制备及分析体外三维乳腺癌代理项

三维能够更准确地模仿肿瘤体系结构和微环境在体内 （3D）培养模型对于旨在解剖细胞及其微环境之间复杂的相互作用，并以测试候选疗法的功效研究很重要。肿瘤维影响氧和养分梯度，药物暴露，间质性压力/血流量，以及3D结构^1-4的均匀性。适当的基质微环境的存在有助于肿瘤维和影响细胞-ECM信令和基质细胞和恶性上皮细胞之间的旁分泌信号传导。肿瘤维和细胞功能的微环境的影响被很好地建立，以这两个因素改变药物反应^1,3,5-8。此外，细胞的生长动力学，代谢率，以及细胞信号传导在三维二维（2D）培养和培养之间不同，这些因素AFFE电视机细胞反应^1,3,8-10。

在体外 ，肿瘤替代微环境可以通过包括代表性的ECM成分和基质细胞群进行调制。恶性上皮细胞被ECM和癌症相关的基质细胞或以协同/保护方式，以促进肿瘤进展或以抑制的方式影响以抑制进一步肿瘤传播^5,6,10。在任一情况下，基质可以影响通过旁分泌信号和/或通过在导致肿瘤增加间质的压力降低药物递送^1,6-治疗反应和药物递送。因此，在加入ECM和基质细胞的成临床前模型有助于概括不能在二维培养以及建模的肿瘤的各个方面。

在此一方法建立乳腺癌代理人，纳入一个概括性的微环境，包括细胞外基质成分和stromal细胞，在3D体积中描述。在乳腺癌中，基质细胞群主要是由癌相关成纤维细胞（CAF）和基质细胞外基质的主要是由I型胶原的与基质组分的比例较小了在基底膜找到，包括层粘连蛋白和IV型胶原^1,4,11-13。因此，乳腺癌微环境的这些组件（ 例如，CAF，I型胶原和基底膜）已经被纳入代理人。该方法可用于产生固体，未灌注3D代用品（ 图1A）或可适于通过经由生物反应器系统（ 图1B）的替代，以包括介质的灌注。这两种方法如下所述。这种方法也可修改为包括其它基质元素，如肿瘤相关巨噬细胞，或通过调节细胞和细胞外基质成分，根据与其他实体瘤模型。

14分离，和一个ECM组成90％的胶原蛋白I的（ 6毫克/毫升）和10％的生长因子减少基底膜材料（BM）。代孕是在8孔玻片（固体代理）或者种植或生物反应器系统是利用提供持续的营养灌注（灌注替代）。任何灌注生物反应器系统，该系统可容纳含有ECM的细胞的体积可以使用^15。作为一个例子，我们描述了我们的生物反应器系统的组织替代物的准备。这个系统是在内部开发并且不是可商购的。因为我们的重点是在这里对​​3D组织替代物的制备和分析，我们还没有进入对我们的生物反应器系统的制造和装配的具体细节丰富。然而，详细描述此系统及其发展已经出版^16。在该生物反应器系统中，聚二甲基硅氧烷（PDMS）流动通道用于容纳所述替代，这是由一个PDMS泡沫支持的（使用类似于由Calcagnile 等 ¹⁷中所述的方法形成的）。此体积是由4微通道（每个400微米的直径），其被连续地由介质经由microphysiologic泵灌注供应氧气和营养物的替代穿透。

的替代物的合适的分析是至关重要获得关于对治疗的反应或其他操作的细胞功能相关的信息。代理人可通过各种方法，包括完整的替代物的直接成像使用共聚焦显微镜或非侵入性成像的其他方法，通过测定条件培养基，或灌洗液间接细胞分析进行分析，对于分泌的产品，或固定和加工后的组织切片的分析至石蜡。可以在组织学切片进行评估一个这样的参数是细胞密度。我们提出了以测量细胞密度的一种方法（ 即，每截面积的有核细胞的数目），使用施加到用苏木精和曙红（H＆E）染色的替代组织切片的显微照片半自动化图像处理技术。细胞密度可以用作细胞数随时间的相对变化的一个指标，或从不同的生长条件和处理结果。

