脑片中的全细胞膜片钳记录

摘要

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。

摘要

全细胞膜片钳记录是一种电生理技术，可用于研究神经元大部分区域的 电学特性。在此配置中，微电极与细胞膜形成紧密接触，防止电流泄漏，从而比先前使用的细胞内尖电极记录方法提供更准确的离子电流测量结果。传统上，全细胞记录可在多种制备类型的神经元上进行，包括细胞培养模型、离体神经元、脑片中的神经元，以及完整麻醉或清醒动物体内的神经元。总之，该技术极大地促进了人们对可兴奋细胞被动和主动生物物理特性的理解。该技术的一个主要优势在于，它能够实时提供特定干预（例如，药理学处理、实验者诱导的可塑性）如何改变特定神经元功能或通道的信息。此外，细胞膜的显著开放使得电极内溶液可自由扩散至细胞质中，从而可在不改变邻近细胞功能的情况下，将药物（例如，特定细胞内蛋白的激动剂或拮抗剂）引入细胞并靶向调控这些分子。本文将重点介绍在脑片神经元上进行的全细胞记录 ，这种制备方式的优势在于可在相对完整保存的脑环路中记录神经元活动，即在生理相关背景下进行研究。特别是 ，当结合适当的药理学手段时，该技术是一种强大工具，可用于识别在经历各种经验（如学习、药物滥用暴露和应激）后发生的特定神经适应性变化。总之，脑片中的全细胞膜片钳记录为在离体制备中检测完整清醒动物体内形成的神经元功能长期改变提供了有效手段。

引言

膜片钳技术是一种于20世纪70年代末发展起来的电生理学技术^1,2，是研究活体组织中单个或多个离子通道功能的主要工具。在可实现的不同膜片钳构型中，全细胞膜片钳记录能够用于研究神经元大部分区域的电学行为。传统上，该技术在体外（in vitro）进行，实验对象包括脑切片、新鲜分离的神经元或细胞培养模型³。当在脑切片中的神经元上实施该技术时，具有多项优势：（i）神经元所处的脑环路相对完整，与细胞培养制备物相比，在一定程度上提供了更具生理相关性的环境³，从而能够捕捉早期事件，甚至实时监测由任何类型的急性药理学干预所触发的细胞和分子事件——这种时间分辨率是经典在体（in vivo）条件下无法实现的；（ii）能够通过视觉识别脑切片中的特定脑区，从而对所研究的脑区以及表达荧光标记物的特定神经元实现高度区域特异性³；（iii）通过打开细胞质膜的较大区域，可进入细胞内空间（与使用尖锐微电极穿刺细胞膜进行细胞内记录的方法不同）⁴。这使得可以改变内液中特定离子的成分或浓度，从而在不同条件下研究分子靶点或细胞机制。例如，在建立全细胞构型后，任何可加入记录微电极（膜片钳电极）溶液中的特定药理学试剂（例如，拮抗剂）均可直接扩散至细胞质中，并作用于其潜在的细胞内靶点，而不会影响邻近细胞中的靶功能。此外，与尖锐微电极记录相比，膜片钳电极尖端的较大开口具有更低的电阻和更少的干扰噪声，因而能更有效地实现对细胞内部的电学访问⁴。然而需要注意的是，电极尖端的较大开口可能导致细胞透析，从而造成细胞内分子机制的流失，而这些机制可能对正在研究的生物学现象的表达至关重要^5,6。在此情况下，尖锐电极记录可能更为合适。此类记录需使用孔径远小于全细胞记录所用电极的微电极，从而最大限度地减少细胞内空间与电极内溶液之间的离子交换。

任何形式的经历（急性或慢性），包括学习^7-10，滥用药物的暴露^11,12，应激^13,14, 等等。，可改变特定脑区神经元功能的多个方面。由于这些改变通常需要一定时间才能形成（数小时至数天），因此对经历特定经验的动物进行脑切片全细胞记录，可使研究人员识别出这些变化。基本上，参与神经元功能的许多（即使不是全部）组分例如、配体门控离子通道、电压门控离子通道、神经递质转运体）从而影响脑环路活动和行为，可因经验而发生改变（经验依赖性可塑性）^10,15-17在神经元层面，脑环路活动源于突触间持续不断的相互作用（例如，谷氨酸传递）和细胞内在兴奋性因素（例如，轴突-胞体-树突离子通道：钠、Na⁺；钾，K⁺；以及钙，Ca²⁺在特定条件下，利用全细胞膜片钳电生理技术，可分离出特异性来源于突触兴奋性与固有兴奋性变化的信号改变。

