脑片中的全细胞膜片钳记录

摘要

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。

摘要

全细胞膜片钳记录是一种电生理技术，可用于研究神经元大部分区域的 电学特性。在此配置中，微电极与细胞膜形成紧密接触，防止电流泄漏，从而比先前使用的细胞内尖电极记录方法提供更准确的离子电流测量结果。传统上，全细胞记录可在多种制备类型的神经元上进行，包括细胞培养模型、离体神经元、脑片中的神经元，以及完整麻醉或清醒动物体内的神经元。总之，该技术极大地促进了人们对可兴奋细胞被动和主动生物物理特性的理解。该技术的一个主要优势在于，它能够实时提供特定干预（例如，药理学处理、实验者诱导的可塑性）如何改变特定神经元功能或通道的信息。此外，细胞膜的显著开放使得电极内溶液可自由扩散至细胞质中，从而可在不改变邻近细胞功能的情况下，将药物（例如，特定细胞内蛋白的激动剂或拮抗剂）引入细胞并靶向调控这些分子。本文将重点介绍在脑片神经元上进行的全细胞记录 ，这种制备方式的优势在于可在相对完整保存的脑环路中记录神经元活动，即在生理相关背景下进行研究。特别是 ，当结合适当的药理学手段时，该技术是一种强大工具，可用于识别在经历各种经验（如学习、药物滥用暴露和应激）后发生的特定神经适应性变化。总之，脑片中的全细胞膜片钳记录为在离体制备中检测完整清醒动物体内形成的神经元功能长期改变提供了有效手段。

引言

膜片钳技术是一种于20世纪70年代末发展起来的电生理学技术^1,2，是研究活体组织中单个或多个离子通道功能的主要工具。在可实现的不同膜片钳构型中，全细胞膜片钳记录能够用于研究神经元大部分区域的电学行为。传统上，该技术在体外（in vitro）进行，实验对象包括脑切片、新鲜分离的神经元或细胞培养模型³。当在脑切片中的神经元上实施该技术时，具有多项优势：（i）神经元所处的脑环路相对完整，与细胞培养制备物相比，在一定程度上提供了更具生理相关性的环境³，从而能够捕捉早期事件，甚至实时监测由任何类型的急性药理学干预所触发的细胞和分子事件——这种时间分辨率是经典在体（in vivo）条件下无法实现的；（ii）能够通过视觉识别脑切片中的特定脑区，从而对所研究的脑区以及表达荧光标记物的特定神经元实现高度区域特异性³；（iii）通过打开细胞质膜的较大区域，可进入细胞内空间（与使用尖锐微电极穿刺细胞膜进行细胞内记录的方法不同）⁴。这使得可以改变内液中特定离子的成分或浓度，从而在不同条件下研究分子靶点或细胞机制。例如，在建立全细胞构型后，任何可加入记录微电极（膜片钳电极）溶液中的特定药理学试剂（例如，拮抗剂）均可直接扩散至细胞质中，并作用于其潜在的细胞内靶点，而不会影响邻近细胞中的靶功能。此外，与尖锐微电极记录相比，膜片钳电极尖端的较大开口具有更低的电阻和更少的干扰噪声，因而能更有效地实现对细....

方案

所有实验均依照美国德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行，并选择适当方法以尽量减少实验动物所经历的压力、不适和疼痛。

1. 溶液

注意：请提前配制微量移液器内液。对于大多数基本实验需求，两种溶液即可满足要求：基于 Cs⁺ 的溶液和基于 K⁺ 的溶液。

1. 使用 Cs⁺基于的解决方案（例如，Cs⁺ 葡糖酸盐溶液，参见 材料用于电压钳实验。在室温下配制。
   1. 通过将 4.62 g D-葡萄糖酸（约 3.696 ml）与 3.54 g CsOH（约 2.01 ml）混合，配制 117 mM 铯-葡萄糖酸盐（Cs-Gluconate）溶液。
   2. 加入ddH₂O₂0 至 90 毫升 并使其平衡30分钟。
   3. 加入固体成分（20 mM HEPES = 0.476 g；0.4 mM EGTA = 15.2 mg；2.8 mM NaCl = 16.4 mg；5 mM 四乙基铵（TEA）氯化物 = 83 mg）。
   4. 加入ddH₂O₂O至约97毫升。
   5. 用50%的CsOH调节溶液pH至7.2–7.3。
   6. 检测渗透压，必要时用 ddH₂O 调整₂O.

