鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY

Summary

光学透明化技术正在彻底改变组织的可视化方式。在本报告中，我们描述了原始 Clear Lipid 交换的丙烯酰胺杂交刚性成像兼容的 Tissue-hYdrogel （CLARITY） 方案的修改，该方案可产生更一致且成本更低的结果。

Abstract

传统上，组织可视化需要对感兴趣的组织进行连续切片和成像，使每个组织切片都受到独特的非线性变形，极大地阻碍了评估中枢神经系统 （CNS） 中细胞形态、分布和连接的能力。然而，光学透明化技术正在改变组织的可视化方式。这些方法允许人们深入探索完整的器官准备物，为健康和疾病中组织的结构组织提供深刻的见解。透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像兼容 Tissue-hYdrogel （CLARITY） 等技术通过提供结合重要生物分子的基质，同时允许光散射脂质自由扩散来实现这一目标。脂质去除，然后进行折射率匹配，使组织透明并易于在 3 维 （3D） 中成像。然而，原始 CLARITY 方案中使用的电泳组织透明化 （ETC） 可能难以成功实施，并且使用专有的折射率匹配解决方案使得常规使用该技术的成本很高。本报告展示了一种简单且廉价的光学透明化方案的实施，该方案结合了用于提高组织完整性的被动 CLARITY 和先前描述的折射率匹配解决方案 2,2′-硫代二乙醇 （TDE）。

Introduction

对完整神经解剖结构进行成像的能力对于了解大脑的健康和疾病非常有价值。传统上，3D 成像需要组织切片才能提供轴向分辨率并可视化深层解剖结构。这种方法可以生成高分辨率数据集，但需要复杂的图像重建技术，并且非常耗费人力。因此，它仅限于小体积组织^1-3 的成像。另一方面，光学切片非常适合创建荧光标记组织的高分辨率 3D 图像。由于光学切片本质上是三维的，因此不需要大量的计算来生成 3D 图像体积。 然而，光散射和组织混浊限制了组织可以进行光学切片的深度。在激光扫描共聚焦显微镜中，成像深度限制为约 150 μm，而使用双光子激发显微镜时，成像深度限制为小于 800 μm^4-8。

为了克服这些限制，最近开发了几种光学透明化技术，然后进一步改进，以允许对完整组织进行深度显微成像。使用苯甲醇和苯甲酸苄酯 （BABB） 使固定组织透明是最早的方法之一⁹。然而，这种方法受到样品中荧光淬灭和高度髓鞘结构不完全清除的限制¹⁰。该技术的改进，例如溶剂透明化器官的 3D 成像 （3DISCO），已经实现了非常快速和完整的组织透明化，但荧光信号仍然会迅速丢失，尤其是黄色荧光蛋白 （YFP）¹⁰。水基透明化溶液，如 Sca/e¹¹ 和 SeeDB¹²，可保留荧光信号，但不能完全透明化高度髓鞘的组织。清晰、无阻碍的脑成像混合物和计算分析 （CUBIC） 是一种很有前途的新型光学透明化技术，它似乎克服了以前开发的水基透明化解决方案的局限性¹³。与其他光学透明化技术相比，透明脂质交换的丙烯酰胺杂交刚性成像兼容组织-hYdrogel （CLARITY）¹⁴ 将大脑嵌入多孔基质中，为蛋白质、核酸和小分子提供结构完整性，同时保持脂质未结合。然后通过电泳去除脂质，最终形成一个光学透明的大脑，该大脑可以很容易地可视化，同样可以很容易地使用常用的技术进行探测。

电泳组织透明化 （ETC） 用于去除 CLARITY 中水凝胶包埋组织中的脂质，但是，ETC 可能难以一致地实施，并且受电泳的组织可能表现出组织变形、褐变、荧光丧失和抗体反应性。被动脂质清除避免了这些限制，但需要增加^15-17 次清除时间。被动清除还允许并行清除大量样品，因为它不受可用 ETC 设备数量的限制。降低多聚甲醛的浓度并从水凝胶中排除双丙烯酰胺，导致清除速度大大提高，但代价是组织扩张更大¹⁶。已经开发了原始 CLARITY 技术中使用的折射率匹配溶液的更便宜的替代品^17-19。2,2'-硫代二乙醇 （TDE） 是一种廉价且快速的大脑净化剂，可逆转脂质去除过程中发生的一些组织扩增¹⁸。本报告结合了水凝胶包埋组织的被动透明化和使用 TDE 作为原始 CLARITY 技术的折射率匹配解决方案，以产生一种高度可重复且廉价的小鼠中枢神经系统光学透明化方案。

