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方法文章

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

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DOI：

10.3791/54014

⸱

2016年5月19日

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。

摘要

衬在血管壁上的内皮细胞（ECs） 体内 始终暴露于流动环境，但培养的内皮细胞（ECs）通常在静态条件下生长，并表现出促炎表型。尽管微流控装置的开发已被工程领域接受二十余年，其在生物学中的应用仍然有限。一种更具生理相关性的 体外 经生物学应用验证的微血管模型对于推动该领域发展以及弥合不同研究之间的差距至关重要 体内 和 体外 研究。本文介绍了利用具有长期灌注能力的微流控装置构建培养微血管网络的详细步骤。我们还展示了其在定量测量激动剂诱导的内皮细胞[Ca2+]i 以及使用共聚焦和常规荧光显微镜实时检测一氧化氮（NO）的生成。形成的具有持续灌注的微血管网络显示出内皮细胞间发育良好的连接结构。与静态培养的内皮细胞单层相比，VE-钙黏蛋白的分布更接近于完整微血管中的情况。ATP诱导的内皮细胞[Ca2+]i 并在单细胞水平上定量测量了一氧化氮的产生，从而验证了培养的微血管的功能性。该微流控装置可使内皮细胞在可控且符合生理条件的流动环境中生长，使细胞培养环境更接近于 体内 优于传统的静态二维培养。微通道网络设计具有高度的通用性，且制备过程简单、可重复。该装置可轻松整合至共聚焦显微镜或常规显微镜系统，实现高分辨率成像。最重要的是，由于培养形成的微血管网络可由原代人血管内皮细胞（ECs）构成，该方法将成为研究患者样本中病理改变的血液成分如何影响人血管内皮细胞的有力工具，并有助于深入理解相关临床问题。此外，该系统还可进一步开发为药物筛选平台。

引言

衬在血管壁上的内皮细胞（ECs） 体内 始终暴露于流动环境中，但培养的内皮细胞常在静态条件下生长，并表现出促炎表型1,2微流控技术能够通过几何结构受限的微尺度（亚毫米级）通道，实现对流体的精确控制。3，这为培养的细胞（尤其是血管内皮细胞）在理想的流动条件下生长提供了可能。这些特性使细胞培养条件更接近于 体内 优于传统的静态二维细胞培养。当微流控装置用于模拟不同类型的血管系统以及研究内皮细胞对机械和/或化学刺激的响应时，这一点尤为重要。

尽管微通道网络相较于静态细胞培养具有诸多优势，微流控技术在生物医学领域的应用与推广仍然有限。近期一篇综述指出，该领域大多数研究成果（85%）仍发表于工程类期刊4。对于大多数生物学家而言，微流控装置的性能尚不足以促使他们放弃现有的技术（如Transwell实验和宏观尺度的培养皿/玻片），转而采用这种微型化装置。微流控是一个多学科交叉领域，需要跨学科合作才能推动其发展。本文的技术目标是缩小不同学科之间的知识鸿沟，使生物学家能够理解微流控装置的制备流程，同时提供微流控微血管系统的生物学应用与功能验证。所展示的可视化实验方案涵盖了微流控装置的制备及其生物学应用，体现了工程师与生物学家之间的紧密协作。

我们最近报道了一些使用该技术的生物学应用 体外 微流控装置中的微血管网络5为了合理设计微通道网络的尺寸并施加所需剪切应力，采用计算流体动力学软件构建了数值模型，以精确估算流动轮廓。接种至微通道内的人原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）达到汇合状态， 即 在持续灌注3-4天后，细胞覆盖了微通道的整个内表面。通过VE-钙黏蛋白染色证实了屏障结构的正确形成，并与静态细胞培养条件下以及完整微血管中形成的屏障进行了比较。通过应用在单个灌注的完整微血管中建立的实验方案6-8，我们定量测量了内皮细胞[Ca2+]i 以及对三磷酸腺苷（ATP）刺激下内皮细胞内钙离子浓度和一氧化氮（NO）生成的荧光指示剂检测与共聚焦及常规荧光显微镜观察。激动剂诱导的内皮细胞[Ca2+]i 并且已有报道称，一氧化氮（NO）的生成是炎症介质诱导微血管通透性增加所必需的细胞内信号之一。6-15尽管之前的一些研究展示了DAF-2 DA负载的微流控装置的图像16,17，尚未实现出适当的分辨率和数据分析18据我们所知，本研究首次展示了激动剂诱导的内皮细胞内[Ca2+]i 利用基于微流控的系统进行一氧化氮（NO）的生成。

