鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY

Summary

光学透明化技术正在彻底改变组织的可视化方式。在本报告中，我们描述了原始 Clear Lipid 交换的丙烯酰胺杂交刚性成像兼容的 Tissue-hYdrogel （CLARITY） 方案的修改，该方案可产生更一致且成本更低的结果。

Abstract

传统上，组织可视化需要对感兴趣的组织进行连续切片和成像，使每个组织切片都受到独特的非线性变形，极大地阻碍了评估中枢神经系统 （CNS） 中细胞形态、分布和连接的能力。然而，光学透明化技术正在改变组织的可视化方式。这些方法允许人们深入探索完整的器官准备物，为健康和疾病中组织的结构组织提供深刻的见解。透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像兼容 Tissue-hYdrogel （CLARITY） 等技术通过提供结合重要生物分子的基质，同时允许光散射脂质自由扩散来实现这一目标。脂质去除，然后进行折射率匹配，使组织透明并易于在 3 维 （3D） 中成像。然而，原始 CLARITY 方案中使用的电泳组织透明化 （ETC） 可能难以成功实施，并且使用专有的折射率匹配解决方案使得常规使用该技术的成本很高。本报告展示了一种简单且廉价的光学透明化方案的实施，该方案结合了用于提高组织完整性的被动 CLARITY 和先前描述的折射率匹配解决方案 2,2′-硫代二乙醇 （TDE）。

Introduction

对完整神经解剖结构进行成像的能力对于了解大脑的健康和疾病非常有价值。传统上，3D 成像需要组织切片才能提供轴向分辨率并可视化深层解剖结构。这种方法可以生成高分辨率数据集，但需要复杂的图像重建技术，并且非常耗费人力。因此，它仅限于小体积组织^1-3 的成像。另一方面，光学切片非常适合创建荧光标记组织的高分辨率 3D 图像。由于光学切片本质上是三维的，因此不需要大量的计算来生成 3D 图像体积。 然而，光散射和组织混浊限制了组织可以进行光学切片的深度。在激光扫描共聚焦显微镜中，成像深度限制为约 150 μm，而使用双光子激发显微镜时，成像深度限制为小于 800 μm^4-8。

为了克服这些限制，最近开发了几种光学透明化技术，然后进一步改进，以允许对完整组织进行深度显微成像。使用苯甲醇和苯甲酸苄酯 （BABB） 使固定组织透明是最早的方法之一⁹。然而，这种方法受到样品中荧光淬灭和高度髓鞘结构不完全清除的限制¹⁰。该技术的改进，例如溶剂透明化器官的 3D 成像 （3DISCO），已经实现了非常快速和完整的组织透明化，但荧光信号仍然会迅速丢失，尤其是黄色荧光蛋白 （YFP）¹⁰。水基透明化溶液，如 Sca/e¹¹ 和 SeeDB¹²，可保留荧光信号，但不能完全透明化高度髓鞘的组织。清晰、无阻碍的脑成像混合物和计算分析 （CUBIC） 是一....

Protocol

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针进行。 THY1-YFP，PLP-EGFP和PV-TdTomato小鼠用于这些实验，但表达的荧光蛋白的任何小鼠可以成功地清除并成像。

1.组织准备

注意:多聚甲醛（PFA）和丙烯酰胺是有毒的和刺激物。执行利用这些试剂在通风橱，并配备适当的个人防护装备（实验室外套，手套和护目镜）的实验。

1. 牺牲安乐死腔动物提供〜1毫升异氟烷，直到呼吸停止（〜2 - 3分钟）。
2. 使用蠕动泵设置为〜5毫升/分钟，以心内，在4℃下灌注灌注溶液（ 表1）的鼠标，直到血液从组织中清除（5 - 10分钟）。
3. 改变灌注到固定液（ 见表1）在4℃，直至颈部和尾部已经显著硬化（5 - 10分钟）。
4. 结束灌注和杀头的动物。通过首先除去围绕颅骨结缔组织，然后从颅骨的腹侧表面去除骨和提起脑出（ 图1a），如在²⁰中所述，小心解剖出从头骨大脑。
   注:优抚周围小脑flocculonodular叶和嗅球切除骨。
   1. 轻轻插入脊髓和脊椎之间的精，尖剪刀尖和切割个别脊柱段走，如在描述²¹从解剖脊柱脊髓。
5. 通过将它放置在一个塑料小....

