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方法文章

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

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DOI：

10.3791/54014

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2016年5月19日

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。

摘要

衬在血管壁上的内皮细胞（ECs） 体内 始终暴露于流动环境，但培养的内皮细胞（ECs）通常在静态条件下生长，并表现出促炎表型。尽管微流控装置的开发已被工程领域接受二十余年，其在生物学中的应用仍然有限。一种更具生理相关性的 体外 经生物学应用验证的微血管模型对于推动该领域发展以及弥合不同研究之间的差距至关重要 体内 和 体外 研究。本文介绍了利用具有长期灌注能力的微流控装置构建培养微血管网络的详细步骤。我们还展示了其在定量测量激动剂诱导的内皮细胞[Ca2+]i 以及使用共聚焦和常规荧光显微镜实时检测一氧化氮（NO）的生成。形成的具有持续灌注的微血管网络显示出内皮细胞间发育良好的连接结构。与静态培养的内皮细胞单层相比，VE-钙黏蛋白的分布更接近于完整微血管中的情况。ATP诱导的内皮细胞[Ca2+]i 并在单细胞水平上定量测量了一氧化氮的产生，从而验证了培养的微血管的功能性。该微流控装置可使内皮细胞在可控且符合生理条件的流动环境中生长，使细胞培养环境更接近于 体内 优于传统的静态二维培养。微通道网络设计具有高度的通用性，且制备过程简单、可重复。该装置可轻松整合至共聚焦显微镜或常规显微镜系统，实现高分辨率成像。最重要的是，由于培养形成的微血管网络可由原代人血管内皮细胞（ECs）构成，该方法将成为研究患者样本中病理改变的血液成分如何影响人血管内皮细胞的有力工具，并有助于深入理解相关临床问题。此外，该系统还可进一步开发为药物筛选平台。

引言

衬在血管壁上的内皮细胞（ECs） 体内 始终暴露于流动环境中，但培养的内皮细胞常在静态条件下生长，并表现出促炎表型1,2微流控技术能够通过几何结构受限的微尺度（亚毫米级）通道，实现对流体的精确控制。3，这为培养的细胞（尤其是血管内皮细胞）在理想的流动条件下生长提供了可能。这些特性使细胞培养条件更接近于 体内 优于传统的静态二维细胞培养。当微流控装置用于模拟不同类型的血管系统以及研究内皮细胞对机械和/或化学刺激的响应时，这一点尤为重要。

尽管微通道网络相较于静态细胞培养具有诸多优势，微流控技术在生物医学领域的应用与推广仍然有限。近期一篇综述指出，该领域大多数研究成果（85%）仍发表于工程类期刊4。对于大多数生物学家而言，微流控装置的性能尚不足以促使他们放弃现有的技术（如Transwell实验和宏观尺度的培养皿/玻片），转而采用这种微型化装置。微流控是一个多学科交叉领域，需要跨学科合作才能推动其发展。本文的技术目标是缩小不同学科之间的知识鸿沟，使生物学家能够理解微流控装置的制备流程，同时提供微流控微血管系统的生物学应用与功能验证。所展示的可视化实验方案涵盖了微流控装置的制备及其生物学应用，体现了工程师与生物学家之间的紧密协作。

我们最近报道了一些使用该技术的生物学应用 体外 微流控装置中的微血管网络

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方案

1. 微流控装置的制备

  1. SU-8 50 基模的标准光刻制备
    1. 在旋涂前清洁硅片。用丙酮冲洗一片裸露的2英寸硅片15分钟，随后用异丙醇（IPA）冲洗15分钟。将硅片置于热板上加热以脱水 150 °C 孵育1小时。脱水后，在室温下冷却晶圆。
    2. 将SU-8光刻胶旋涂于硅片上。在硅片上加入2 ml SU-8光刻胶，以100 rpm/sec的加速度加速至500 rpm，保持10秒，随后以300 rpm/sec的加速度加速至1,000 rpm，保持30秒。（见补充视频1）
    3. 在热板上预烘烤晶圆 65 °C 10分钟，然后软烘 95 °C 30 分钟。
    4. 使用紫外光曝光将设计好的图案从掩膜版转移到旋涂有光刻胶的基底上。将图案打印在薄的透明薄膜上作为掩膜版。将掩膜版置于旋涂光刻胶的表面，用300 mJ/cm²的剂量进行紫外光曝光。2. （参见补充视频2）
      注意：在本方案中，微通道网络图案（159 µm 宽大的母通道分支为四个 100 µm 使用CAD软件设计微流控芯片的宽子通道结构。薄膜上的图案显示为透明区域，其余部分被黑色油墨覆盖。由于SU-8是一种负性光刻胶，光刻胶中暴露于紫外光的区域将在紫外光照射下发生交联，并在模具显影过程中（步骤1.1.6）对溶剂不溶解。显影后，该不溶区域将复制所设计的网络图案，并作为主模具使用。
    5. 在热板上对曝光后的晶圆进行后烘....