微加工技术能够灵活地制造小至几微米的微通道，并可构建复杂的图案以模拟特定几何结构 体内 微血管系统。在此展示了一个具有三级分支的典型微通道网络。该网络通过在微加工洁净室中进行的光刻技术与软光刻技术相结合的方法制备而成。

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方案

1. 微流控装置的制备

  1. SU-8 50 基模的标准光刻制备
    1. 在旋涂前清洁硅片。用丙酮冲洗一片裸露的2英寸硅片15分钟，随后用异丙醇（IPA）冲洗15分钟。将硅片置于热板上加热以脱水 150 °C 孵育1小时。脱水后，在室温下冷却晶圆。
    2. 将SU-8光刻胶旋涂于硅片上。在硅片上加入2 ml SU-8光刻胶，以100 rpm/sec的加速度加速至500 rpm，保持10秒，随后以300 rpm/sec的加速度加速至1,000 rpm，保持30秒。（见补充视频1）
    3. 在热板上预烘烤晶圆 65 °C 10分钟，然后软烘 95 °C 30 分钟。
    4. 使用紫外光曝光将设计好的图案从掩膜版转移到旋涂有光刻胶的基底上。将图案打印在薄的透明薄膜上作为掩膜版。将掩膜版置于旋涂光刻胶的表面，用300 mJ/cm²的剂量进行紫外光曝光。2. （参见补充视频2）
      注意：在本方案中，微通道网络图案（159 µm 宽大的母通道分支为四个 100 µm 使用CAD软件设计微流控芯片的宽子通道结构。薄膜上的图案显示为透明区域，其余部分被黑色油墨覆盖。由于SU-8是一种负性光刻胶，光刻胶中暴露于紫外光的区域将在紫外光照射下发生交联，并在模具显影过程中（步骤1.1.6）对溶剂不溶解。显影后，该不溶区域将复制所设计的网络图案，并作为主模具使用。
    5. 在热板上对曝光后的晶圆进行后烘烤 65 °C 1 分钟，然后 95 °C 10 分钟。
    6. 制备主模具。使用SU-8显影液作为溶剂去除未交联的光刻胶。将晶圆浸入SU-8显影液中3分钟，随后用异丙醇（IPA）冲洗1分钟。
    7. 重复此显影过程 2 至 3 次，直至异丙醇（IPA）冲洗后不再出现白色条纹（未固化光刻胶残留）。用氮气轻轻吹干晶圆，并在显微镜下检查图案的微小特征。如有必要，可追加进行额外的显影循环。
    8. 在热板上对晶圆进行坚膜处理 150 °C 15分钟。
  2. 软光刻
    1. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体的两部分（基础剂与固化剂）按质量比10:1手动混合均匀。
    2. 将PDMS混合物置于连接实验室真空泵的真空干燥器中脱气15分钟。将PDMS溶液浇注在光刻胶制成的主模具上。PDMS厚度需超过3 mm，以确保进样/出样管路的稳定固定。再次脱气15分钟，必要时用氮气去除残留气泡。将浇注后的PDMS置于烘箱中固化 65 °C 3 小时。
    3. 用透明胶带和等离子清洗仪（等离子处理30秒）清洁玻璃盖玻片表面。取未固化的PDMS溶液0.5 ml，以500 rpm/sec的加速度在盖玻片上旋涂，转速升至4,000 rpm，持续30秒。将旋涂有PDMS的盖玻片置于烘箱中固化 65 °C 至少 30 分钟。
    4. 将固化的PDMS从母模上切割并剥离。然后在母通道的远端使用直径为1 mm的打孔器创建进样口和出样口。
    5. 将装置与旋涂PDMS的玻璃盖玻片键合。使用等离子清洗仪对PDMS和盖玻片表面进行氧化处理1分钟。经氧气等离子体处理后，在键合面滴加一滴去离子水（DI水），并将两部分贴合。将装置置于烘箱中加热 65 °C 30分钟，以实现永久性结合。