Protocol

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针进行。 THY1-YFP，PLP-EGFP和PV-TdTomato小鼠用于这些实验，但表达的荧光蛋白的任何小鼠可以成功地清除并成像。

1.组织准备

注意:多聚甲醛（PFA）和丙烯酰胺是有毒的和刺激物。执行利用这些试剂在通风橱，并配备适当的个人防护装备（实验室外套，手套和护目镜）的实验。

1. 牺牲安乐死腔动物提供〜1毫升异氟烷，直到呼吸停止（〜2 - 3分钟）。
2. 使用蠕动泵设置为〜5毫升/分钟，以心内，在4℃下灌注灌注溶液（ 表1）的鼠标，直到血液从组织中清除（5 - 10分钟）。
3. 改变灌注到固定液（ 见表1）在4℃，直至颈部和尾部已经显著硬化（5 - 10分钟）。
4. 结束灌注和杀头的动物。通过首先除去围绕颅骨结缔组织，然后从颅骨的腹侧表面去除骨和提起脑出（ 图1a），如在²⁰中所述，小心解剖出从头骨大脑。
   注:优抚周围小脑flocculonodular叶和嗅球切除骨。
   1. 轻轻插入脊髓和脊椎之间的精，尖剪刀尖和切割个别脊柱段走，如在描述²¹从解剖脊柱脊髓。
5. 通过将它放置在一个塑料小鼠大脑基质并沿与基体的刀片的中线切割Hemisect大脑。
6. 将每个半球和脊髓分离的50ml离心桶与ES〜40毫升的水凝胶溶液（ 表1）。从这点出发盖用铝箔管，以在所有后续步骤保护荧光。
7. 轻微振荡（〜30转）7天孵育含有在水凝胶中的样品的管中，在4℃。

2.聚合

1. 丢弃约25mL水凝胶，保存样品和约25mL的水凝胶中的离心管中。
2. 通过去除帽和放置离心管在干燥器罐和罐连接到真空脱氧样品。施加真空，至少10分钟，以允许溶解的气体出来溶液和形式气泡。轻轻摇动赶走气泡。
3. 3分钟 - 与100％的氮气罐干燥器超过2更换真空。一旦压力均衡（一旦干燥器罐的顶部可以打开），迅速帽管，以防止氧气的放归。
4. 聚合物通过将管与样品中的37℃水浴中3小时，直至聚合反应完成IZE水凝胶。聚合水凝胶将采取的凝胶状稠度（ 图1b）。注意:在顶部未聚合水凝胶的少量是可接受的。
5. 用刮刀以除去由离心管聚合样品，然后切去从样品中多余的水凝胶。
6. 通过将样品在软绒布擦拭，并轻轻揉并在其上滚动的组织，留下的样品聚合水凝胶的只有薄薄的一层去除剩余的水凝胶。

3.脂质去除

注:脂质清除的组织是脆弱的，小心处理。引流管时，使用细胞过滤器，以避免丢失样本。此外，该样品将膨胀整个结算处理，但是，肿胀可以在折射率匹配过程颠倒。

注意:SODI嗯十二烷基硫酸钠（SDS）和硼酸是刺激物。执行利用它们在通风橱，并配备适当的个人防护装备（实验室外套，手套和护目镜）的实验。

1. 转移聚合样品到一个干净的50ml离心管中，加入清除缓冲液（ 表1）45毫升孵育在45℃下轻轻摇动（〜30转）。通过浇灭了用于清除缓存为化学废物和添加〜45毫升新鲜缓冲结算日更改缓冲区最初7天。保持含在铝箔覆盖，以保护荧光团的样品的离心管中。
2. 最初7天后，在40℃和交换结算缓冲器孵育样品每2 - 3天。继续结算，直到所有的脂类是溶解和组织达到透明度（ 图1c）。这将是4 - 6周的小鼠大脑半球2 - 4周为一个脊髓。
3. 一旦组织被清除，转移样品到一个新的50ml离心管中并在40℃轻微振荡（〜30转）在PBST中（ 表1）清洗4次超过24小时，以除去残余的SDS。