图1. 3D体积和生物反应器系统。 A）的过程示意图产生固体3D代理人。上图:含ECM（粉红色），上皮细胞（黄色）和CAF（橙色）固体体积的3D卡通;下图:含8孔腔滑代理人的俯视图B）原理的过程来产生3D灌注代理人。上图:CA具有通道3D体积的rtoon以允许介质灌注和含有ECM（粉），上皮癌细胞（黄色），和CAF（橙色）;中间:含PDMS的泡沫（黑色箭头）的PDMS流动通道的图像与细胞中+ ECM被注入并通过聚合物涂布的不锈钢丝（粉红色箭头）直径为400微米的侵入;下:含有替代，并连接到生物反应器系统，以允许连续介质灌注的PDMS流动通道的图像（蠕动泵和介质贮存器未示出）℃）培养后固体和灌注代理人的处理步骤的图像。左图:包含样品处理凝胶和替代的cryomold的形象;中东:含固定和加工替代石蜡块的图像;右:用替代的H＆E染色组织切片载玻片上的图像，请点击这里查看更大的版本这个数字。

1.细胞培养

1. 解冻骨髓组分过夜，在4℃，在冰上。
2. 至37℃的温水中。同时支持231细胞和CAF的增长，使用Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）加10％牛胎儿血清（FBS）。
   注意: 使用的介质将取决于细胞类型和实验的目标。
3. 从邻近汇合231细胞的培养皿（10厘米）除去介质并加入1.5毫升胰蛋白酶/ EDTA中。孵育1至3分钟，在37℃，监测细胞脱离。一旦细胞开始圆和脱落板，加入3ml含培养基的血清的反应停止。吸取培养基，细胞入15ml锥形管中。
4. 离心在150 xg离心的培养基和细胞5分钟。除去上清液，并重新悬浮于2ml培养基中的细胞沉淀。
5. 算使用台盼蓝和血细胞计数器单位体积的细胞数量。细胞生存力应大于90％。
6. 重复与其它类型的细胞的过程被包括在替代。对于这里所描述的替代，该过程被重复与CAF。
7. 确定每个细胞悬浮液的适当体积，以获得细胞的期望数量。
   注意: 对于这里所描述的替代， 每100微升的ECM的 2.1×10 ^6个 细胞 的细胞密度 ，以2:上皮细胞的1比成纤维细胞（1.4×10 ^6个 231细胞和 每100微升 7×10 ^5个 CAF ECM）被使用。这种细胞密度是一个很好的起点;然而，最优的细胞密度将取决于细胞类型，培养的持续时间，并在实验的目标。
8. 将每个细胞悬浮液的适当体积的入15ml锥形管（一个管的每个细胞类型）。离心在150 xg离心的培养基和细胞5分钟。
9. 离心后，去除上清，重新暂停细胞一种细胞类型培养级水（178.8微升， 见表1），并在10倍的DMEM其他细胞类型（100微升， 见表1，含酚红并监控pH值）。将装有冰的细胞管并迅速着手准备下面的ECM。限制，该细胞保持在水中以保持活力的时间。
   注:ECM的两个10X DMEM和细胞培养级水所需的组件;因此，我们选择重新悬浮细胞两者。在这里，我们任意选择重悬浮231细胞在细胞培养级水中和CAF在10×DMEM，虽然任一细胞类型可以被重新悬浮在这两种组分。

2.制备在ECM细胞（6毫克/毫升牛I型胶原+ 10％BM）的

注:90％的胶原蛋白组成的ECM I + 10％BM被选为浸润性乳腺癌模型，因为在这种恶性的肿瘤间质主要是胶原蛋白组成我与BM的部件，如层粘连蛋白，胶原蛋白IV和巢蛋白，其包含细胞外基质^12,13,18,19的较小部分。