在大多数情况下，突触兴奋性通过全细胞电压钳技术进行评估. 这种记录模式可用于测量离子电流[例如，通过神经元质膜上的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPA受体）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA受体）介导，在膜电位钳制于设定电压的条件下进行。在此实验中，研究者使用含有铯（Cs⁺），一种广谱的 K 通道阻滞剂⁺ 通道（关键的内在兴奋性因素）。在建立全细胞构型后，Cs的扩散⁺ 在细胞内空间中会阻断K⁺ 通道，从而实现相对高效的空间钳制，并避免固有兴奋性因素对其他测量结果的影响。空间钳制问题， 即，当记录不规则形状的细胞时，全细胞电压钳制的难度会增加（例如，神经元），尤其是具有庞大而复杂树突分支的神经元^18,19由于体细胞电压钳对神经元树突树的电压控制效果较差，所研究的树突电信号的各个方面会以依赖于树突距离的方式发生扭曲。结合药物学工具（如匹罗毒素（γ-氨基丁酸，GABA）_A 受体拮抗剂）或犬尿酸（谷氨酸受体广谱阻断剂）溶解于细胞外溶液（人工脑脊液，ACSF）中，该技术可实现对谷氨酸受体和GABA_AR介导的电流。

相比之下，固有兴奋性通常在电流钳记录模式下进行评估。与电压钳记录不同，这种记录模式能够测量离子电流流经神经元质膜所引起的膜电位变化。通常，通过神经元产生动作电位能力的变化来评估固有兴奋性的改变，而动作电位的产生依赖于Na⁺和K⁺通道。因此，在进行电流钳记录时，微电极内填充含有K⁺而非Cs⁺的内液。结合在ACSF中溶解的阻断谷氨酸和GABA_A受体介导电流的药理学试剂，该实验设计可在不受突触兴奋性因素变化干扰的情况下，特异性地测量固有因素（例如，K⁺通道）对神经元放电活动的贡献。

本文将介绍实现以下目标所需的基本操作步骤：（i）制备健康的脑片；（ii）建立全细胞记录构型；以及（iii）监测基本参数，以评估突触和固有兴奋性。

方案

所有实验均依照美国德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行，并选择适当方法以尽量减少实验动物所经历的压力、不适和疼痛。