4.染色分子

注意:4'，6-二脒基-2-苯二盐酸盐（DAPI）是一种刺激性和利用它应该在通风橱，并配备适当的个人防护装备（实验室外套，手套和护目镜）进行任何实验。

1. 样品转移到一个干净的15ml离心管，用1微克/毫升的DAPI在1X PBST，pH值7.5填补。在室温下孵育（RT）下24小时。保持含在铝箔覆盖，以保护荧光团的样品的离心管中。
2. 在室温洗PBST 3次，每次至少6小时/洗。

5.折射率匹配

注意:2,2'-硫代二乙醇（TDE）是一种刺激和利用它的任何实验SH乌尔德在通风橱，并配备适当的个人防护装备（实验室外套，手套和护目镜）来完成。

1. 将样品转移到一个干净的15ml离心管中，用30％在1×PBS（体积/体积）TDE，pH值7.5填。孵育24小时40℃轻轻摇动（〜30转）。
2. 交换30％TDE用63％（V / V）的1×PBS中，pH值7.5 TDE。在40℃孵育轻微振荡24小时。
   注意:示例将退缩到约原来的大小。
3. 在平坦，清洁的表面滚动的一块可重复使用的粘合剂的与均匀的直径只比所述样品的厚度稍大的圆筒。
4. 莱可重复使用的胶粘剂缸开放式圆（〜25内径在顶部一个小口）上有40毫米的玻璃底菜。如果修正需要进行，从玻璃移除筒和用刀片切割。
5. 使用P1000枪头通过创建可重复使用的粘合剂和玻璃之间的密封滚动它周围的筒的外缘。
6. 地方〜100微升63％TDE到玻璃菜，传遍覆盖可重复使用的胶粘剂的圆内的玻璃表面。
7. 使用刮刀，小心地在圆圈的中间样品，注意不要形成泡沫。
8. 移液器另外100微升63％TDE直接到样品，然后立即放置40mm的圆形玻璃盖在可重复使用的粘合剂。
9. 使用索引，中间和两手的无名指，小心地按左右的圆的周长，直到盖玻璃已经取得与样品接触。
10. 缓慢将玻璃底培养皿到直立位置靠在一个表面上，然后添加63％TDE用吸管直到溶液到达在上面的小开口。使用无尘擦拭擦干枪头使得溶液不会对玻璃滴落。以避免在该室的气泡，从未空吸管一路。
11. 至小开，加硅弹性体包围的圈子，并创建一个封闭室。等待5分钟，它的成像之前干燥。

6.显微镜

注意:在激光共聚焦，单一平面照明和光片显微镜使用的激光器是非常强大的，可以导致失明。任何利用激光器实验后应广泛的培训和十分谨慎和适当的保护眼睛进行。

1. 放置成像室里面上的激光扫描共聚焦显微镜的阶段样品。
2. 打开成像软件（见材料表）。要打开氩激发激光，单击该程序，然后激光图标的上方配置选项卡。勾选旁边氩供电激光移动滑块规模的30％。观察指针慢慢温热至所选择的位置。
   1. 返回到获取标签的顶部。在大盒子"光束路径设置＆＃34;进入加载/保存设置框，然后选择下拉菜单中选择一个合适的波长信道图像YFP（527纳米）。
3. 下的通道设置框:通过定位标记为"当前对象客观"红色超链接选择适当的成像目标。点击选项卡上打开所有可用的目标和选择会自动旋转炮塔。
   1. 使用的目标（ 例如 ，10X）具有大的工作距离（大于组织的厚度大要成像， 例如，第11毫米）和大数值孔径（ 例如 ，0.3），以最大限度地提高面内的图像分辨率和最小化光学切片厚度。
4. 在下拉菜单，打开"XY:解析"的左栏窗口设置采集矩阵，所谓的"格式"，1024×1024或适当的目标的横向分辨率极限值。设置缩放因子尽可能低（ 例如 ，10.7）。
5. 在同一窗口，通过相应地在下降了单独标记菜单中设置8行平均1帧的平均参数。使用较大的值要高信噪比和小的值的快速采集。
   注:8号线均线和1架平均将获得小鼠大脑半球的高品质的图像约4小时。
6. 找到使用阶段控制样本。一旦有代表性的领域是可见的，设置增益和偏移。
   注意:增益和偏移基于所述组织类型，荧光团将基本上不同，和/或正被成像的解剖特征。对YFP，从760至780为增益和从-1.0到-1.5的偏移设定值。
7. 选择"瓷砖扫描"，并选择感兴趣的区域的边界。要获取设置的Z堆叠的上限和下限。设定基于所述物镜的光学部分分辨率极限的光学部分的厚度。
   注:客观的光学部分分辨率极限主要由其数值孔径限定。所使用的大多数显微镜控制软件会自动计算出适当的值的目标。要10X物镜具有0.3的数值孔径，这将是大约11微米。
8. 开始采集。
   注意:这可能需要多个小时。
9. 使用高倍目标从感兴趣的特定区域收集更高分辨率的图像。