1. 在冰上，加入表1中所列组分，为了，到2ml微量离心管中。
   注: 此金额是足够的8固体代理人，或者使用这里介绍，4代理人灌注生物反应器系统 。

表1中的ECM的细胞的制备。

2. 轻轻吹打混合，避免产生气泡。显示器采用酚红的DMEM 10倍的pH值。检查混合物为橙/粉红色指示的pH〜7。如果pH值太低（太多黄色），慢慢地在时间（〜5微升），直到达到适当的颜色添加额外7.5％的碳酸氢钠一滴。
   1. 保持冰混合物并迅速开展工作，以防止过早ECM聚合。

3.替代准备

1. 对于固体3D文化（ 图1A）:
   1. 使用无菌技术在细胞培养罩的工作，标号无菌8孔腔室载玻片的盖，以指示在代理人任何实验变异。
   2. 保持腔室载玻片在冰上，以防止过早的ECM聚合，缓慢地吸取100微升细胞中+ ECM混合物进入8孔腔室载玻片的每个孔中。
      注意:围绕井第一边缘移液细胞中+ ECM混合物有助于在阱更好地分布细胞中+ ECM混合物。
   3. 在37℃，5％CO ₂的45分钟孵育代理人以允许ECM聚合。
   4. 以下的ECM聚合，加入100μl培养基添加至每个孔，并在37℃下孵育，5％的CO ₂在实验的持续时间，改变培养基每两天。
2. 一种用于在生物反应器系统（ 图1B）灌流3D培养:
   1. 消毒用于3D培养设置所有生物反应器组件（ 例如，生物反应器，管道，镊子，以及所需的生物反应器设置接头）用于使用特定的生物反应器的过程。
      1. 对于这里使用的实施例的生物反应器系统中，使用高压灭菌的组合（ 例如 ，12分钟曝光在121.1℃下15分钟干燥）和在70％乙醇温育1小时。
   2. 准备和组装生物反应器系统将容纳替代的部分。
      1. 对于这里使用的实施例的生物反应器系统中，插入一个PDMS泡沫骨架入的PDMS流动通道管使用镊子。推四（400微米）的聚合物涂层的不锈钢丝插入PDMS泡沫以生成平行微通道。
   3. 在细胞培养罩，使用与不孕È技术并与注射器26号针头，注入细胞中+ ECM混合物进入灌注生物反应器设计成包含细胞的区域。迅速进行到下一个步骤。
   4. 以确保更均匀的替代物内的细胞的分布，将生物反应器组件容纳代理人到50ml锥形管（细胞培养罩下）中并在〜18的转速连续旋转，同时在37℃下温育45分钟，以允许ECM聚合。
      注意: 循环可使用在孵化一个旋转器或具有内置旋转器，烤箱等炉中，在37℃的杂交来完成。
   5. 连接使用制造商的说明包含替代的灌注泵的生物反应器组件。
      注意: 此过程的细节将取决于生物反应器中发生变化和泵被使用。
      1. 对于这里使用的实施例的生物反应器系统，先取下不锈钢导线连接biorea构造函数装配到泵。
   6. 启动介质灌注（167.1微升/分钟的总体流动速率; 1达因/厘米²的微通道壁剪切应力），在37℃的恒温箱中，5％ _的 CO _2。
      注意: 介质灌注的速率可以调整，这取决于生物反应器的设置和目标和实验的设计。
   7. 继续介质灌注的实验的持续时间，改变培养基每七天。

