用脱细胞支架龙ESC衍生鼠气道上皮细胞的生成

摘要

该协议有效地引导小鼠胚胎干细胞衍生定形内胚层成熟呼吸道上皮细胞。这种分化技术使用的3维脱细胞肺支架直接肺谱系说明书中，在一个确定的，无血清培养的设置。

摘要

肺谱系分化需要复杂的环境线索，包括生长因子信号传导，细胞 - 细胞相互作用和细胞 - 基质相互作用的集成。由于这种复杂性， 在体外肺发育的重演，促进干细胞肺上皮细胞的分化已经挑战。在这个协议中，脱细胞的肺支架被用来模仿肺的3维环境，并产生干细胞衍生的呼吸道上皮细胞。小鼠胚胎干细胞首先分化为使用具有激活素A.内胚层细胞的胚状体（EB）培养方法的内胚层谱系，然后接种于脱细胞的支架，并在长达21天的空气 - 液体界面中培养。这种技术促进无需额外生长因子的补充接种细胞功能的气道上皮细胞（纤毛细胞，俱乐部细胞和基底细胞）分化。这种文化建立的定义，塞鲁M-免费，价格低廉，重现性好。虽然有有限污染来自非肺胚层谱系中培养，该协议仅产生呼吸道上皮人群和不引起肺泡上皮细胞。与此协议产生的气道上皮细胞可用于在肺器官发生和疾病建模或气道相关的疾病，如囊性纤维化的药物发现平台来研究细胞 - 基质相互作用。

引言

多能细胞对肺谱系定向分化是依赖于微环境^1,2-精确信号事件。由于此过程的动态本质，已经挑战模仿肺器官的准确事件体外 。最近的报道已经用于与二维培养物的可溶性生长因子补充分步进行谱系限制策略，实现肺分化^3-8。在步分化方案，多能细胞，是否胚胎干细胞（ESC）或诱导的多能干细胞，首先分化为定形内胚层胚层。内胚层细胞随后推到前部内胚层的命运和其后肺祖细胞，所确定包含同源结构域转录因子NKX2-1的表达。这些肺祖细胞进一步分化近端（气）或远端（肺泡）肺上皮细胞的Wi日继续生长因子的补充。这种2维策略曾在产生肺上皮细胞取得了一些成功，但也有一些限制，包括不明效率，从其它内胚层谱系可能的污染，缺少一个3维（3D）结构，并且在某些情况下使用未定义培养物血清补充。上脱细胞肺支架多能或分化的细胞的培养日益用作测定，以评估在形成肺上皮结构^3,5,6,8,9接种的细胞的再生潜能。这些报告接种文化与持续生长因子或血清补充支架的细胞。

龙开发涉及的划分，迁移，基因响应环境线索的表达和个体细胞的分化。细胞外基质（ECM）是糖蛋白的一个格子，除了提供结构支撑，引导Tissu酒店通过整合和调节这些过程^10,11ê形态。通过使用肺ECM支架作为天然平台内胚层培养，以更好地模仿体内肺发育环境，我们已经产生干以限定三维培养细胞来源的呼吸道上皮细胞具有高效率和再现性设置。

由脱细胞以及小鼠ESC衍生的内胚层细胞产生的大鼠肺的ECM支架生成并随后接种到这些支架。 CXCR4和C-KIT蛋白的表达双重指示定型内胚层细胞的身份和阳性细胞都SOX2和NKX2-1的表达被确定为气道（近端肺）祖细胞。定形内胚层细胞在空气液体界面（ALI）长达三周生成官能呼吸道上皮细胞在体外进行培养。

该协议促进defini肺系分化略去内胚层早7天，用NKX2-1 ⁺ / ⁺ SOX2早期肺癌近祖的出现观察。第14天，文化成熟的气道上皮细胞群的21冒出包括纤毛（TUBB4A ^+），俱乐部（SCGB1A1 ^+），和基底（TRP63 ^{+，KRT5 +）}细胞的形态和功能相似本地鼠标气道。这个协议说明了3D-基质微环境的实现健壮分化到呼吸道上皮细胞的重要性。