1. 溶液

注意：请提前配制微量移液器内液。对于大多数基本实验需求，两种溶液即可满足要求：基于 Cs⁺ 的溶液和基于 K⁺ 的溶液。

1. 使用 Cs⁺基于的解决方案（例如，Cs⁺ 葡糖酸盐溶液，参见 材料用于电压钳实验。在室温下配制。
   1. 通过将 4.62 g D-葡萄糖酸（约 3.696 ml）与 3.54 g CsOH（约 2.01 ml）混合，配制 117 mM 铯-葡萄糖酸盐（Cs-Gluconate）溶液。
   2. 加入ddH₂O₂0 至 90 毫升 并使其平衡30分钟。
   3. 加入固体成分（20 mM HEPES = 0.476 g；0.4 mM EGTA = 15.2 mg；2.8 mM NaCl = 16.4 mg；5 mM 四乙基铵（TEA）氯化物 = 83 mg）。
   4. 加入ddH₂O₂O至约97毫升。
   5. 用50%的CsOH调节溶液pH至7.2–7.3。
   6. 检测渗透压，必要时用 ddH₂O 调整₂O.
      注意：理想范围约为 280 - 285 mOsm。最佳渗透压应比标准人工脑脊液（ACSF）的渗透压低 15 - 20 mOsm（通常为 300 - 310 mOsm，本实验室为 300 mOsm）。渗透压可能因溶液的具体成分不同而有所变化。
   7. 分装至每份1,000 µl 并于 -20 °C 或更低温度下保存。
   8. 在记录当天制备、分装、冷冻并加入ATP/GTP至内液中。
      1. 将64.63 mg ATP加入10 mg GTP中，并溶于637.11 µl 去离子水₂O.
      2. 准备 10 µl 分装后于 -20 °C 或更低温度保存。实验当天，将每份 100 倍浓缩液与 1,000 µl 内液混合。一旦将 ATP/GTP 加入内液，需将其置于冰上保存，以防止 ATP/GTP 降解。
2. 使用 K⁺-为基础的解决方案（例如，K-葡萄糖酸盐溶液，参见 材料）适用于进行电流钳和电压钳实验，其中 K⁺ 电导功能保持正常，以便评估神经元放电活动。在室温下配制。
   1. 根据所需的最终体积称量所有材料。用于制备 90 ml 溶液 120 mM K-葡萄糖酸盐 = 2.81 g；20 mM KCl = 0.149 g；10 mM HEPES = 0.238 g；0.2 mM EGTA = 0.008 g；2 mM MgCl₂₂ = 0.021 g_.
   2. 使用足量的ddH₂O₂O以达到终体积的90%。这将确保留有足够空间用于pH值和渗透压的调节。
   3. 加入并混匀所有成分后，务必在测定pH前确保溶液澄清。
   4. 在持续搅拌溶液的同时，使用 K 调节 pH 至 7.2 - 7.3⁺ 氢氧化钾（KOH）
   5. 调节pH后，使用渗透压计将渗透压调整至280 - 285 mOsm。
      注意：最佳渗透压应比标准ACSF的渗透压低15 - 20 mOsm（通常为300 - 310 mOsm，本实验室为300 mOsm）。渗透压可能因溶液的具体成分不同而有所变化。
   6. 分装至每份1,000 µl 并于 -20 °C 或更低温度下保存。
   7. 在记录当天制备、分装、冷冻并加入ATP/GTP至内液（见步骤1.1.8）。
3. 配制1 L标准ACSF（参见 材料).
   注意：我们在实验室记录脑切片中的中等棘状神经元（MSNs）时使用此配方，但不同实验室的配方可能有所不同，因此建议实验人员使用在记录目标脑区时常规采用的配方。
4. 配制用于步骤 2.2 - 2.8 的解剖用人工脑脊液（切片溶液，约 125 ml。注意：精确体积取决于切片室的大小，应足以完全浸没脑组织）。
   1. 配制5 mM犬尿酸（用于阻断谷氨酸受体介导的兴奋性毒性过程）的正常人工脑脊液（ACSF），用量需足以浸没切片过程中的脑组织。使用超声仪助溶犬尿酸。
      注意：超声处理时间可能因溶液的体积和固体含量不同而有所变化。在本实验条件下，处理结束时溶液应变得澄清（约需1至2分钟）。
   2. 在95% O₂气流中冷却₂，5% CO₂₂ 将气体置于装有冰块的桶中，直至温度降至 0 - 2 °C。
5. 准备用于记录的ACSF。
   1. 取1升标准ACSF溶液（或步骤1.3中配制后剩余的溶液），可根据计划进行的实验加入适当的药理学试剂。
      1. 例如，在记录兴奋性突触后电流或电位（EPSCs 或 EPSPs）时加入 100 µM 荷包牡丹碱（picrotoxin）；在记录抑制性突触后电流或电位（IPSCs 或 IPSPs）时加入谷氨酸受体拮抗剂（犬尿酸，2 mM；或 50 µM D-APV 与 10 µM CNQX 联用）；在评估突触事件完全被阻断条件下的神经元放电活动时，则同时使用荷包牡丹碱和谷氨酸受体拮抗剂。

