该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。
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摘要
摘要
肺系分化需要整合复杂的环境信号，包括生长因子信号传导、细胞间相互作用以及细胞-基质相互作用。in vitro条件下模拟肺发育以促进干细胞向肺上皮细胞分化一直具有挑战性。在本方案中，采用脱细胞肺支架模拟肺的三维微环境，从而生成干细胞来源的气道上皮细胞。首先通过拟胚体（EB）培养法联合激活素A将小鼠胚胎干细胞定向分化为内胚层细胞，随后将内胚层细胞接种至脱细胞支架上，并在气液界面培养长达21天。该技术无需额外添加生长因子，即可促进接种细胞分化为功能性气道上皮细胞（包括纤毛细胞、克拉拉细胞和基底细胞）。该培养体系成分明确、无血清、成本低廉且可重复。尽管培养过程中可能存在少量非肺源性内胚层谱系的污染，但本方案仅能生成气道上皮细胞群体，无法产生肺泡上皮细胞。利用该方案生成的气道上皮可用于研究肺器官发生过程中的细胞-基质相互作用，也可作为囊性纤维化等气道相关疾病的疾病建模或药物筛选平台。
引言
多能细胞向肺系定向分化的进程依赖于微环境中精确的信号事件 1,2由于该过程具有动态性，准确模拟肺器官发生的具体事件一直具有挑战性 体外近期有研究报告采用逐步谱系限制策略，通过在二维培养中添加可溶性生长因子，实现肺部分化3-8在逐步分化方案中，无论胚胎干细胞（ESC）还是诱导性多能干细胞，均首先被分化为定型内胚层。随后，这些内胚层细胞进一步被诱导为前内胚层命运，并最终分化为肺前体细胞，后者可通过表达含同源结构域的转录因子NKX2-1进行鉴定。这些肺前体细胞在持续添加生长因子的条件下，可进一步分化为近端（气道）或远端（肺泡）肺上皮细胞。此类二维培养策略在生成肺上皮细胞方面已取得一定成效，但仍存在若干局限性，包括分化效率不明确、可能受到其他内胚层谱系污染、缺乏三维（3D）结构，以及在某些情况下使用含血清的未明确定义培养体系。将多能干细胞或已分化细胞培养于去细胞化肺支架上，正日益被用作评估接种细胞形成肺上皮结构再生潜能的一种实验方法。3,5,6,8,9此类报道将细胞接种于支架上，并持续添加生长因子或血清。
肺的发育涉及单个细胞在环境信号作用下的分裂、迁移、基因表达及分化。细胞外基质（ECM）是由糖蛋白构成的网状结构，除提供结构支持外，还通过整合和调控上述过程来引导组织形态发生。10,11利用肺ECM支架作为内胚层培养的天然平台，以更真实地模拟 体内 肺发育微环境....
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方案
动物实验按照病童医院研究所动物护理委员会的指导原则进行。
1. 支架制备
- 肺的脱细胞化
- 使用 CO2 舱对成年Wistar大鼠实施安乐死。将动物放入舱内，以每分钟10-30%舱体积的充气速率开始100% CO2暴露。
- 观察动物是否失去意识，通常在约2-3分钟后发生。若在此期间未出现意识丧失，请检查充气速率和舱体密封性。在动物失去意识后，观察其眼球颜色是否变浅以及是否停止呼吸。若两者均出现，则继续维持CO2充入1-2分钟，随后将动物从舱中取出进行后续操作。
- 将动物四肢固定于解剖台面，用70%乙醇喷洒胸部和腹部区域，并沿胸骨作纵向切口打开胸腔以暴露心脏和肺脏。
- 首先在膈肌上做小切口，使肺组织回缩，以降低刺破肺脏的风险。用缝线结扎下腔静脉，并用小型解剖剪在左心房处做一小切口。
- 使用预先准备好的10 ml注射器（配备25 G针头，内含含肝素的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（HBSS中含10 U/ml肝素）），通过将针头插入右心室开始肺灌注，推动缓冲液流经肺循环（流速为2 ml/min）。持续此操作，直至肺组织变为白色，且从左心房流出的液体变得澄清。
- 灌注完成后，暴露气管，并在靠近甲状软骨处插入塑料导管，用缝线固定导管位置。
- 通过将10 ml注....
- 使用 CO2 舱对成年Wistar大鼠实施安乐死。将动物放入舱内，以每分钟10-30%舱体积的充气速率开始100% CO2暴露。
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结果
如本方案所述，通过将接种的细胞在脱细胞肺支架切片上进行长期培养，可实现从定型内胚层向成熟气道上皮细胞的高效分化。建议在将脱细胞支架用于分化前，对其进行表征分析，以确保（1）宿主细胞被完全去除，以及（2）细胞外基质蛋白得以保留。脱细胞效果可通过苏木精-伊红（H&E）染色和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色进行组织学评估，如图1A所示。对支架进行高倍扫描电子显微镜（SEM）分析可确认宿主细胞的缺失以及基质结构的完整性，如图1B所示。此外，还可通过拉伸力学测试和基质蛋白免疫染色等方法对残留支架进行进一步表征，以确认脱细胞后细胞外基质（ECM）的完整性16。
在SFDM培养基中对ESC进行为期六天的非黏附培养，可形成细胞聚集体（类胚体，EBs），如图2A所示。经三天Activin A处理后，可诱导定型内胚层的生成。ES.......