半导体工艺、刻蚀装置、光刻胶涂布、制造方法、实验室技术
补充视频 1（右键单击以下载）。

实验人员戴着手套在实验室环境中操作光谱测量装置。
补充视频 2（右键单击可下载）。

2. 内皮细胞接种与培养

  1. 设备灭菌与纤连蛋白包被
    1. 保护进样口/出样口周围PDMS表面的疏水性，防止其氧化。用小条透明胶带覆盖进样口和出样口周围的PDMS表面，以防止氧化。该步骤可防止在填充过程中（2.1.3）去离子水在装置上表面扩散。
    2. 将PDMS装置用氧气等离子体处理5分钟，以改变其表面为亲水性，从而促进液体在微通道中的流动，并防止填充过程中气泡滞留（2.1.3）。
    3. 使用带针头的注射器或移液器从入口处向装置内注入去离子水。持续注水直至出现一滴去离子水（30-50 µl在出口处积聚的液体。在显微镜下检查装置，确认微通道内是否有气泡滞留。用纸巾轻轻吸除入口和出口处多余的水滴。
    4. 在超净生物安全台中，将装置置于培养皿内，用紫外光照射至少3小时进行灭菌。为防止蒸发，用一小片PDMS覆盖装置的入口/出口，在培养皿内放置一张湿润的纸巾，并用Parafilm密封培养皿。
    5. 用纤连蛋白包被装置。先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗装置，然后用纤连蛋白包被 100 µg/ml 纤维连接蛋白，4℃过夜4 °C在入口处滴加一滴溶液，然后使用实验室真空泵、带针头的注射器或移液器在出口处产生负压。
    6. 用细胞培养基填充装置。在加入细胞培养基之前，手动用 PBS 冲洗装置 3 次。将装置置于培养箱中预热至 37 °C.
  2. ECs 接种与长期灌注
    注意：与传统的静态二维内皮细胞（EC）培养相比， 体外 具有连续灌注的微血管网络模型使细胞培养环境更接近于 体内 条件。该 体外 本方案中展示的微血管网络可维持长达两周。通过精确控制的灌注，可持续补充营养物质、清除代谢废物，并防止内皮细胞单层过度融合。因此，该模型可拓展用于更长期的研究，以模拟不同生理和病理条件下的细胞与血流动力学环境。
    1. 将原代 HUVECs 与 HUVEC 培养基（MCDB 131）混合，并加入 8% 右旋糖酐（分子量 70,000）。右旋糖酐用于提高接种培养基的黏度，从而获得更佳的细胞接种效果。推荐的细胞密度约为 2–4 × 106 cells/ml
    2. 将细胞接种到装置中。放置一个10-20 µl 在入口处滴加一滴细胞悬液。通过倾斜装置或在出口处使用玻璃巴斯德吸管利用毛细作用引入轻微流速。成功加载细胞的关键在于控制最小通道内的流速低于1 mm/s。
    3. 检查细胞接种情况。初次接种后，在5% CO₂湿润环境中孵育装置15-20分钟。2 在 37 °C在显微镜下检查接种状态前完成上述操作。如有必要，可进行额外的细胞加样以达到理想的细胞密度。
    4. 用细胞培养基轻轻冲洗装置（37 °C）以去除葡聚糖。将装置置于培养箱中，在无流动条件下培养前6小时（5% CO₂2 在 37 °C).
    5. 建立用于长期灌注的管路连接。将装置用胶带固定于培养皿中，以防止移动。在培养皿盖上打两个小孔，用于插入进液和出液管路。将进液管路连接至装有针头的注射器，用于细胞培养基的灌注；将出液管路连接至废液收集装置。
      注意：将装置和废液收集器置于细胞培养孵箱内，而灌注泵置于孵箱外，通过较长的进液管路与装置连接。灌注速率根据实验设计确定。在本装置中，采用的灌注速率为 0.35 μl/min 以及1-2 dyne/cm之间的剪切应力范围2在此灌注条件下，HUVECs 约 3–4 天达到汇合。

3. 免疫荧光染色

  1. 通过灌注 2% 多聚甲醛在 4 °C 下固定装置中的内皮细胞 30 分钟，随后在室温下用 1× PBS 冲洗 15 分钟，并用 1% BSA 封闭 30 分钟。灌注速率应与细胞培养时所用速率相同。
  2. 使用 0.1% Triton X-100 对固定的内皮细胞进行通透处理，以便进行抗体染色。灌注 Triton 进行染色：标记 VE-钙黏蛋白时灌注 5–7 分钟，标记 F-肌动蛋白时灌注 3 分钟。
  3. 将抗体加入装置中。先灌注 1× PBS 15 分钟以洗去前一步溶液。手动将抗 VE-钙黏蛋白的一抗（抗山羊）以 2 µg/ml 的浓度（总体积为 20–50 µl）加入装置中，将装置置于 4 °C 冰箱中孵育过夜。随后使用注射泵灌注二抗（驴抗山羊）以 7 µg/ml 的浓度孵育 45–60 分钟。
  4. 用鬼笔环肽标记内皮细胞的 F-肌动蛋白。在手动加入 10 µg/ml 的鬼笔环肽孵育 7–10 分钟前，先用 1× PBS 灌注装置 15 分钟。
  5. 对内皮细胞的细胞核进行标记（参见材料清单）。
  6. 用 1× PBS 冲洗装置，并在 4 °C 下保存直至成像。