2. 切片制备

1. 构建或获取一个切片恢复室。
   注意：恢复室的设计原理简单，可在实验室中自行制备（图1）。简而言之，该室是一种容器，内置一个篮子，用于承载脑切片，使其位置低于人工脑脊液（ACSF）的液面。多家科学仪器公司也销售切片回收室。
   1. 例如，取四个环状物（高 4 - 6 mm）（图1A，侧面视图； B，俯视图）通过切割一个30 cc注射器制备。然后，将拉伸的网膜（例如，从尼龙软管上剪下）固定在环的一侧，用于固定脑切片（图1B）并将环状物粘合在一起。
      注意：可以使用热熔胶枪。
   2. 四个环固定粘合后，将一块弯曲的等腰梯形塑料壁粘合到其中两个环上（图1A 和 B) 以使氧气气泡从正在恢复的脑片中分流图1C 和 D）。随着 如图所示 图1D，将氧气扩散系统（此处为气体分散管）插入与塑料壁相同的一侧。
2. 切片前，用含氧气体（95% O₂₂/5% CO₂₂并将切片液（见步骤1.4）冷却至0 - 2 °C。
3. 将标准人工脑脊液（ACSF）加入定制的恢复室中，于室温下进行。在将脑片放入恢复室之前，确保ACSF充分氧合（20–30分钟，时间可能因恢复室体积而异）。确保气体气泡不直接接触脑片或对其造成扰动。
4. 用冰填满振动切片机的冰盒，并加入冷水，使切片室的三分之一到一半浸入水中。小心放置氧气输送系统（例如，气体弥散石）和温度探针置于切片室中，确保二者均不干扰刀片运动或切片操作。
5. 准备解剖脑组织及分离目标脑区所需的解剖区域和工具。
   注意：具体实施的解剖操作将取决于所研究的特定脑区，因为不同的脑结构需要在不同的切面上进行切片例如，冠状面、矢状面或水平面切片）。
   1. 将以下工具放置于垫巾上：断头剪、手术刀、小型直头尖刃剪 剪刀、血管插管镊（或任何尖端较宽的外科工具，例如咬骨钳，后者更适用于大鼠颅骨）、弯止血钳、镊子、刮勺、滤纸、培养皿、单刃剃刀刀片以及氰基丙烯酸酯胶水。
6. 当温度降至 0 - 2 °C 时，将切片液转移至切片室（缓冲槽）。
7. 在干燥器中使用异氟烷对小鼠进行麻醉。异氟烷用量可能因所用干燥器的大小而异，对于小型鞋盒式笼子，使用几滴（约3–4滴）。将小鼠留在笼中直至其失去活动能力（对触觉刺激无反应；在本实验条件下约需15秒）。通过尾部和足部夹捏测试确认动物已深度麻醉，随后在心脏停止跳动前实施断头术（以提高细胞活力）。
   注意：在有充分理由的情况下，一些实验室获得授权进行活体断头，以最大程度减少兴奋性毒性过程并提高细胞存活率。
8. 进行解剖操作。
   注意：必须迅速取出大脑（<45 秒
   1. 使用手术刀从头侧到尾侧切开颅骨表面的皮肤。
   2. 剥离头两侧的头皮。
   3. 使用小号直型锐尖 剪刀沿人字缝剪开顶间骨板以移除小脑。移除枕骨。
   4. 使用同一把剪刀剪开矢状缝。
   5. 将血管插管镊（或咬骨钳，若为大鼠颅骨）滑至每侧顶骨下方，牵拉以暴露脑组织。
   6. 使用弯止血钳夹住额骨以将其折断，然后用镊子或血管插管钳移除破碎的骨片。尽可能轻柔地剪开并去除硬脑膜，因其可能干扰后续解剖操作。
   7. 将刮勺滑入脑下方，轻柔地将脑组织从颅骨中取出，放入预先盛有冰冻人工脑脊液（ACSF）的切片室（缓冲托盘）中。让脑组织冷却1-2分钟。
   8. 在培养皿中加入冰块和少量冰水以增加接触面积，制备解剖平台，盖上皿盖，并在上方放置一张滤纸。用冷的ACSF润湿滤纸。
   9. 待脑组织冷却后，将其置于盛有冰的培养皿中，并迅速进行相应解剖以获得所需的切片平面。
   10. 为获取包含伏隔核（NAc）的矢状切片，使用单刃剃须刀片切除嗅结节以及仍存在的小脑组织。随后，从右侧半球外侧边缘向内进行2–3 mm的矢状切削，以获得可用于粘附于样本固定板上的平整切面（见步骤2.8.11）。
       注意：仅从半球外侧边缘切割2-3 mm，即可获得包含双侧伏隔核（NAc）的脑片。具体的解剖方式取决于所研究的脑区。本实验中，解剖操作旨在获取可用于记录NAc神经元活动的矢状脑切片。
   11. 用氰基丙烯酸酯胶水将脑组织的平整切面快速粘附到样品托上，确保粘贴方向符合预期的切片平面。如需获取矢状面脑切片，请参见步骤 2.8.10。
   12. 立即将样本固定板放入切片室并固定，使脑组织进行头-尾方向切片（为安全起见，仅在样本板固定后安装刀片架）。
   13. 设置振动切片机的适当切片参数（实验室中针对前述振动切片机所使用的参数） 材料：速度 3 - 4，振动 9-10，切片厚度 250 µm。
   14. 切片后，使用塑料头移液管将脑片转移至恢复室（室温）（参见步骤2.3）。恢复时间可能因所研究的神经元类型而异（通常为30–90分钟）。