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结果

本节展示使用本方案构建的培养微血管网络所获得的部分结果。微通道图案为三级分支网络（图 1A）。在此设计中，一条宽 159 µm 的主通道分支为两条宽 126 µm 的子通道，并进一步分支为四条宽 100 µm 的孙通道。通过三维数值模拟估算了在 0.35 µl/min 流速下的剪切应力分布（图 1B），结果显示该微通道网络内存在三个不同水平的剪切应力。预测表明，微通道内的层流在无扰动或次级流动的情况下呈流体动力学稳定状态。在采用标准光刻工艺制备 SU-8 原始模具后（图 1C），通过软光刻技术制备 PDMS 装置，将微通道网络结构复制到透明且透气的支架中（图 1D–E）。内皮细胞接种后（图 1F–G），经过 3–4 天的持续灌注，内皮细胞达到汇合状态，并成功覆盖微通道的内表面。

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讨论

本文中，我们介绍了构建培养微血管网络、表征内皮细胞连接及细胞骨架F-actin分布，以及定量测量内皮细胞[Ca2+]i 以及使用微流控装置进行一氧化氮（NO）的生成。灌注式微流控装置提供了一种 体外 模型，可实现对 体内 微血管几何结构和剪切流条件。由于培养的微血管网络可由原代人血管内皮细胞（ECs）形成，该方法可作为研究患者样本中病理改变的血液成分如何影响人血管内皮细胞的有力工具，通过将患者血液样本直接灌注于培养的微血管，有助于阐明临床相关问题。由人血管内皮细胞构建的微血管还可用于药物筛选，以避免人与动物组织在药物反应上可能存在的差异。

本方案所示的微流控装置基底为玻璃盖玻片（150–180 µm），其表面通过旋涂法覆盖一层薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。该薄层PDMS对于实现高分辨率及活体组织实时成像至关重要，因为数值孔径较大的物镜通常工作距离较短。微通道（亚毫米尺度）内的层流具有极低的雷诺数，压力差与流速呈线性关系，因此剪切应力分布仅取决于通道几何结构。由此，可通过高精度灌注泵实现精确控制。

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披露

作者声明无任何竞争利益或利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了国家心脏、肺和血液研究所资助项目HL56237、国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助项目DK97391-03、美国国家科学基金会（NSF-1227359 和 EPS-1003907）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ATPSigma-AldrichA2383
丙酮Fisher ScientificA929
活检打孔器Miltex33-31 AA
牛血清白蛋白MP Biomedicals810014
牛脑提取物（BBE）LonzaCC-4098
盖玻片Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
葡聚糖Sigma-Aldrich31390
驴抗山羊IgG（H+L）二抗Life technologiesA-11055
不含钙、不含镁的DPBSGibco14190-250
DRAQ5（细胞核染色） Cell Signaling Technology4084
内皮细胞生长补充剂（ECGS）Sigma-AldrichE2759-15MG
胎牛血清Gibco16000-044
纤连蛋白GibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
猪皮明胶Sigma-AldrichG1890-100G
庆大霉素（50 mg/ml）Gibco15750-078
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-548B
玻璃巴斯德移液管VWR14672
猪肠黏膜来源肝素钠盐Sigma-AldrichH3393-10KU
HEPES缓冲盐溶液LonzaCC-5024
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）LonzaCC-2517
异丙醇（IPA）VWR89125
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030-081
哺乳动物林格溶液成分
NaCl（132 mM）Fisher ScientificS671-3
KCl（4.6 mM）Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O（2.0 mM）Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7H2O（1.2 mM）Fisher ScientificM63-500
葡萄糖（5.5 mM）Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3（5.0 mM）Fisher ScientificS233-500
Hepes盐（9.1 mM）Research Organics6007H
Hepes酸（10.9 mM）Research Organics6003H
MCDB 131培养基Life technologies10372-019
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
鬼笔环肽（F-肌动蛋白染色）Sigma-AldrichP1951
磷酸盐缓冲液 Life technologies14040-133
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow Corning CorporationSylgard 184
手术刀Exel Int29552
透明胶带3M34-8711-3070-3
硅晶圆VWR14672
SU-8光刻胶MicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8显影液MicroChemY020100
细胞培养瓶Sigma-AldrichZ707503-100EA
曲拉通X-100Chemical BookT6878
胰酶中和液GibcoR-002-100
胰酶/EDTA溶液（TE）GibcoR-001-100
管路Cole-ParmerPTFE微孔管，内径0.012" × 外径0.030"
VE-钙黏蛋白Santa Cruz BiotechnologySC-6458
设备名称公司目录编号备注/说明
生物安全超净工作台NuAireNU-425 II级A2型
CCD相机HamamatsuORCA
共聚焦显微镜LeicaTCS SL
干燥器Bel-ArtF42022
加热板WenescoHP-1212
培养箱Forma Scientific3110
Isotemp烘箱Barnstead3608-5
光刻台Karl SussMA6接触式光刻机
光学显微镜NikonL200 ND & Diaphod 300
CCD相机快门Sutter InstrumentLambda 10-2
等离子清洗机PVA TePla/Harrick plasmaM4L/PDC-32G
旋涂仪Brewer ScienceCee 200X
注射泵系统Harvard Apparatus703005
软件名称公司目录编号备注/说明
CAD软件AutodeskAutoCAD 2015
CFD仿真软件COMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
一氧化氮生成的图像采集与分析 Universal ImagingMetafluor

参考文献

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

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重印与许可

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