Results

可视化脑的结构组织为理解形态学和连通如何影响在健康和疾病的脑功能的关键。光透明的技术使得有可能在三维图像的细胞群在完整组织，使我们能够研究形态学和连接内聚。

小鼠表达荧光蛋白通过特异于亚群的启动子驱动的细胞允许一个梳理开神经连接的大脑中的复杂的图案。 THY1-YFP的转基因小鼠进行了广泛的光透明文献，因为这些小鼠在驻留在大脑皮质和海马投射神经元，以及其他结构的大脑中的（ 图2a和b）一种子集表达YFP被使用。此外，YFP ⁺皮质V层神经元的项目，通过在s皮质脊髓束皮纳尔线（ 图2c＆D），使得它们在评价脊髓轴突损伤和/或损伤对皮质神经元¹⁵的效果非常有用的。通过使用光清组织共聚焦显微镜和光学切片的人可以轻松地评估在大型解剖结构的神经元密度差异。

Discussion

水凝胶包埋组织（无源净度）的被动结算是用于清除大块组织的一个简单和廉价的方法。这种方法不要求专用设备，并且可以很容易地在一个温度控制的振荡器进行。在几个星期的跨度，即使是大的，高度髓组织，例如整个脑或脊髓，将成为透明，适用于显微镜。尽管这份报告集中在CNS组织中的清除，被动净度可应用于任何组织。

的光透明的技术的相对优点和弱点已在文献^13,17,22先前所论述^，但最清楚地²³布置。其中，样品的大量被同时清除和可重复性是很重要的被动净度是非常适合的实验。使用水凝胶，以提供额外的支持，组织有利于米ultiple探测组织。在这份报告中，分子量小的染料，DAPI，被证明，但是多轮抗体探测的也是可能的，这种方法。

上述方法从我们先前公布的协议^15日在一对夫妇的显著偏离的方式。首先，在当前的方法中，标本不心内与水凝胶灌注。这是由于这样的事实，该水凝胶可过早聚合在管道和灌注装置的针，导致不完全的灌注和不一致的结算。在水凝胶温育的多聚甲醛固定的组织7天是与.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher	BP399-1	缓冲液
32% 多聚甲醛 （PFA）	电子显微镜科学	15714-5	灌注和水凝胶
2,2'-硫代二乙醇 （TDE）	Sigma-Aldrich	166782-500G	折射率匹配溶液
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140	水凝胶
2% 双丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0142	水凝胶
VA-044 引发剂	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	VA044	水凝胶
硼酸	Sigma-Aldrich	B7901	清除缓冲液
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Fisher	BP166-5	清除缓冲液
氢氧化钠	Fisher	55255-1	缓冲液
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	52002-100G	防腐剂
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	缓冲液
肝素	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	灌注
硝酸钠	Fisher	BP360-500	灌注
DAPI	分子探针	D1306	核染色
99.9% 异氟醚	Phoenix	57319-559-06	麻醉剂
氢胆酸	Fisher	A1445-500	缓冲液
玻璃底盘	Willco	HBSB-5040	Willco 盘
子 可重复使用的粘合剂	Bostick	371351	Blu-Tack
硅弹性体	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
无绒擦拭布	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
小鼠脑基质	Roboz	SA-2175	切片纸巾
基质刀片	Roboz	RS-9887	切片组织
蠕动泵	Cole-Parmer	77122-24	灌注
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP5	显微镜
成像软件	Leica	LAS AF	显微镜