我们展示了一种生成三维乳腺癌替代模型的方法，该模型可通过灌注生物反应器系统进行培养，以提供氧气和营养物质。在培养完成后，将替代模型固定并经处理制成石蜡包埋样本，用于评估相关参数。本文详细说明了其中一项参数——细胞密度的评估方法。
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摘要
摘要
三维（3D）培养是模拟细胞行为的一种更接近生理条件的方法 体外 优于二维培养。癌组织（包括乳腺癌组织）是由癌变的上皮细胞和基质成分（包括成纤维细胞和细胞外基质（ECM））构成的复杂三维组织。然而，大多数 体外 乳腺癌模型仅包含癌变的上皮细胞，忽略了间质成分，因此也缺乏肿瘤的三维结构 体内. 准确构建癌的三维模型对于深入理解肿瘤生物学特性、行为及其对治疗的反应至关重要。然而，由于培养环境中氧气和营养物质的供应受限，三维模型的培养时间及体积往往受到限制。本文介绍一种方法，将乳腺癌上皮细胞与间质成纤维细胞共同嵌入细胞外基质（ECM）中，构建包含间质成分的三维乳腺癌替代模型，该模型既可作为实体三维结构进行静态培养，也可利用灌注式生物反应器系统以持续供给氧气和营养物质。在完成初始构建和生长阶段后，该替代模型可用于临床前药物测试。此外，亦可通过调整模型中的细胞和基质组分，以研究多种生物学问题。培养结束后，模型样品经固定并按类似于临床乳腺癌标本的处理方式加工成石蜡包埋切片，用于后续目标参数的评估。文中以细胞密度这一参数为例，说明如何利用ImageJ和CellProfiler图像分析软件系统，对替代模型组织切片的显微照片进行分析，定量单位面积内有核细胞的数量。该指标可用于反映细胞数量随时间的变化，或不同培养条件及处理干预下细胞数量的改变情况。
引言
更准确模拟肿瘤结构和微环境的三维（3D）培养模型 在体 对于旨在解析细胞与其微环境之间复杂相互作用以及评估候选疗法有效性的研究具有重要意义。肿瘤的三维性影响氧气和营养梯度、药物暴露的均匀性、间质压力/血流以及三维结构1-4适当的间质微环境的存在有助于肿瘤的三维结构形成，并影响细胞与细胞外基质（ECM）之间的信号传导以及间质细胞与恶性上皮细胞之间的旁分泌信号交流。肿瘤三维结构及其微环境对细胞功能的影响已有充分研究，这两个因素均可改变细胞对药物的反应。1,3,5-8此外，二维（2D）培养与三维（3D）培养在细胞生长动力学、代谢速率和细胞信号传导方面存在差异，这些因素会影响细胞反应1,3,8-10.
体外实验中，可通过添加具有代表性的细胞外基质（ECM）组分和间质细胞群体来调控肿瘤替代微环境。恶性上皮细胞会受到细胞外基质以及肿瘤相关间质细胞的影响，这种影响可能是协同/保护性的，从而促进肿瘤进展；也可能是抑制性的，从而阻止肿瘤进一步扩散5,6,10。在这两种情况下，间质均可能通过旁分泌信号传导和/或通过增加肿瘤内的间质压力，影响治疗反应和药物递送效率，进而导致药物递送减少1,6。因此，在临床前模型中加入细胞外基质和间质细胞，将有助于重现那些在二维培养中难以有效模拟的肿瘤特征。
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方案
1. 细胞培养
- 将BM组分在4 °C条件下过夜解冻，置于冰上。
- 将培养基预热至37 °C。为同时支持231细胞和CAF的生长，使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
注意：所用培养基取决于细胞类型及实验目的。 - 从接近汇合的231细胞培养皿（10 cm）中移除培养基，加入1.5 ml胰蛋白酶/EDTA溶液。在37 °C孵育1至3分钟，并观察细胞脱落情况。一旦细胞开始变圆并从培养皿表面脱离，立即加入3 ml含血清的培养基以终止反应。用移液器将培养基和细胞转移至15 ml锥形管中。
- 在150 × g条件下离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml培养基中。
- 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对单位体积内的细胞数量进行计数。细胞活力应高于90%。
- 对拟用于类器官模型的其他细胞类型重复上述操作。对于本文所述的类器官模型，需对CAF细胞重复此过程。
- 根据目标细胞数量，确定每种细胞悬液所需的适当体积。
注意：对于本文所述的类器官模型，每100 µl细胞外基质（ECM）中接种2.1 × 106个细胞，上皮细胞与成纤维细胞的比例为2:1（即每100 µl ECM中含1.4 × 106个231细胞和7 × 10
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结果
按照上述方法制备了实体和灌注的3D乳腺癌模型，并培养7天。随后，按照前述方法将模型固定、脱水并包埋于石蜡中，切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色。测定每个模型单位面积内的有核细胞数量（包括231细胞和CAF）。如图12所示，H&E染色切片的代表性显微照片显示，尽管在初始构建时两种模型中的细胞密度相同，但灌注模型（图12A）中的细胞浓度明显高于实体模型（图12B）。这一细胞生长的视觉表现得到了CellProfiler分析结果的支持：灌注模型（n=3）单位面积内的平均细胞数量（密度）高于实体模型（n=3）（图12C）。为获得图12C中的数据，对每个模型的完整组织横截面进行成像，每个模型需采集多张图像，并按前述方法进行分析。然后，将每个模型的总核数除以其总面积（表示为每1×106像素2的核数），从而计算出每个模型的细胞密度。为验证CellProfile.......