4. 内皮细胞内[Ca2+]i的荧光成像

  1. 以含白蛋白（10 mg/ml）的林格氏液在 37 °C 下对装置进行灌注，持续 15 分钟。灌注速率应与细胞培养时所用速率相同。白蛋白-林格氏液中各组分的浓度详见材料列表。
  2. 建立用于内皮细胞 [Ca2+]i 成像的共聚焦系统，使用 fluo-4 AM 进行检测。采用共聚焦显微系统进行 Ca2+ 成像，激发光源为氩离子激光器（488 nm），发射波长范围设为 510–530 nm。使用 25 倍水浸物镜（NA: 0.95），以 512 × 512 扫描格式采集图像。设置 z 轴步进为 2 µm，每幅图像堆栈的扫描间隔为 20 秒。
  3. 在 37 °C 下以 fluo-4 AM（5 µM）灌注装置 40 分钟，随后用白蛋白-林格氏液冲洗管腔内的 fluo-4 AM。
  4. 采集加载了 fluo-4 的微血管图像。先连续采集 10 分钟的基础荧光图像，然后向装置中灌注 ATP（10 µM），并记录荧光强度（FI）变化，持续 20 分钟。

5. 一氧化氮生成的荧光成像

  1. 以白蛋白-林格液对装置进行灌注，持续 15 分钟。灌注速率应与细胞培养时所用速率相同。
  2. 建立荧光成像系统以检测 ATP 诱导的一氧化氮生成。使用配备 12 位数字 CCD 相机和计算机控制快门的显微镜进行一氧化氮测定。以 75 W 氙灯作为光源。
    注意：通过干涉滤光片（480/40 nm）、二向色镜（505 nm）和带通阻挡滤光片（535/50 nm）选择 DAF-2 DA 的激发和发射波长。使用 20X 物镜（数值孔径：0.75）采集图像。为最小化光漂白，在干涉滤光片前放置中性密度滤光片（0.5 N），并将曝光时间限制在 0.12 秒。
  3. 用 DAF-2 DA（5 µM）对细胞进行负载。在 37 °C 下以 DAF-2 DA 灌注装置约 35–40 分钟。初始负载后，记录 DAF-2 荧光强度（FIDAF）的基线值。
    注意：在整个实验过程中，DAF-2 DA 持续存在于灌注液中7。
  4. 采集 DAF-2 图像。以 1 分钟间隔记录 FIDAF 基线值 5 分钟。随后以 ATP（10 µM）灌注装置，并持续采集图像 30 分钟。所有图像应从同一群细胞的同一焦平面采集。

6. 数据分析

  1. 从采集的图像中手动选择感兴趣区域（ROIs），在单个细胞水平上进行。每个ROI覆盖一个单个细胞的区域，可通过荧光轮廓来标识。
  2. 扣除背景荧光，并计算每个ROI的平均荧光强度（FI）。
  3. 测量ATP诱导的内皮细胞[Ca2+]i变化和NO生成。通过计算Fluo-4荧光强度的变化（FI/FI0*100，其中FI0为加入ATP前白蛋白-Ringer液灌注期间的平均基线FI）减去测得的背景值，来量化ATP诱导的内皮细胞[Ca2+]i变化。通过对FIDAF随时间的一阶微分转换，量化NO生成速率。
    注意：FIDAF的时间进程反映了随时间累积的NO生成量。因此，NO生成速率的计算基于基础状态和ATP刺激条件下FIDAF的变化曲线。数据分析和实验步骤的详细信息已在先前发表的研究中描述7。

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结果

本节展示使用本方案构建的培养微血管网络所获得的部分结果。微通道图案为三级分支网络（图 1A）。在此设计中，一条宽 159 µm 的主通道分支为两条宽 126 µm 的子通道，并进一步分支为四条宽 100 µm 的孙通道。通过三维数值模拟估算了在 0.35 µl/min 流速下的剪切应力分布（图 1B），结果显示该微通道网络内存在三个不同水平的剪切应力。预测表明，微通道内的层流在无扰动或次级流动的情况下呈流体动力学稳定状态。在采用标准光刻工艺制备 SU-8 原始模具后（图 1C），通过软光刻技术制备 PDMS 装置，将微通道网络结构复制到透明且透气的支架中（图 1D–E）。内皮细胞接种后（图 1F–G），经过 3–4 天的持续灌注，内皮细胞达到汇合状态，并成功覆盖微通道的内表面。

