Method Article

发展与表征体外微血管网络和内皮的定量测量的[Ca 2+]我和一氧化氮含量

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

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1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

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原代人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 在微流控网络设备内生长并汇合。图示了内皮细胞连接处和 F-肌动蛋白分布，并在单个细胞水平实时量化了响应三磷酸腺苷 （ATP） 的细胞内钙浓度和一氧化氮产生的变化。

Abstract

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内皮细胞（EC）衬血管壁体内经常暴露于流动，但培养的内皮细胞通常在静态条件下生长并表现出促炎性表型。虽然微流体装置的发展已被工程师超过二十年被接受，其生物学应用仍然有限。通过生物 ​​应用验证更生理有关体外模型微血管重要的是推动该领域和桥体之间在体外研究的空白。这里，我们提出的详细程序为培养的微血管网络的使用微流体设备与长期灌注能力的发展。我们还使用共聚焦和常规荧光显微镜表明实时其在EC的[Ca 2+] i和一氧化氮（NO）产生的激动剂诱导的变化的定量测量的应用。所形成的微血管网连续灌注工作表明内皮之间发达结。 VE-钙粘蛋白分布更接近在完整微血管比静置培养乳油单层观察。 ATP诱导的EC瞬时增加钙离子浓度 i和NO的产生进行了定量的单个细胞的水平，这验证了培养微血管的功能进行测量。此微流体装置允许内皮细胞到良好控制，生理学相关的流，这使得细胞培养环境比更接近于体内在以往的，静态的2D培养下生长。所述微通道网络的设计是高度通用的，并且制造工艺简单，重复性好。该装置可以方便地集成到共焦的或常规的显微系统，使高分辨率成像。最重要的是，因为培养的微血管网络可以通过初级人内皮细胞来形成，这种方法将作为一个有用的工具来调查如何从病理患者样本改变血液成分影响人类内皮细胞，并提供深入了解临床的问题。它还可以被开发作为用于药物筛选的平台。

Introduction

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内皮细胞（EC）衬血管壁体内经常暴露于流动，但培养的内皮细胞通常在静态条件下生长并表现出促炎性表型1,2。微流体技术使得精确地控制流体通过几何约束微尺度（亚毫米）通道3，其提供了用于培养细胞的机会，特别是对血管内皮细胞，所需的流量的条件下生长。这些特点使得比常规的，静态的2D细胞培养更接近体内细胞培养条件。它们是当微流体装置用于模拟不同类型的脉管的，并研究EC响应机械和/或化学的刺激非常重要的。

尽管微通道网络在一个静态的细胞培养，生物医学F中的适应和微流体的应用表现出的优势ield仍然是有限的。通过最近的一篇综述报道，大部分该领域（85％）的出版物仍然是工程类期刊4。微流体装置的性能尚未足够的说服力大多数生物学家从当前技术切换诸如Transwell小测定和宏观尺度培养皿/载玻片该小型化的设备。微流控是一个多学科领域，需要跨学科的合作，以推动这一领域。本技术本文的目的是减少知识缺口学科之间，使制造程序可理解的生物学家，同时提供生物应用和微流体微血管功能验证。可视化实验方案包括微流体装置及其生物实用工具，它代表的工程师和生物学家之间的密切合作制造。

我们最近的一些报道使用体外微血管网络与微流体装置5生物学应用。为了适当地设计所述微通道网络的尺寸和应用所需的剪切应力，数值模型用计算流体....

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Protocol

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1.微流体设备制造

  1. 一个SU-8 50母模标准光刻制造
    1. 清洁前旋涂在硅晶片。冲洗，用丙酮进行15分钟，然后用异丙醇（IPA）15分钟的裸2英寸的硅晶片。通过在150℃下将其放置在热板上进行1小时脱水晶片。脱水后，冷却，在室温下的晶片。
    2. 旋涂用的SU-8光致抗蚀剂的硅晶片。加2ml的SU-8光致抗蚀剂到晶片上。斜坡晶片在100转/秒的加速度，持续10秒以500rpm，接着在300转/秒的加速度以1000rpm进行30秒。 （见补充视频1）
    3. 预烘烤的热板上的晶片在65℃下进行10分钟，然后软烘烤在95℃下30分钟。
    4. 用紫外线照射，以从薄膜掩模变换设计的图案，以旋涂光致抗蚀剂。上打印的薄透明膜作为膜掩模的图案。放置膜掩模上的顶旋涂光致抗蚀剂和暴露出的剂量为300mJ / cm 2的对紫外线。 （见补充视频2）
      注:在这个协议中，微通道网络模式（159微米宽的母亲渠道分支成四个100微米宽的女儿通道）的设计与CAD软件。在胶片上的图案示出为透明字段和膜的其余部分被黑色油墨覆盖。因为SU-8是一种负光致抗蚀剂，暴露于紫外线光致抗蚀剂的部分将是交联和模具​​开发（步骤1.1.6）期间变得不溶于溶剂。开发后，该不溶部分将复制设计的网络模式，并作为一个模具师傅。
    5. 后烘烤的热板上曝光晶片在65℃下1分钟，然后95℃10分钟。
    6. 开发模具师傅。使用SU-8开发者为....