3. 记录用微电极和仪器准备

1. 参考拉管仪用户手册中的具体指南，以获得所需的微电极特性。
   注意：对于中等棘状神经元（MSNs），我们使用的移液管电阻范围为 3.2–4.0 MΩ。
2. 用氧气饱和ACSF，并将流速调节至2 ml/min。使用蠕动泵或实验室内安装的真空管线对ACSF进行抽气处理。
3. 打开灌流加热控制器，并调节温度设置以达到所需温度（例如，31.8 - 32.2 °C。
   注意：温度稳定性取决于灌流 chamber 中人工脑脊液（ACSF）液面高度和流速的恒定。由于神经元的多种生物物理特性（例如，输入电阻，R_i，也称为膜电阻，R_m由于温度敏感，保持稳定的温度非常重要。
4. 打开计算机控制的放大器、相机、显微操作器和显微镜背景光源。如果进行需要对组织施加电刺激的实验，请开启刺激控制器和隔离单元。
   注意：其他厂商生产的某些放大器建议采用 "预热" 使用前建议查阅说明书以获取准确的操作步骤。
5. 启动相机采集、信号采集和放大器软件。
6. 切片放置与可视化：
   1. 使用塑料修尖的移液管，从恢复室中轻轻吸取一个脑切片。
   2. 将移液管放入记录室，轻轻挤压，使脑片从移液管中缓慢释放并置于记录室底部的盖玻片上。
      注意：只要不发生溢出，恢复室中的ACSF少量流入浴槽是无害的。
   3. 使用镊子调整切片位置，使目标区域精确位于记录室中央。借助显微镜低倍（4X）物镜和目镜辅助定位。
   4. 在达到理想位置后，使用切片固定装置（也称为切片压块）固定脑片位置 "竖琴"室内的）
   5. 切换至高倍（40X）物镜，并轻轻 lowering 物镜，直至其与灌流室中的人工脑脊液（ACSF）接触。
   6. 使用微调旋钮将组织调至焦点。当处于人工脑脊液（ACSF）接触状态时，切勿使用显微镜的粗调旋钮，因为过度降低物镜可能会压碎脑片，甚至损坏培养 chamber 底部的盖玻片衬层，导致 ACSF 溢出至聚光镜并造成损坏。
   7. 当聚焦于组织水平时，观察目标区域细胞的形态。死细胞因其形态特征而易于识别 肿胀的细胞膜和细胞核（图1E）。健康的细胞应呈现为圆形、卵圆形或椭圆形的均质结构（图1E).
   8. 寻找目标细胞。在计算机屏幕上标记该细胞，以帮助引导记录用微电极。如果使用 QCapture 等软件，按住鼠标左键在目标细胞周围绘制一个方框。
   9. 抬高物镜，以便在物镜与人工脑脊液（ACSF）接触形成的锥形空间内留出足够间隙，用于放置和移动记录微电极。
7. 微量移液器的放置与定位
   1. 使用1 ml 注射器、非金属微量注射针和专用滤器，使用根据预定实验预先配制的内液填充微量移液管（K⁺-基或Cs⁺基于的内液溶液，参见步骤 1.1、1.2 和 材料 用于成分分析）。使用足量溶液，使内液与微移液管架内涂有氯化物的银丝电极接触。
      注意：银丝电极可通过浸泡在家用漂白剂中进行氯化。核苷三磷酸（ATP & GTP）可在使用前加入内液。将含有溶液的注射器置于冰上，以防止ATP/GTP降解。
   2. 确保微量移液器中无气泡，因为气泡可能在移液器插入组织时逸出，从而遮挡切片视野。
   3. 将微量移液器放入电极架中，使溶液与涂有氯化银的金属丝电极接触。
   4. 拧紧移液器盖子，使锥形垫圈在微量移液器周围形成密封。
   5. 在将微移液管浸入ACSF之前施加正压，以防止碎屑进入移液管。
   6. 将头架置于锁定位置（朝向记录室），并使用显微操作器将其向下引导至记录室附近，大致位于浸没式物镜中心下方。
   7. 使用显微操作器（设定为中高速）移动微量移液器时，通过计算机屏幕定位微量移液器，并引导其沿X-Y轴方向移至细胞位置。
   8. 通过施加电压阶跃来测量微量移液管的电阻例如，4 mV 持续 100 毫秒），可通过手动方式或使用特定软件（如采用“bath”模式时）自动完成 "膜片钳测试" 在Clampex软件中（参见步骤4）。为确保无气泡或其他异物堵塞微电极，使用充满空气的注射器施加正压例如，30 cc 注射器）通过聚乙烯管连接至微移液管持器。
   9. 清除微移液管后，进行电压偏移以将移液管电流调零，可通过手动方式或使用计算机控制放大器指令软件（如“pipette offset”）完成。
      注意：此功能将补偿由浴液与微移液管溶液之间的浓度差异所引起的任何电压即，液接电位²⁰).