Results

可视化脑的结构组织为理解形态学和连通如何影响在健康和疾病的脑功能的关键。光透明的技术使得有可能在三维图像的细胞群在完整组织，使我们能够研究形态学和连接内聚。

小鼠表达荧光蛋白通过特异于亚群的启动子驱动的细胞允许一个梳理开神经连接的大脑中的复杂的图案。 THY1-YFP的转基因小鼠进行了广泛的光透明文献，因为这些小鼠在驻留在大脑皮质和海马投射神经元，以及其他结构的大脑中的（ 图2a和b）一种子集表达YFP被使用。此外，YFP ⁺皮质V层神经元的项目，通过在s皮质脊髓束皮纳尔线（ 图2c＆D），使得它们在评价脊髓轴突损伤和/或损伤对皮质神经元¹⁵的效果非常有用的。通过使用光清组织共聚焦显微镜和光学切片的人可以轻松地评估在大型解剖结构的神经元密度差异。

Discussion

水凝胶包埋组织（无源净度）的被动结算是用于清除大块组织的一个简单和廉价的方法。这种方法不要求专用设备，并且可以很容易地在一个温度控制的振荡器进行。在几个星期的跨度，即使是大的，高度髓组织，例如整个脑或脊髓，将成为透明，适用于显微镜。尽管这份报告集中在CNS组织中的清除，被动净度可应用于任何组织。

的光透明的技术的相对优点和弱点已在文献^13,17,22先前所论述^，但最清楚地²³布置。其中，样品的大量被同时清除和可重复性是很重要的被动净度是非常适合的实验。使用水凝胶，以提供额外的支持，组织有利于米ultiple探测组织。在这份报告中，分子量小的染料，DAPI，被证明，但是多轮抗体探测的也是可能的，这种方法。

上述方法从我们先前公布的协议^15日在一对夫妇的显著偏离的方式。首先，在当前的方法中，标本不心内与水凝胶灌注。这是由于这样的事实，该水凝胶可过早聚合在管道和灌注装置的针，导致不完全的灌注和不一致的结算。在水凝胶温育的多聚甲醛固定的组织7天是与...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher	BP399-1	缓冲液
32% 多聚甲醛 （PFA）	电子显微镜科学	15714-5	灌注和水凝胶
2,2'-硫代二乙醇 （TDE）	Sigma-Aldrich	166782-500G	折射率匹配溶液
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140	水凝胶
2% 双丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0142	水凝胶
VA-044 引发剂	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	VA044	水凝胶
硼酸	Sigma-Aldrich	B7901	清除缓冲液
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Fisher	BP166-5	清除缓冲液
氢氧化钠	Fisher	55255-1	缓冲液
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	52002-100G	防腐剂
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	缓冲液
肝素	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	灌注
硝酸钠	Fisher	BP360-500	灌注
DAPI	分子探针	D1306	核染色
99.9% 异氟醚	Phoenix	57319-559-06	麻醉剂
氢胆酸	Fisher	A1445-500	缓冲液
玻璃底盘	Willco	HBSB-5040	Willco 盘
子 可重复使用的粘合剂	Bostick	371351	Blu-Tack
硅弹性体	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
无绒擦拭布	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
小鼠脑基质	Roboz	SA-2175	切片纸巾
基质刀片	Roboz	RS-9887	切片组织
蠕动泵	Cole-Parmer	77122-24	灌注
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP5	显微镜
成像软件	Leica	LAS AF	显微镜