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Results

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本节展示了一些与此协议开发的培养微血管网络所取得的成果。所述微通道图案是一个三级分支网络（ 图1A）。在此设计中，一个159微米宽的母信道分支成两个126微米宽的通道，和分支再次分成四个100微米宽女儿频道。进行三维数值模拟来估计的0.35微升/分钟的流速（ 图1B），这表明这微通道网络内的三个不同级别的剪切应力下的剪切应力分布。在微通道内的层流被预测为不干扰或二次流的存在下流体动力学稳定。一个SU-8母模用标准光刻工艺（ 图1C）制成后，一个PDMS设备通过软光刻制造以复制所述微通道网元twork设计成透明的，透气的支架（ 图1D - E）。 EC播种（ 图1F - G）后和连续灌注的3-4天，内皮细胞达到汇合，并成功地覆盖微通道的内表面。

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Discussion

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在这篇文章中，我们提出详细的协议为培养微血管网络的发展，EC路口和细胞骨架F-肌动蛋白分布特征，以及EC的定量测量钙离子浓度 且使用微流体装置NO的产生。灌注的微流体装置提供的体外模型，其允许在体内微血管几何形状和剪切流动状况的密切模拟。由于培养的微血管网络可以通过初级人内皮细胞来形成，这种方法可以作为一种有用的工具，调查从患者样品改变的血液成分如何病理影响由患者的血液样本的直接灌注人类内皮到培养的微血管和提供深入临床的问题。开发微血管人类内皮细胞也可以用于药物筛选，以避免在人类和动物的组织之间药物反应的潜在差异。

ve_content">在这个协议中所示的微流体装置的基板是玻璃盖玻片（150-180微米）旋涂的PDMS薄层。这种薄的PDMS层是用于高分辨率和活组织实时必不可少成像，因为较大的数值孔径物镜通常具有短工作距离。所述微通道（亚毫米范围）内的层流具有非常低的雷诺数，与压力差线性相关的流量，从而使剪切应力分布是完全依赖所述信道的几何形状，因此，它可以通过高精度的灌注泵20良好控制的，在我们目前的研究中，.......

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Disclosures

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作者没有利益冲突或利益冲突的披露。

Acknowledgements

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这项工作是由美国国家心脏，肺和血液研究所授予HL56237，糖尿病和消化研究所和肾脏疾病研究所DK97391-03，美国国家科学基金会（NSF-1227359和EPS-1003907）。

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Materials

软件名称

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
丙酮Fisher ScientificA929
活检穿刺Miltex33-31 AA 牛
白蛋白MP 生物医学810014
牛脑提取物 （BBE）LonzaCC-4098
盖玻片Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DA钙生化学251505
右旋糖聚糖Sigma-Aldrich31390
驴抗山羊 IgG （H+L） 二抗Life 技术A-11055
DPBS，无钙，无镁Gibco14190-250
DRAQ5（细胞核染色） Cell Signaling Technology4084
内皮细胞生长补充剂 （ECGS）Sigma-AldrichE2759-15MG
胎牛血清Gibco16000-044
纤连蛋白GibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
猪皮明胶Sigma-AldrichG1890-100G
庆大霉素 （50 mg/ml）Gibco15750-078
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-548B
玻璃巴斯德皮佩特VWR14672
来自猪肠粘膜的肝素钠盐Sigma-AldrichH3393-10KU
HEPES 缓冲盐水溶液LonzaCC-5024
人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）LonzaCC-2517
异丙醇 （IPA）VWR89125
L-谷氨酰胺 （200 mM）Gibco25030-081
哺乳动物林格溶液成分
NaCl （132 mM）Fisher ScientificS671-3
KCl （4.6 mM）Fisher Scientific科学P217-500
CaCl2 · 2H2O （2.0 mM）Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7 小时<>2 O （1.2 mM）Fisher ScientificM63-500
葡萄糖 （5.5 mM）Fisher ScientificBP350-1
NaHCO< >3 （5.0 mM）Fisher ScientificS233-500
Hepes 盐 （9.1 mM）Research Organics6007HHepes
酸 （10.9 mM）Research Organics6003H
MCDB 131培养基 Life 技术10372-019
多聚甲醛电子显微镜科学15710
鬼笔环肽（F-肌动蛋白染色）Sigma-AldrichP1951
磷酸盐缓冲盐水 Life technologies14040-133
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）道康宁公司Sylgard 184
手术刀Exel Int29552
透明胶带3M34-8711-3070-3
硅片VWR14672
SU-8 光刻胶MicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 显影MicroChemY020100
组织培养瓶Sigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100化学手册T6878
胰蛋白酶中和剂溶液GibcoR-002-100
胰蛋白酶/EDTA 溶液 （TE）GibcoR-001-100
管路Cole-ParmerPTFE 微孔管，0.012 英寸内径 x 0.030 英寸外径
VE-钙粘蛋白Santa Cruz 生物技术SC-6458
设备名称公司目录号评论/描述
生物安全层流罩NuAireNU-425 II 级，A2型
CCD 相机滨松ORCA
共聚焦显微镜LeicaTCS SL
干燥器Bel-ArtF42022
热板WenescoHP-1212
培养箱Forma Scientific3110
等高温烘箱Barnstead3608-5
光刻工作台Karl SussMA6 接触式光刻
光学显微镜NikonL200 ND &
公司名称目录号评论/描述
CAD软件AutodeskAutoCAD 2015
CFD仿真软件COMSOLMultiphysics 4.0.0.982
获取和分析NO产生的图像 Universal ImagingMetafluor
器 剂 供CCD照相机萨特仪器Lambda 10-2等离子清洗机PVA TePla/Harrick等离子体M4L/PDC-32G旋涂机Brewer Science Cee 200X注射器泵系统使用的Diaphod 300快门703005 成像

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

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Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

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