方案

动物实验按照医院的病童研究院动物护理委员会准则进行。

1.脚手架准备

1. 肺脱细胞
   1. 使用_二氧化碳安乐死室成年Wistar大鼠。放置动物在腔室，并以每分钟室体积10-30％的填充率开始100％的CO ₂的曝光。
      1. 观察动物的意识障碍;在此之后大约2-3分钟会发生。如果神志不清不这段时间内发生，检查填充率和腔密封。以下失去知觉，对于褪眼睛颜色和缺乏呼吸的观察动物。如果两者都观察到，保持_二氧化碳灌装1-2分钟，然后从室取出的动物的过程。
   2. 动物安全通过固定前爪和后腿解剖面，向下喷射的胸部和腹部地区用70％乙醇。进入心脏和鲁通过沿胸骨纵切口打开胸腔NGS。
   3. 通过隔膜使小切口首先以引起肺缩回，减少穿刺肺的机会。结扎与缝合下腔静脉，并将在左心房小切口小解剖剪刀。
   4. 使用准备好的10毫升注射器填充有肝素Hank氏平衡盐溶液（HBSS）（10U / ml肝素在HBSS）将25g针，通过将针插入右心室通过肺循环推缓冲器开始肺灌注（速率为2毫升/分钟）。直到肺部变为白色，并从左心房流动的流体运行明确继续此过程。
   5. 灌注之后，暴露气管导管插入接近甲状软骨的塑料导管和到位用缝线固定。
   6. 安装设定10毫升注射器固定在铁架台和夹子重力灌注系统。删除和Discard注射器推杆。安全注射器针筒的最大充装点在20厘米以上的肺。附加一个双向活塞在注射器的端部，和一个长塑料管向活栓递送脱细胞溶液到插管气管的另一端。倾溶液注入注射器中，并允许溶液以填充所连的塑料管和导管。
      1. 通过填充到肺总容量（约12毫升），持续1分钟灌洗肺和从气管去除塑料导管，以允许流体流出肺的。灌洗肺部时保持低于20厘米H ₂ O.压力不填注射器超过10毫升
   7. 肺部八次与脱细胞溶液的重复灌洗，然后用10漂洗用磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
   8. 解剖气管和肺部从颈部和胸腔游离并从动物取出。保持组织在冷PBS在4℃下直到用于vibratome本身制备ctioning。
2. 厚款代
   1. 制备约15毫升的2％和4％（重量/体积）琼脂糖，和足够6％（重量/体积）琼脂糖嵌入所有裂片成小的矩形块。通过微波溶解在PBS低熔点琼脂糖粉末。转移琼脂糖到50毫升管的热块上，并维持在40℃以上的温度，以避免凝胶。
   2. 在每个叶支气管分离用小剪刀每叶（颅，中间，附件，和尾部右边叶和左叶）的端部解剖脱细胞肺癌。专利使用吸收性片材以除去过量的PBS中，并放置内2％干每个叶（重量/体积）琼脂糖而加热块上。
   3. 在琼脂糖5分钟涂布后除去每个叶，放置在培养皿中并允许表面胶凝1分钟上的冷板。
   4. 轻轻地放在裂片放回4％（重量/体积）琼脂糖，凉5分钟后，用6％（重量/体积）琼脂糖再次重复涂布。
   5. 经过连续合作每个叶的阿婷，使用金属基体材料的模具周围从边缘的组织的琼脂糖至少3mm分别嵌入各叶6％（重量/体积）琼脂糖。东方每个叶使用镊子通过在面对实验者金属模具的表面定位瓣最大平坦的边缘。该边缘将是固定在试样板上vibratome切片的一侧。
   6. 允许块在冷板与vibratome切片之前胶凝至少30分钟。在4℃下在高达12小时的加湿室商店块vibratome切片之前。
   7. 设置的vibratome用冷PBS ¹²填充切片室。保持整个与周围的冰浴切片冷温度。从金属模具中取出的块，并使用刀片修剪下来过量琼脂糖周边波瓣，而从组织的边缘保持约3毫米。
   8. 使用黏合剂固定组织，以试样板中心，淹没板入T他PBS填充切片室。设置通过选择分别以下速度，幅度和厚度值切片上vibratome边界0.2毫米/秒，1.85毫米，350微米。
      注意:叶取向的两个纵向和横向部分是可以接受的。
   9. 每节完全叶。手动切割部免费使用小剪刀，如果一个部分没有完全由叶片在段序列的末端分离。轻轻收集支架部分，并保持在PBS在冰上，直到下一个步骤。
      注意:产生部分将包括在近端和远端肺领域和可用于recellularization两个来源;然而，大部分的表面的将包括远端肺。
3. 支架部分去污
   1. 从转移的PBS 350微米厚的支架部分，以离心管（最多30段/管）和核酸治疗（PBS中90 U / ml）的（见材料清单）12 - 在室温24小时，上一个旋转器。
   2. 以下核酸酶处理，用钳子向新的离心管中，并在无菌条件下的抗微生物溶液（200U / ml青霉素链霉素和25微克/毫升两性霉素B的PBS）6小时在RT，在旋转器上对待转印部。
      注意:支架可以在使用前被储存在抗微生物溶液在4℃最多一周℃。
   3. 在与抗菌液去污一步，冲洗支架用PBS两次无菌条件下并转移到无血清分化培养基（SFDM）与细胞接种前。