4.替代固定和处理（图1C）

1. 标签cryomolds和替代固定和加工塑料组织录像带。
2. 接着，在检体处理凝胶，其是含水的材料，是在温暖的温度的液体，但在室温下凝固包住代理人。在加工过程中保持不变的代理人标本处理凝胶助攻和促进组织学切片^14,20-22。
   1. 熔融试样在60℃的水浴处理凝胶液化它，保持在该温度下，直到准备使用。移动生物反应器代孕到生物安全柜。
   2. 吸管大约300μl的样本处理凝胶入标记cryomold（ 图1C，左图）的底部。
   3. 使用手术刀刀片（10号优选的）和镊子小心地从生物反应器中或从8孔腔室载玻片的阱除去代理，并将其放置到含有检体处理凝胶的cryomold。
      注意: 组织标记染料 （参见材料/设备一览表的具体例） 的不同颜色可用于标记替代物，从而允许包含在可识别的方式在一个组织盒多个样品。
   4. 吸管大约300μl的检体处理凝胶覆盖在cryomold代孕并在4℃下孵育30分钟到solidif年。
   5. 一旦检体处理凝胶已经凝固，取出含有来自cryomold代孕的检体处理凝胶，并将其放置到组织盒中。
3. 放置装有代孕成10％的中性缓冲的福尔马林10至12小时在室温下将组织盒，以允许完全固定。
4. 固定后，将包含替代70％的乙醇，直至加工成石蜡组织盒。
   注: 从福尔马林转移替代乙醇防止过 ​​度固定用福尔马林这可能会导致某些抗原决定簇²³免疫反应的损失。的时间在乙醇的长度不是关键的。如果代理将被用于免疫组织化学或免疫荧光固定液这种变化是非常重要的。固定代理现在准备处理石蜡（ 图1C，中图）。这个处理是在位于一个APPR的组织处理器通常执行opriately配备实验室组织学检查。更短的程序，由于规模和代理人的细腻性建议^。24

5.切片和H＆E染色（图1C，右图）

1. 以下的替代物的处理，以石蜡块，部分他们使用标准切片为福尔马林固定，石蜡包埋组织^24,25的切片。
   注: 这可以在一个合格的组织学实验室中进行，或在一个研究实验室，如果适当的装备和丰富的经验。的组织学切片的厚度可以根据预期用途的章节的变化;然而，我们通常使用5微米厚切片。在灌注代理人这里使用的PDMS的泡沫容易用切片机切片。
2. 放在平光组织切片部分。
3. 切片后，烘烤在58℃下的组织切片为10-12小时，染色准备行HE（H＆E）。烘烤融石蜡和也允许部分以载玻片更好粘附。
4. H＆E染色:
   1. 设置在表2中科普林罐或玻璃染色皿中所述的站，这取决于滑动染色的数量。一旦试剂成立，通过各台移动的部分中，在顺序，孵育低于²⁴指示的时间。
   2. 挂载盖玻片使用安装媒体每张幻灯片。
   3. 允许安装媒体成像之前干燥。

表2. H＆E染色。

6.测量细胞密度

1. 图片至少一个完整的H＆E染色组织学用明在显微镜放大400倍，保存图像为.TIF文件替代的部分。
   注意: 所述的图像处理仅被使用的彩色图像完成。虽然未经测试，我们相信同样的处理也应适用于灰度图像。
2. 从Broad研究所^{26（http://cellprofiler.org/download.shtml）}和从ImageJ的美国国立卫生研究院（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html），两者的下载CellProfiler这是公开免费提供。
3. 为了测量每幅图像在代理领域，开放的ImageJ，选择"设置测量"（以下简称"分析"选项卡下），选择"区域"，然后选择"好＆＃34 ;.
4. 打开替代的图像（.tif文件）。使用ImageJ的多边形工具（参见图2），通过拖动鼠标，点击使锚点轮廓图像中的替代的面积。使用ECM的边缘作为指导。一旦概述，选择"测量"的"分析"选项卡下。

图2. ImageJ的分析。 ImageJ的处理的屏幕截图。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 重复该组织代理的每个图像。保存测量结果和相应的图像识别到电子表格程序。
6. 通过上传图片文件拖动到"文件列表"用于ImageJ的测量面积为CellProfiler图像文件。指定一个名称中导入的图像在"NamesAndTypes"输入模块，并选择图像类型（即 "彩色图像"）。