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讨论

本文中，我们介绍了构建培养微血管网络、表征内皮细胞连接及细胞骨架F-actin分布，以及定量测量内皮细胞[Ca2+]i 以及使用微流控装置进行一氧化氮（NO）的生成。灌注式微流控装置提供了一种 体外 模型，可实现对 体内 微血管几何结构和剪切流条件。由于培养的微血管网络可由原代人血管内皮细胞（ECs）形成，该方法可作为研究患者样本中病理改变的血液成分如何影响人血管内皮细胞的有力工具，通过将患者血液样本直接灌注于培养的微血管，有助于阐明临床相关问题。由人血管内皮细胞构建的微血管还可用于药物筛选，以避免人与动物组织在药物反应上可能存在的差异。

本方案所示的微流控装置基底为玻璃盖玻片（150–180 µm），其表面通过旋涂法覆盖一层薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。该薄层PDMS对于实现高分辨率及活体组织实时成像至关重要，因为数值孔径较大的物镜通常工作距离较短。微通道（亚毫米尺度）内的层流具有极低的雷诺数，压力差与流速呈线性关系，因此剪切应力分布仅取决于通道几何结构。由此，可通过高精度灌注泵实现精确控制。

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披露

作者声明无任何竞争利益或利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了国家心脏、肺和血液研究所资助项目HL56237、国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助项目DK97391-03、美国国家科学基金会（NSF-1227359 和 EPS-1003907）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ATPSigma-AldrichA2383
丙酮Fisher ScientificA929
活检打孔器Miltex33-31 AA
牛血清白蛋白MP Biomedicals810014
牛脑提取物（BBE）LonzaCC-4098
盖玻片Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
葡聚糖Sigma-Aldrich31390
驴抗山羊IgG（H+L）二抗Life technologiesA-11055
不含钙、不含镁的DPBSGibco14190-250
DRAQ5（细胞核染色） Cell Signaling Technology4084
内皮细胞生长补充剂（ECGS）Sigma-AldrichE2759-15MG
胎牛血清Gibco16000-044
纤连蛋白GibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
猪皮明胶Sigma-AldrichG1890-100G
庆大霉素（50 mg/ml）Gibco15750-078
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-548B
玻璃巴斯德移液管VWR14672
猪肠黏膜来源肝素钠盐Sigma-AldrichH3393-10KU
HEPES缓冲盐溶液LonzaCC-5024
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）LonzaCC-2517
异丙醇（IPA）VWR89125
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030-081
哺乳动物林格溶液成分
NaCl（132 mM）Fisher ScientificS671-3
KCl（4.6 mM）Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O（2.0 mM）Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7H2O（1.2 mM）Fisher ScientificM63-500
葡萄糖（5.5 mM）Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3（5.0 mM）Fisher ScientificS233-500
Hepes盐（9.1 mM）Research Organics6007H
Hepes酸（10.9 mM）Research Organics6003H
MCDB 131培养基Life technologies10372-019
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
鬼笔环肽（F-肌动蛋白染色）Sigma-AldrichP1951
磷酸盐缓冲液 Life technologies14040-133
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow Corning CorporationSylgard 184
手术刀Exel Int29552
透明胶带3M34-8711-3070-3
硅晶圆VWR14672
SU-8光刻胶MicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8显影液MicroChemY020100
细胞培养瓶Sigma-AldrichZ707503-100EA
曲拉通X-100Chemical BookT6878
胰酶中和液GibcoR-002-100
胰酶/EDTA溶液（TE）GibcoR-001-100
管路Cole-ParmerPTFE微孔管，内径0.012" × 外径0.030"
VE-钙黏蛋白Santa Cruz BiotechnologySC-6458
设备名称公司目录编号备注/说明
生物安全超净工作台NuAireNU-425 II级A2型
CCD相机HamamatsuORCA
共聚焦显微镜LeicaTCS SL
干燥器Bel-ArtF42022
加热板WenescoHP-1212
培养箱Forma Scientific3110
Isotemp烘箱Barnstead3608-5
光刻台Karl SussMA6接触式光刻机
光学显微镜NikonL200 ND & Diaphod 300
CCD相机快门Sutter InstrumentLambda 10-2
等离子清洗机PVA TePla/Harrick plasmaM4L/PDC-32G
旋涂仪Brewer ScienceCee 200X
注射泵系统Harvard Apparatus703005
软件名称公司目录编号备注/说明
CAD软件AutodeskAutoCAD 2015
CFD仿真软件COMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
一氧化氮生成的图像采集与分析 Universal ImagingMetafluor

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