2，内胚细胞的制备

1. 定型内胚层诱导
   1. 保持使用条件2I ¹³无饲养层，无血清培养下鼠标ESC线。通过胰蛋白酶消化去除附着的多能干细胞培养开始内胚层诱导。
   2. 重悬SFDM和种子细胞以20,000密度细胞三天低附着板/ ml，未介质改为允许EB形成。
   3. 三天后轻轻用10毫升吸管的胚转移到50ml锥形管，让他们在底部收集在室温下3分钟。
   4. 小心吸媒体和补充新鲜SFDM媒体辅以50毫微克/毫升激活素A.
   5. 种子细胞返回到在1，低附着板:2密度和文化三天，才能达到最终的内胚层分化。
2. 定型内胚层的富集
   1. 收集日6 EBS，用胰蛋白酶分解，并结合使用荧光抗体标记¹⁴对c-KIT和CXCR4的表达。
   2. 使用这两种标志物的表达荧光激活细胞分选术（FACS）分类标记的细胞，以获得富集定形内胚层的人口^15。

3. R​​ecellularization设置

1. 气 - 液界面文化设置
   1. 转自SFDM每个支架脱细胞部分（步骤1.2.9）上使用无菌镊子疏水膜浮动（8微米孔径）。确保支架部分是对膜均匀地分布。
   2. 由分别与1或0.5毫升SFDM，填充井制备6-或12孔板中。轻轻地放在膜进入井，允许浮在介质顶部的膜，形成空气 - 液体培养设置。
2. 3D支架的播种
   1. 对于定型内胚层标志物（步骤2.2.2）以下FACS计数使用血球排序细胞，降速为400 XG在SFDM 5分钟，重悬。重悬的细胞以获得含有约100,000个细胞/ 10微升/支架的体积。
   2. 要recellularize支架，吸管10微升的细胞，直接到步骤3.1.2各准备一节。
   3. 在文化更换SFDM媒体每48小时。通过在稍微倾斜端着盘子吸出旧媒体为了避免破坏文化。慢慢的新鲜SFDM沿井的侧添加到文化，以防止浮膜下沉。
   4. 保持长达21天的气 - 液培养，实现种子细胞分化到成熟的气道上皮细胞。
      注意:Recellularized部分可以用于组织染色和免疫荧光（IF）显微镜在任何时间点的细胞培养¹⁶中进行处理。

结果

在本协议所述，定型内胚层分化稳健成熟的气道可以用脱细胞上的脚手架肺切片种子细胞的扩展培养来实现上皮细胞。建议将脱细胞支架的特征在于，以确保（1）的宿主细胞被完全除去，和（2）的细胞外基质蛋白在使用前支架分化保留。脱细胞可以通过组织染色用苏木精和曙红（H＆E）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行评估，如在图1A中所示。高倍率扫描电子显微镜（SEM）的支架的分析证实了不存在的宿主细胞和完整矩阵的体系结构，如在图1B中示出。通过拉伸试验和免疫染色对基质蛋白质的其余支架的附加特征可以被进行，以确保preservat以下¹⁶脱细胞ECM的离子。

在SFDM媒体胚胎干细胞六天结果， 如图2A所示的细胞聚集体（EBS）的形成的非贴壁培养。三天激活素的定型内胚层诱导的处理结果。 ESC的谱系限制定形内胚层可通过上调和内胚层谱系相关基因...