图3. CellProfiler例如管道。管道用来测量CellProfiler有核细胞数的截图。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 创建一个分析管道，包括以下模块计算每个图像细胞的数量，通过点击"+"号旁边的"调整模块"（ 图3，在左侧面板的底部）。添加下面的每个模块。
   1. 选择"ColorToGray"（ 图4）。
      1. 从下拉菜单中选择输入图像的名字，命名输出图像，然后选择原稿图像类型（<EM>也就是说，如果RGB彩色图像输入）。
         注意: 如果使用灰度图像不会需要这个模块
   2. 选择"ImageMath"（ 图5）。
      1. 选择"反向"操作，命名输出图像，并在"先选择图像"选项卡中选择灰度图像。
   3. 选择"IdentifyPrimaryObjects"（ 图6）。
      1. 选择输入图像（数学校正后的图像），命名要确定的主要目的（核），并进入直径范围为在像素单元被测定对象（大约25到65）。选择"自适应"门槛战略，"大津"阈值法"三班"。不要更改默认设置任何其他参数。
         注: 直径的最优的范围应当由输入图像模块在打开图像和测量核的直径（即确定，主要目的）使用测量长度的工具。
   4. 选择"IdentifySecondaryObjects"（ 图7）。
      1. 选择输入图像（数学修正后的图像），选择输入对象（核），并命名对象识别（细胞）。选择"传播"的方法来确定二级对象，请使用"两班"最小化"加权变化"中的"自适应"门槛战略和"大津"的方法。选择"不平滑"和1的阈值修正系数，降低和的0和1的上限，以及0.05的正规化因子。不要更改默认设置任何其他参数。
   5. 选择"MeasureObjectSizeShape"（ 图8）。
      1. 选择细胞（次要对象）和细胞核（主对象）作为对象进行测量。
   6. 选择"FilterObjects"（ 图9
   7. 命名输出对象，并选择核（主对象）作为筛选的对象。
   8. 保持接下来的两个参数按默认设置。选择"AreaShape"作为测量按类别进行过滤，而"FormFactor公司"作为测量。
   9. 选择"是"过滤用最小测量值，并添加0.52最小值。
   10. 选择"否"来过滤用最大测量。
   11. 选择"是"保留过滤的对象的轮廓并命名概述形象。
8. 选择"ExportToSpreadsheet"（ 图10）
   1. 选择保存文件并命名为"输出文件"。
9. 分析管道中产生（步骤6.7.1至6.7.7.1）以后，在CellProfiler启动"测试模式"和评估每个步骤，包括在测试图像中的细胞核被适当地过滤，以确保最佳的巴rameters被选择，以确定细胞。 图11示出了从CellProfiler下列筛选，其中核被正确识别（绿色圆圈）的输出图像，并且背景滤出。
10. 一旦参数进行评估，并确定为足够，保存项目，然后单击"分析图像"。该项目可反复使用，供日后分析。
    注意: 一旦参数已经确定，程序设置来分析所有图像中的"文件列表"，按顺序。这将导致在多个窗口中打开用于分析的每个图像，从而导致较长的处理时间。
    1. 为了避免更长的处理时间，点击"分析模块"部分下的所有除"ExportToSpreadsheet"模块的眼睛图标。
11. 一旦所有的替代图像已经被CellProfiler处理，打开包含图像数据由细胞产生的电子表格探查器和含有ImageJ的测量该地区的电子表格。复制过滤核数据（在CellProfiler电子表格列D）和图像识别（列R），并将其粘贴到包含实测面积数据的电子表格。
12. 计算所有对每代孕的图像核数目获得的测量的总和。
13. 计算从代理的每个图像的替代区域得到的测量值的总和。除以1×10 ⁶测得的总面积。
14. 通过在上述步骤中的总面积测量除以核的总数量，以获得细胞的每1×10 ⁶个像素²的数量的值。