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讨论
本方案仅使用天然肺支架引导胚胎干细胞（ESC）分化为成熟的气道上皮，无需其他补充成分。该培养体系成分明确、无血清、成本低廉且可重复。基础分化培养基中无需添加任何生长因子。此前发表的干细胞来源肺上皮细胞生成方法多采用二维培养策略，并依赖生长因子补充以促进谱系限定3,4,8,18,19。本方案在多个方面优于上述方法，包括：培养条件明确、向功能性气道细胞的分化效率高、其他内胚层谱系（如甲状腺、肝脏、胰腺）污染极少，以及提供三维分化微环境。该技术使用小鼠来源的细胞外基质（ECM）亦可获得类似结果，因此可修改为利用小鼠肺组织制备脱细胞支架。采用本方案将大鼠来源的胚胎干细胞分化为定型内胚层后接种至支架上，同样可分化为气道上皮。
脱细胞支架可在4 °C的去污染溶液中保存长达7天，之后再进行重新细胞化。保存时间更长的支架可能仍具有功能，但我们尚未进行测试以确认这一点。为了实现有效的组织形成和分化，需要在使用激活素A诱导后，通过FACS对定型内胚层细胞进行富集。第6天的胚胎体（EB）中若存在非内胚层细胞，常会表达多能性标志物Oct4，若将其接种到支架上，这些细胞将继续增殖，但无.......
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披露
不存在需要声明的相互竞争的财务利益。
致谢
我们感谢 Rossant 博士和 Bilodeau 博士提供了用于图 1-3所示实验的 Nkx2-1mcherry 胚胎干细胞。流式细胞分选（FACS）在 SickKids-UHN 流式细胞术中心完成。本研究得到了加拿大卫生研究院的运营资助以及加拿大创新基金会的基础设施资助（CSCCD）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 灌注液 | Sigma | H0777 | 10 U/ml 肝素 |
| 灌注液 | Gibco | 14170112 | 溶于汉克平衡盐溶液（HBSS-） |
| 脱细胞溶液 | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| 脱细胞溶液 | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| 脱细胞溶液 | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| 脱细胞溶液 | Gibco | 14190-144 | 溶于PBS |
| 苯并核酸酶 | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml 苯并核酸酶 |
| 苯并核酸酶 | Gibco | 14190-144 | 用PBS稀释 |
| 抗菌溶液 | Gibco | 15140 | 200 U/ml 青霉素-链霉素 |
| 抗菌溶液 | Gibco | 15290 | 25 μg/ml 两性霉素B |
| 抗菌溶液 | Gibco | 14190-144 | 用PBS稀释 |
| 胰蛋白酶消化 | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | IMDM与Ham’s改良F12培养基按3:1比例混合 |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Gibco | 12587-010 | B27补充剂（50倍稀释） |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Gibco | 17502-048 | N2补充剂（100倍稀释） |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Gibco | 15260-037 | 0.05%（V组分）牛血清白蛋白 |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Sigma | M6145 | 4 μM 巯基甘油 |
| 无血清分化培养基（SFDM） | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml 抗坏血酸 |
| 内胚层诱导 | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| 抗体 | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | 小鼠源，未偶联，1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | 大鼠源，PE-Cy7标记，1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | 大鼠源，APC标记，1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | 兔源，未偶联，1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 兔源，未偶联，1:200 |
| 层粘连蛋白 | Novus Biologicals | NB300-144 | 兔源，未偶联，1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | 山羊源，未偶联，1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | 山羊源，未偶联，1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | 小鼠源，未偶联，1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | 小鼠源，未偶联，1:500 |
| 山羊IgG | Invitrogen | A-11055 | 驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200 |
| 小鼠IgG | Invitrogen | A-21202 | 驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200 |
| 小鼠IgG | Invitrogen | A-31571 | 驴源，Alexa Fluor 647标记，1:200 |
| 兔IgG | Invitrogen | A-21206 | 驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200 |
| 兔IgG | Invitrogen | A-31573 | 驴源，Alexa Fluor 647标记，1:200 |
| 其他材料 | |||
| 低吸附培养板 | Nunc | Z721050 | 低细胞结合板， 6孔 |
| 气液界面膜 | Whatman | 110614 | 疏水性Nucleopore膜，孔径8 μm |
| 振动切片机 | Leica | VT1200S | Leica振动切片机 |
| 组织粘合剂 | Ted Pella | 10033 | Pelco组织粘合剂 |
参考文献
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell....
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重印与许可
