于图像分析工作流程的 CellProfiler 界面；细胞核过滤模块；生物学实验设置。
图 9. CellProfiler 分析流程：过滤对象。“FilterObjects”模块的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

CellProfiler 导出设置界面，数据分析配置，图像处理工作流程。
图 10. CellProfiler 流程：数据导出。“ExportToSpreadsheet”模块的截图。请点击此处查看此图的高清版本。

细胞过滤分析；示意图；细胞核识别；软件界面；过滤前后数据。
图11. 过滤后 CellProfiler 的输出结果。 CellProfiler 在完成对象过滤后输出界面的截图。请点击此处查看该图的高清版本。

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结果

按照上述方法制备了实体和灌注的3D乳腺癌模型，并培养7天。随后，按照前述方法将模型固定、脱水并包埋于石蜡中，切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色。测定每个模型单位面积内的有核细胞数量（包括231细胞和CAF）。如图12所示，H&E染色切片的代表性显微照片显示，尽管在初始构建时两种模型中的细胞密度相同，但灌注模型（图12A）中的细胞浓度明显高于实体模型（图12B）。这一细胞生长的视觉表现得到了CellProfiler分析结果的支持：灌注模型（n=3）单位面积内的平均细胞数量（密度）高于实体模型（n=3）（图12C）。为获得图12C中的数据，对每个模型的完整组织横截面进行成像，每个模型需采集多张图像，并按前述方法进行分析。然后，将每个模型的总核数除以其总面积（表示为每1×106像素2的核数），从而计算出每个模型的细胞密度。为验证CellProfile...

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讨论

在此，描述了一种三维（3D）培养方法，该方法结合了组织微环境的组分，包括细胞外基质（ECM）和人源间质成纤维细胞，在更接近模拟人类乳腺癌的三维空间中，促进形成可重现的3D形态结构。所描述的3D培养方法相较于传统的二维（2D）细胞培养更能代表人类疾病状态，因其将多种细胞类型整合于三维的ECM空间中。已有研究指出，这些参数（即， 多种细胞类型、细胞外基质和三维结构为研究生物过程提供了更为恰当的环境，因为组织结构、微环境信号以及三维空间特性均被纳入考虑。 1,8其他3D培养方法此前已有描述，包括将细胞培养于3D基质上方的方法29，类球体的生成30悬滴培养31，以及微流控装置的使用32尽管这些系统各自具有独特的优势，但总体上均未能包含基质成分、间质细胞群体或具有代表性的三维结构。本文所述的三维培养方法包含了上述所有参数，并可利用生物反应器系统进行构建，从而实现较长时间的培养，而这是使用固体三维培养难以达到的。此外，灌注式支架相比固体支架可提供更佳的生长效果。

该方...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

阿拉巴马大学伯明翰分校代谢性骨病研究中心负责替代样本的组织学处理与切片工作。南方研究所（美国阿拉巴马州伯明翰市）为生物反应器系统的制造提供了支持。本研究由美国国防部乳腺癌研究计划（BC121367）提供经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco改良Eagle培养基1x（DMEM）Corning CellGro10-014-CV
胎牛血清（FBS）Atlanta BiologicalsS11150
0.25% 胰蛋白酶 + 2.21 mM EDTA 1×康宁25-053-CI
组织培养板，100 毫米CellTreat 科学产品229620无菌的
组织培养板，35 毫米CellTreat 科学产品229638用于PDMS泡沫的形成 
9" 玻璃移液管Fisher 13-678-20D无菌的
10 ml 移液管CellTreat 科学产品229210B无菌的
1,000 µ移液器吸头FisherBrand02-717-166无菌过滤
200 µ移液器吸头FisherBrand02-717-141无菌过滤
10 µl 移液器吸头FisherBrand02-717-158无菌过滤
15 ml 离心管CellTreat 科学产品229410无菌的
50 ml 离心管CellTreat 科学产品229422无菌的
1.5 ml 微量离心管FisherBrand05-408-129无菌的
台盼蓝Corning Cellgro25-900-CI无菌的
Sylgard 184电子显微镜科学公司24236-10PDMS 弹性体和固化剂。用于我们实验室自制的生物反应器。
PDMS泡沫由本实验室自制，用于本实验室的生物反应器。
高浓度牛I型胶原蛋白Advanced Biomatrix5133-AFibriCol ~10 mg/ml
生长因子减少型基质胶（基底膜）康宁354230基底膜材料
碳酸氢钠SigmaS8761
分子生物学级水FisherBP2819-1
DMEM 10x Sigma-AldrichD2429
Nunc Lab-Tek 培养皿腔室系统 赛默飞世尔科技1774028孔
生物反应器自制
弹簧回弹304不锈钢—涂覆聚四氟乙烯聚合物McMaster-Carr1749T19用于在我们自制设备中生成微通道的不锈钢丝  生物反应器系统。0.016" 直径
BioPharm Plus 铂金固化硅胶泵管，L/S 14MasterflexEW-96440-14用于我们内部生物反应器系统。管道内径：1.6 mm，软管接头尺寸：1/16 in。
2-停位导管套装，非扩口型PVC，1.52 毫米内径Cole-Parmer EW-74906-36用于我们内部的生物反应器系统（配备微型蠕动泵）。 
六通道精密微型蠕动泵Cole-ParmerEW-74906-04用于我们自主研发的生物反应器系统
结核菌素注射器BD医疗30962526 号 3/8 英寸针头；无菌
解剖组织镊FisherBrand13-812-365.5 英寸
迷你管旋转混匀仪Boekel Scientific260750替代旋转设备选项。与适用于50 ml离心管的转盘（货号 260753）配合使用
50 ml 离心管转盘博克尔科学公司260753与微型管旋转混合器配合使用
Bambino  杂交炉Boekel Scientific230301替代物旋转设备选项
组织学凝胶样本处理胶赛默飞世尔科技HG-4000-012步骤 5.2 中所述的标本处理凝胶
冷冻模具安温科学456615 mm × 15 mm × 5 mm
组织标记染料癌症诊断公司 03000P可用于标记替代物，  可将多个样本放入同一个组织包埋盒中 
铰链式组织包埋盒 FisherBrand22-272-416
甲醛Fisher23-245-685
GoldSeal 普通载玻片赛默飞世尔科技3048-002
二甲苯FisherX3P-1GAL
乙醇，200度（100%），USPDecon Laboratories, Inc.2805M
苏木精赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学7211
澄清器Thermo Scientific Richard-Allan Scientific7401
蓝染液Thermo Scientific Richard-Allan Scientific7301
伊红Y赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学7111
Cytoseal XYL 封片介质Thermo Scientific Richard-Allan Scientific83124
盖玻片Fisher Scientific12-548-5G

参考文献

  1. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
  2. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  3. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  4. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
  5. Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
  6. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  7. Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
  8. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
  9. Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
  10. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
  11. Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
  12. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
  13. Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
  14. Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
  15. Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
  16. Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  17. Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
  18. Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
  19. Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
  20. Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
  21. Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316(2009).
  22. Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
  23. Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
  24. Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
  25. Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
  26. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  27. Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
  28. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293(2015).
  29. Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311(2014).
  30. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088(2014).
  31. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  32. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526(2015).
  33. Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
  34. Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
  35. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
  36. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  37. Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
  38. Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
  39. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
  40. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
  41. Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
  42. Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).

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