4. 膜测试

注意：此步骤适用于 材料 部分提到的放大器。

1. 使用计算机控制的放大器控制器时，始终将其设置为电压钳模式以执行膜测试。
   注意：当膜测试设置为"浴液"模式时，可在封接形成后测量微电极尖端电阻和封接电阻。
2. 一旦细胞膜破裂（见步骤 5.8），将膜测试切换至"细胞"模式，以获取串联电阻（R_s，也称为通路电阻 R_a）、R_i 和膜电容（C_p）。

5. 最终接近、封接形成及全细胞记录模式的获得

1. 使用微调旋钮，一边逐渐降低微量移液管，一边开始向下聚焦。务必先向下聚焦，再将微量移液管降至焦平面。这样可确保移液管尖端不会突然刺入脑片。
2. 当微量移液管接触到脑片表面时，将显微操作器的速度调至中低档。
3. 使用连接至移液管夹持器的充气注射器轻轻施加微弱的正压，以清除进路中的任何碎屑。
4. 通过交替调节X-Y-Z控制旋钮，或在显微操作器型号允许的情况下采用对角线方式（旋转Z轴旋钮同时改变X-Z轴）接近细胞。后一种方法可避免组织受到垂直压缩。
   注意：此处的目标是以对脑片造成最小损伤的方式接近细胞。当微量移液管足够接近细胞时，会出现一个凹陷（即由于移液管尖端施加正压而在细胞表面形成的圆形变色区域）（图2）。
5. 当出现凹陷时（图2-1），通过连接至移液管夹持器抽吸管的管道施加短暂而微弱的负压，以形成封接（图2-2）。持续监测膜测试结果。
   注意：若形成部分封接（<1 GΩ），可通过降低钳制电位（在计算机控制的放大器指令器上操作）注入负向电流，促进封接形成并达到千兆欧姆级电阻（"千兆欧姆封接" 或 "gigaseal" >1 - 5 GΩ）。高阻封接（>1 GΩ）既能限制记录信号中的噪声干扰，也有助于提高膜片钳的机械稳定性。
6. 在形成千兆欧姆封接的过程中，使用计算机控制的放大器指令器将细胞的钳制电位尽可能调节至接近生理静息电位（V_rest），以防止膜破裂后发生电位突变。例如，中等棘神经元（MSNs）通常被电压钳制在 -70 或 -80 mV（生理静息电位 V_rest：-70 至 -90 mV）。
7. 在千兆欧姆封接形成后，手动或自动补偿快速和慢速电容。若使用Multiclamp指令器等计算机控制的放大器指令器，请按下“Cp Fast”和“Cp Slow"的“Auto”按钮。
8. 若封接保持稳定且电阻高于1 GΩ（或为维持细胞在目标膜电位所需注入的电流小于10 - 20 pA），则通过与步骤5.5相同的管道施加短暂而强烈的负压，以破裂细胞膜（图2-3）。
   注意：此步骤可能需要多次尝试。理想的细胞膜破裂应施加足够强的负压，使破裂的膜不会堵塞移液管（否则可能导致记录过程中串联电阻R_s升高），但又不能过强，以免吸入大量膜结构或细胞内容物。
9. 成功建立全细胞记录构型后，应定期监测微量移液管的位置，评估并校正显著漂移，因其可能导致记录丢失。漂移幅度可能受多种因素影响，e.g.，记录装置安装质量及对前置放大器头端的牵拉力。理想情况下，漂移应几乎不可察觉。
10. 在膜测试中切换至 "Cell" 模式，可查看细胞的不同参数，如R_i、R_s和C_p。在记录过程中持续监测这些参数。
    注意：这些参数有助于评估细胞的初始健康状态及细胞类型（参见 "膜测试" 部分，步骤4）。
11. 完成上述步骤后，可保持在电压钳模式下记录电流（e.g.，EPSCs、IPSCs），或切换至电流钳模式以记录膜电位变化（e.g.，动作电位发放）。在后者情况下，注入正向或负向电流以将细胞维持在目标膜电位（具体操作请参考放大器使用手册）。