图4. CellProfiler管道:改变形象 "ColortoGray"模块的灰度屏幕截图。小号://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图5. CellProfiler管道:"ImageMath"模块的反转图像截图请点击此处查看该图的放大版本。

图6. CellProfiler管道:"IdentifyPrimaryObjects"模块识别核截图请点击此处查看该图的放大版本。

图8. CellProfiler管道:"MeasureObjectSizeShape"模块的测量对象的屏幕截图，请点击此处查看该图的放大版本。

图9. CellProfiler管道:的"F 过滤对象截图ilterObjects"模块。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10. CellProfiler管道:"ExportToSpreadsheet"模块的输出数据屏幕截图，请点击此处查看该图的放大版本。

以下过滤图11. CellProfiler输出。下面的屏幕截图对象过滤输出画面细胞探查。 请点击这里查看大VERSI这个数字的。

两者都如上述和生长7天制备固体和灌注三维乳腺癌代理人。接着，替代物是固定的，加工以石蜡，切片，并用苏木精和曙红染色，如上所述。测定单位面积的有核细胞（包括231细胞和CAF）各代理的数量。如在图12中可以看出，H＆E染色的切片的代表性显微照片表明存在于比固体代理人（ 图12B）的灌注代理人（ 图12A）的细胞的浓度较高时，即使细胞的密度起初掺入的替代物在固体和灌注条件相同。细胞生长的这种可视表示被每面积（密度）细胞的较高的平均数目在灌注代理人支持（N = 3）相比，固体代理人（N = 3），如用t确定他CellProfiler分析（ 图12C）。以得到在图12C中的数据，每个代理的完整组织学横切片成像时，需要为每个代理多个图像，并且如上所述进行分析的图像。然后，核为每个代理的总数是由代理的总面积除以（表示为核/ 1×10 6个像素2的数量），从而为每个代理的细胞密度。来验证核细胞定量使用CellProfiler，采用CellProfiler程序的结果与通过简单地手动计数在每个6代理人（ 表3）的本单位面积的细胞数得到的那些进行比较。如上述计算出的各替代的细胞密度。无显著差异，在通过手动计数和CellProfiler分析或灌注代用品（p值= 0.855），或固体替代物获得的细胞密度实测值（ P = 0.553）。为了支持固态和灌注代理人之间的细胞密度的差异，在细胞生长的差异相关，每个代理的细胞增殖通过Ki-67标记（ 图12D）27的免疫组化分析评估。同样的趋势被发现，与在灌注的代理人增殖细胞的显著更高的百分比（n = 3时）相比，固体代理人（N = 3），这表明在灌注代理人要更高的生长速率，并与增加的细胞密度相关这些代理人。而细胞类型（ 即 ，乳腺癌上皮或CAF）没有在这些测量中进行评价，免疫染色细胞类型特异性标记物可以被用于更好地了解一个特定的细胞群体的生长或分布。协议详细介绍这个过程已经被先前公布的25,28。

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图12.代表性的成果。 A）从灌注替代品。B）从固体替代生长7天介质的H＆E染色部分代表图像的H＆E染色部分生长7天（400X原放大倍数）的形象代表，每2天更换（400X原始放大倍数）。13 C）单位面积，或细胞密度有核细胞的平均数的比较，随后的7天的生长后灌注（没有的媒体变化）和固体代理人的（介质每2天更换）。D）Ki-的比较67标记指数（ 即 ，细胞的一个群体中表达Ki-67的比例），细胞增殖的量度，以下灌流和固体代理人7天的生长。数据表示平均值±SEM，n = 3的每个条件，**表示P≤0.01和***表示P≤0.001（学生t检验）。tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

通过手动或CellProfiler分析3固体和3灌注代理人得到表3的细胞密度。

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。