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讨论
在此，描述了一种三维（3D）培养方法，该方法结合了组织微环境的组分，包括细胞外基质（ECM）和人源间质成纤维细胞，在更接近模拟人类乳腺癌的三维空间中，促进形成可重现的3D形态结构。所描述的3D培养方法相较于传统的二维（2D）细胞培养更能代表人类疾病状态，因其将多种细胞类型整合于三维的ECM空间中。已有研究指出，这些参数（即， 多种细胞类型、细胞外基质和三维结构为研究生物过程提供了更为恰当的环境，因为组织结构、微环境信号以及三维空间特性均被纳入考虑。 1,8其他3D培养方法此前已有描述，包括将细胞培养于3D基质上方的方法29，类球体的生成30悬滴培养31，以及微流控装置的使用32尽管这些系统各自具有独特的优势，但总体上均未能包含基质成分、间质细胞群体或具有代表性的三维结构。本文所述的三维培养方法包含了上述所有参数，并可利用生物反应器系统进行构建，从而实现较长时间的培养，而这是使用固体三维培养难以达到的。此外，灌注式支架相比固体支架可提供更佳的生长效果。
该方.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
阿拉巴马大学伯明翰分校代谢性骨病研究中心负责替代样本的组织学处理与切片工作。南方研究所（美国阿拉巴马州伯明翰市）为生物反应器系统的制造提供了支持。本研究由美国国防部乳腺癌研究计划（BC121367）提供经费资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco改良Eagle培养基1x（DMEM） | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 + 2.21 mM EDTA 1× | 康宁 | 25-053-CI | |
| 组织培养板，100 毫米 | CellTreat 科学产品 | 229620 | 无菌的 |
| 组织培养板，35 毫米 | CellTreat 科学产品 | 229638 | 用于PDMS泡沫的形成 |
| 9" 玻璃移液管 | Fisher | 13-678-20D | 无菌的 |
| 10 ml 移液管 | CellTreat 科学产品 | 229210B | 无菌的 |
| 1,000 µ移液器吸头 | FisherBrand | 02-717-166 | 无菌过滤 |
| 200 µ移液器吸头 | FisherBrand | 02-717-141 | 无菌过滤 |
| 10 µl 移液器吸头 | FisherBrand | 02-717-158 | 无菌过滤 |
| 15 ml 离心管 | CellTreat 科学产品 | 229410 | 无菌的 |
| 50 ml 离心管 | CellTreat 科学产品 | 229422 | 无菌的 |
| 1.5 ml 微量离心管 | FisherBrand | 05-408-129 | 无菌的 |
| 台盼蓝 | Corning Cellgro | 25-900-CI | 无菌的 |
| Sylgard 184 | 电子显微镜科学公司 | 24236-10 | PDMS 弹性体和固化剂。用于我们实验室自制的生物反应器。 |
| PDMS泡沫 | 由本实验室自制，用于本实验室的生物反应器。 | ||
| 高浓度牛I型胶原蛋白 | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| 生长因子减少型基质胶（基底膜） | 康宁 | 354230 | 基底膜材料 |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S8761 | |
| 分子生物学级水 | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Nunc Lab-Tek 培养皿腔室系统 | 赛默飞世尔科技 | 177402 | 8孔 |
| 生物反应器 | 自制 | ||
| 弹簧回弹304不锈钢—涂覆聚四氟乙烯聚合物 | McMaster-Carr | 1749T19 | 用于在我们自制设备中生成微通道的不锈钢丝 生物反应器系统。0.016" 直径 |
| BioPharm Plus 铂金固化硅胶泵管，L/S 14 | Masterflex | EW-96440-14 | 用于我们内部生物反应器系统。管道内径：1.6 mm，软管接头尺寸：1/16 in。 |
| 2-停位导管套装，非扩口型PVC，1.52 毫米内径 | Cole-Parmer | EW-74906-36 | 用于我们内部的生物反应器系统（配备微型蠕动泵）。 |
| 六通道精密微型蠕动泵 | Cole-Parmer | EW-74906-04 | 用于我们自主研发的生物反应器系统 |
| 结核菌素注射器 | BD医疗 | 309625 | 26 号 3/8 英寸针头；无菌 |
| 解剖组织镊 | FisherBrand | 13-812-36 | 5.5 英寸 |
| 迷你管旋转混匀仪 | Boekel Scientific | 260750 | 替代旋转设备选项。与适用于50 ml离心管的转盘（货号 260753）配合使用 |
| 50 ml 离心管转盘 | 博克尔科学公司 | 260753 | 与微型管旋转混合器配合使用 |
| Bambino 杂交炉 | Boekel Scientific | 230301 | 替代物旋转设备选项 |
| 组织学凝胶样本处理胶 | 赛默飞世尔科技 | HG-4000-012 | 步骤 5.2 中所述的标本处理凝胶 |
| 冷冻模具 | 安温科学 | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| 组织标记染料 | 癌症诊断公司 | 03000P | 可用于标记替代物， 可将多个样本放入同一个组织包埋盒中 |
| 铰链式组织包埋盒 | FisherBrand | 22-272-416 | |
| 甲醛 | Fisher | 23-245-685 | |
| GoldSeal 普通载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 3048-002 | |
| 二甲苯 | Fisher | X3P-1GAL | |
| 乙醇，200度（100%），USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| 苏木精 | 赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学 | 7211 | |
| 澄清器 | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| 蓝染液 | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| 伊红Y | 赛默飞世尔科技 Richard-Allan 科学 | 7111 | |
| Cytoseal XYL 封片介质 | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5G |
参考文献
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitr....
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