结果

温度是实验者易于控制的一个因素，它会影响离子通道和受体的生物物理特性，从而影响突触后电流（EPSC和IPSC）的波形以及神经元产生动作电位的能力。 图3 和 图4 分别显示温度对神经元放电活动以及诱发兴奋性突触后电流（eEPSCs）斜率的影响。放电模式（图3) (即，到达1的潜伏期^st 峰电位、峰电位数量、频率以及动作电位波形）由特定电压门控离子通道（Na⁺，Ca²⁺，以及 K⁺），该过程对温度敏感。 图3 显示平均峰电位数量随温度升高而增加。需要注意的是，在此处描述的实验条件下（MSN记录），尽管在亚生理温度（28 °C）下峰电位频率似乎未受影响，但当温度升至生理相关水平（32 °C）时，其显著增加。 图 4A 显示了eEPSC斜率（常用于评估突触强度的一个参数）随温度升高而增加的示例。

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讨论

本方案描述了在脑片神经元上进行全细胞膜片钳实验的基本操作流程。然而，该技术的复杂性、潜力和敏感性无法在本文中得到全面阐述。在此，我们力求阐明最基本的步骤，并强调为获得成功且严谨的全细胞记录所必须控制的关键参数。为进一步深入理论学习，已有大量书籍和文章发表，内容涵盖脑片全细胞膜片钳记录技术^3,21-24，以及优化所用溶液以提高细胞存活率的方法^25-27。要常规性地完成高质量记录，需要通过大量实践来不断提升操作技能。尽管如此，只要正确实施上述步骤，即使在动物死亡数小时后仍可对细胞进行膜片钳记录，从而获得有关突触功能和固有兴奋性变化的重要信息。

一般来说，除了需要仔细配制人工脑脊液（ACSF）和细胞内微电极溶液外，从脑组织解剖、切片、形成成功的全细胞记录构型，到获得严谨且无偏倚的数据，每一步骤都需要大量练习。其中，制备出健康的脑片尤为关键。简而言之，应迅速完成脑组织的解剖（理想情况下 <45 秒）、切片过程中维持低温（0 - 2 °C）以及使用合适的切片液，均在保障细胞活性方面发挥重要作用。值得注意的是，不同实验室之间，以及根据所研究的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
孤立脉冲刺激发生器	A.M.P.I	Master-8
隔离单元（ISO-Flex）	A.M.P.I	ISO-Flex
计算机控制放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
数字采集系统	Molecular Devices	Digidata 1500
显微镜	Olympus	BX-51
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
灌流室及在线加热器	Warner Instruments	TC-344B
振动切片机	Leica	VT1000 S
微电极拉制仪	Narishige	PC-10
成像相机	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige 微电极拉制仪 PC-10	Narishige	PC-10
玻璃毛细管	WPI	TW150F-3
切片固定装置（琴弦式）	Warner Instruments	64-0255
切片孵育室	Warner Instruments	RC-26
非金属注射器针头	World Precision Instruments	MF28G67-5
注射器滤器	Nalgene	176-0045
热熔胶枪	Home Depot	various
气体分散管	Ace Glass Inc.	various
断头剪	Home Depot	100649198
3号手术刀柄	World Precision Instruments	500236
小型直头尖头剪	World Precision Instruments	14218
血管插管镊	World Precision Instruments	500453
弯头止血钳	World Precision Instruments	501288
经济型镊子 #3	World Precision Instruments	501976-6
刮刀	Fisher Scientific	14357Q
挖取式刮刀	Fisher Scientific	14-357Q
培养皿	Fisher Scientific	08-747B
滤纸	Lab Depot	CFP1-110
溶液
铯葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
D-葡萄糖酸 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
氢氧化铯（CsOH）50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl，2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES，20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
氯化四乙铵，5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
钾葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
K D-葡萄糖酸盐，120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl，20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES，10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
标准人工脑脊液（ACSF，渗透压 ≈ 300–310 mOsm）
KCl，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl，119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O，1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
葡萄糖，11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4·7H2O，1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2·2H2O，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
配制溶液所用的其他化合物
KOH	various
犬尿烯酸	Sigma Aldrich/various	K3375