讨论

这里描述的协议产生只使用天然肺支架直接，没有其他补充了分化成熟的ESC源性上皮气道。这种文化建立的定义，无血清，价格低廉，重现性好。没有基础分化培养基中生长因子的补充是必要的。用于产生干细胞衍生的肺上皮细胞中以前发表的方法已使用2维的策略与生长因子补充，以促进谱系限制^{3,4,8,18,19。}此处所描述的技术是在这些方法中有几个原因，包括有利:定义培养条件下，分化效率高功能性气道细胞，从其它内胚层谱系（甲状腺，肝，胰腺）有限污染，和一个三维分化的微环境。这种技术产生了类似的结果与小鼠源ECM，因此可以进行修改，以生成用小鼠肺脱细胞支架。大鼠的胚胎干细胞分化成定型内胚层，并使用此协议也分化成上皮细胞气管接种于支架材料。

脱细胞的支架可被存储在去污溶液在4℃recellularization之前最多7天。支架保持更长的持续时间可能是功能性的，但是我们没有测试证实了这一点。为了实现高效的组织分化来说，需要FACS以下诱导激活素A.非内胚层细胞中6天胚常表达多能性标志物Oct4和如果支架播种将继续没有组织和规范的增殖，以丰富的定型内胚层肺血统。接种密度也可根据细胞系特异...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
灌注液	Sigma	H0777	10 U/ml 肝素
灌注液	Gibco	14170112	溶于汉克平衡盐溶液 （HBSS-）
脱细胞液	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
脱细胞溶液	Sigma	E9884	25 mM EDTA
脱细胞溶液	BioShop	SOD002	1 M NaCl
脱细胞溶液	Gibco	14190-144	溶于 PBS
Benzonase 核酸酶	Novagen	70664-3	90 U/ml 苯佐酶核酸酶
在 PBS 抗菌溶液中稀释的	Benzonase 核酸酶	Gibco	14190-144
	吉布科	15140	200 U/ml 青霉素链霉素
抗菌溶液	吉布科	15290	25 μg/ml 两性霉素 B
抗菌溶液	在 PBS 胰蛋白酶消化中稀释的	Gibco	14190-144
	Gibco	12605-028	TrypLE
无血清分化培养基 （SFDM）	Gibco	IMDM 2440-053，F12 11765-054	IMDM 和 Ham 的比例为 3：1s 改良型 F12 培养基
无血清分化培养基 （SFDM）	Gibco	12587-010	B27 添加剂（50 倍稀释）
血清分化培养基 （SFDM）	Gibco	17502-048	N2 添加剂（100 倍稀释）
血清分化培养基 （SFDM）	Gibco	15260-037	0.05%（组分 V）牛血清白蛋白
无血清分化培养基 （SFDM）	吉布科	35050-061	200 mM Glutamax
无血清分化培养基 （SFDM）	Sigma	M6145	4 μM 单硫甘油 无
血清分化培养基 （SFDM）	Sigma	A4403	0.05 mg/ml 抗碳酸
内胚层诱导	R&D	338-AC/CF	激活素 A
抗体
CDH1	BD Biosciences	610181	小鼠，非偶联，1：100
C-KIT	BD Biosciences	558163	大鼠，PE-Cy7,1：100
CXCR4	BD Biosciences	558644	大鼠，APC，1：100
KRT5	Abcam	ab24647	兔，非偶联， 1：1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	兔， 非偶联， 1：200
层粘连蛋白	Novus Biologicals	NB300-144	兔， 非偶联， 1：200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	山羊，非共轭，1：1,000
SOX2	研究 &D Systems	AF2018	山羊，非共轭，1：400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	小鼠，非偶联型，1：200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	小鼠，非偶联型，1：500
山羊 IgG	Invitrogen	A-11055	驴，Alexa Fluor 488,1：200
小鼠 IgG	Invitrogen	A-21202	驴，Alexa Fluor 488,1：200
小鼠 IgG	Invitrogen	A-31571	驴，Alexa Fluor 647,1：200
兔		A-21206	驴，Alexa Fluor 488,1：200
兔 IgG	Invitrogen	A-31573	驴， Alexa Fluor 647， 1：200
其他材料
低粘附板	Nunc	Z721050	低细胞结合板，  6 孔
气液界面膜	Whatman	110614	疏水核孔膜，8 μm 孔径
徕卡	振动切片机	VT1200S	Leica 振动切片机
纸巾胶粘剂	Ted Pella	10033	Pelco 纸巾胶粘剂