结果

温度是实验者易于控制的一个因素，它会影响离子通道和受体的生物物理特性，从而影响突触后电流（PSCs，包括EPSC和IPSCs）的波形以及神经元产生动作电位的能力。 图3 和 图4 分别显示温度对神经元放电以及诱发电兴奋性突触后电流（eEPSCs）斜率的影响。放电模式（图3) (即，到达1的潜伏期^st 峰电位、峰电位数量、频率以及动作电位波形）由特定电压门控离子通道（Na⁺，Ca²⁺，以及 K⁺），该过程对温度敏感。 图3 显示平均尖峰数量随温度升高而增加。请注意，在此处描述的实验条件下（MSNs 记录），尽管在亚生理温度下尖峰频率似乎未发生改变，28 °C），当温度达到生理相关水平时，其显著增加32 °C). 图4A 显示了eEPSC斜率（常用于评估突触强度的一个参数）随温度升高而增加的示例。

.......

讨论

本方案描述了在脑片神经元上进行全细胞膜片钳实验的基本操作流程。然而，该技术的复杂性、潜力和敏感性无法在本文中得到全面阐述。在此，我们力求阐明最基本的步骤，并强调为获得成功且严谨的全细胞记录所必须控制的关键参数。为进一步深入理论学习，已有大量书籍和文章发表，内容涵盖脑片全细胞膜片钳记录技术^3,21-24，以及优化所用溶液以提高细胞存活率的方法^25-27。要常规性地完成高质量记录，需要通过大量实践来不断提升操作技能。尽管如此，只要正确实施上述步骤，即使在动物死亡数小时后仍可对细胞进行膜片钳记录，从而获得有关突触功能和固有兴奋性变化的重要信息。

一般来说，除了需要仔细配制人工脑脊液（ACSF）和细胞内微电极溶液外，从脑组织解剖、切片、形成成功的全细胞记录构型，到获得严谨且无偏倚的数据，每一步骤都需要大量练习。其中，制备出健康的脑片尤为关键。简而言之，应迅速完成脑组织的解剖（理想情况下 <45 秒）、切片过程中维持低温（0 - 2 °C）以及使用合适的切片液，均在保障细胞活性方面发挥重要作用。值得注意的是，不同实验室之间，以及根据所研究的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
孤立脉冲刺激发生器	A.M.P.I	Master-8
隔离单元（ISO-Flex）	A.M.P.I	ISO-Flex
计算机控制放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
数字采集系统	Molecular Devices	Digidata 1500
显微镜	Olympus	BX-51
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
灌流室及在线加热器	Warner Instruments	TC-344B
振动切片机	Leica	VT1000 S
微电极拉制仪	Narishige	PC-10
成像相机	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige 微电极拉制仪 PC-10	Narishige	PC-10
玻璃毛细管	WPI	TW150F-3
切片固定装置（琴弦式）	Warner Instruments	64-0255
切片孵育室	Warner Instruments	RC-26
非金属注射器针头	World Precision Instruments	MF28G67-5
注射器滤器	Nalgene	176-0045
热熔胶枪	Home Depot	various
气体分散管	Ace Glass Inc.	various
断头剪	Home Depot	100649198
3号手术刀柄	World Precision Instruments	500236
小型直头尖头剪	World Precision Instruments	14218
血管插管镊	World Precision Instruments	500453
弯头止血钳	World Precision Instruments	501288
经济型镊子 #3	World Precision Instruments	501976-6
刮刀	Fisher Scientific	14357Q
挖取式刮刀	Fisher Scientific	14-357Q
培养皿	Fisher Scientific	08-747B
滤纸	Lab Depot	CFP1-110
溶液
铯葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
D-葡萄糖酸 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
氢氧化铯（CsOH）50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl，2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES，20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
氯化四乙铵，5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
钾葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
K D-葡萄糖酸盐，120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl，20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES，10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
标准人工脑脊液（ACSF，渗透压 ≈ 300–310 mOsm）
KCl，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl，119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O，1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
葡萄糖，11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4·7H2O，1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2·2H2O，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
配制溶液所用的其他化合物
KOH	various
犬尿烯酸	Sigma Aldrich/various	K3375