小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

摘要

光学透明化技术正在彻底改变组织成像的方式。在本报告中，我们描述了对原始的“清除脂质-丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶”（CLARITY）方案所进行的改进，这些改进可获得更一致且成本更低的结果。

摘要

传统上，组织可视化需要将目标组织进行连续切片和成像，而每一片组织切片都会经历独特的非线性形变，这极大地阻碍了对中枢神经系统（CNS）中细胞形态、分布及连接性的评估。然而，光学透明化技术正在改变组织成像的方式。这些方法允许研究人员深入观察完整器官样本，从而在健康和疾病状态下对组织的结构组织提供前所未有的洞察。例如，透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像兼容组织水凝胶（CLARITY）技术通过构建一种能够固定重要生物分子、同时允许散射光的脂质自由扩散出去的基质，实现了这一目标。在去除脂质后，再通过折射率匹配，使组织变得透明，从而可方便地进行三维（3D）成像。然而，原始CLARITY方案中使用的电泳组织透明化（ETC）技术在实际操作中较难成功实施，且所用的专有折射率匹配溶液导致该技术常规应用成本较高。本报告展示了如何实施一种简单且低成本的光学透明化方案，该方案结合了被动CLARITY以提高组织完整性，以及先前报道的折射率匹配溶液2,2′-硫代二乙醇（TDE）。

引言

对完整神经解剖结构进行成像的能力，对于理解健康和疾病状态下的大脑具有极其重要的价值。传统上，三维成像需要对组织进行切片，以获得轴向分辨率并可视化深层解剖结构。这种方法能够产生高分辨率的数据集，但需要复杂的图像重建技术，且劳动强度极大。因此，其应用一直局限于小体积组织的成像^1-3。相比之下，光学切片技术非常适合生成荧光标记组织的高分辨率三维图像。由于光学切片本质上是三维的，因此无需大量计算即可获得三维图像体积。然而，光散射和组织不透明性限制了组织光学切片的成像深度。在激光扫描共聚焦显微镜中，成像深度通常限制在约150 µm，而在双光子激发显微镜中也不超过800 µm^4-8。

为了克服这些局限性，近年来开发并进一步优化了多种光学透明化技术，以实现对完整组织的深层显微成像。使用苯甲醇和苯甲酸苄酯（BABB）使固定组织透明是最早的方法之一⁹。然而，该方法受限于样本中荧光信号的淬灭以及高度髓鞘化结构的透明化不完全¹⁰。该技术的改进方法，如溶剂清除器官三维成像法（3D Imaging of Solvent Cleared Organs, 3DISCO），实现了快速且完全的组织透明化，但仍存在荧光信号迅速丢失的问题，尤其是黄色荧光蛋白（YFP）¹⁰。基于水的透明化溶液，如Sca/e¹¹和SeeDB¹²，能够较好地保存荧光信号，但无法完全透....

方案

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行。本实验使用了 THY1-YFP、PLP-EGFP 和 PV-TdTomato 小鼠，但任何表达荧光蛋白的小鼠均可成功进行透明化处理和成像。

1. 组织制备

注意：多聚甲醛（PFA）和丙烯酰胺具有毒性且为刺激物。使用这些试剂进行实验时，必须在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。

1. 将动物放入安乐死舱，加入约 1 ml 异氟烷，直至呼吸停止（约 2 - 3 分钟）。
2. 使用蠕动泵以约 5 ml/min 的流速，在 4 °C 条件下经心脏灌注灌注液（表 1），直至组织中的血液完全清除（5 - 10 分钟）。
3. 将灌注液更换为固定液（表 1），在 4 °C 条件下继续灌注，直至颈部和尾部明显变僵硬（5 - 10 分钟）。
4. 停止灌注并切除动物头部。首先去除颅骨周围的结缔组织，然后从颅骨腹侧去除骨组织，并小心将脑组织取出（图 1a），操作方法如文献²⁰所述。
   注意：需特别小心去除小脑绒球小结叶周围以及嗅球周围的颅骨。
   1. 按照文献²¹所述方法，用精细尖头剪刀轻轻插入脊髓与椎骨之间，逐段剪开....

结果

可视化大脑的结构组织对于理解形态和连接性如何影响健康与疾病状态下的脑功能至关重要。光学透明化技术使得在完整组织中对细胞群体进行三维成像成为可能，从而能够系统性地研究细胞形态与连接性。

表达由特定细胞亚群启动子驱动的荧光蛋白的小鼠，可用于解析大脑中复杂的神经连接模式。THY1-YFP 转基因小鼠在光学透明化研究中被广泛使用，因为这类小鼠在大脑皮层和海马体以及其他脑区的某些投射神经元中表达 YFP。图 2a & b）。此外，YFP⁺ 大脑皮层V层神经元通过脊髓中的皮质脊髓束投射图 2c & d），因此在评估脊髓轴突损伤和/或伤害对皮层神经元的影响方面具有重要价值¹⁵通过使用共聚焦显微镜对光学透明化组织进行光学切片，可轻松评估大型解剖结构中神经元密度的差异。

讨论

水凝胶包埋组织的被动透明化技术（passive CLARITY）是一种简单且经济的组织透明化方法，适用于大块组织。该方法无需专用设备，可在温控摇床中轻松完成。经过数周时间，即使是全脑或脊髓等体积较大、高度髓鞘化的组织，也能变得透明，适合显微成像。尽管本报告主要关注中枢神经系统组织的透明化，但 passive CLARITY 可应用于任何类型的组织。

光学透明技术的相对优缺点此前已在文献中有所讨论^13,17,22,，但最清晰的总结见于文献²³。被动型CLARITY技术适用于需要同时处理大量样本且对可重复性要求较高的实验。利用水凝胶为组织提供额外支撑，有助于对组织进行多次探针标记。本报告中展示了小分子量染料DAPI的应用，但该方法同样可实现多轮抗体探针标记。

上述方法在几个关键方面与我们先前发表的方案¹⁵有所不同。首先，在当前的方法中，样本未通过心脏灌注水凝胶。这是因为水凝胶可能在灌注装置的管路和针头中过早聚合，导致灌注不完全和组织透明效果不一致。将经多聚甲醛固定的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher	BP399-1	缓冲液
32% 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15714-5	灌注与水凝胶
2,2'-硫代二乙醇（TDE）	Sigma-Aldrich	166782-500G	折射率匹配溶液
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140	水凝胶
2% 双丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0142	水凝胶
VA-044 引发剂	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	水凝胶
硼酸	Sigma-Aldrich	B7901	透明缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）	Fisher	BP166-5	透明缓冲液
氢氧化钠	Fisher	55255-1	缓冲液
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	52002-100G	防腐剂
吐温X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	缓冲液
肝素	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	灌注
硝酸钠	Fisher	BP360-500	灌注
DAPI	Molecular Probes	D1306	细胞核染料
99.9% 异氟烷	Phoenix	57319-559-06	麻醉剂
盐酸	Fisher	A1445-500	缓冲液
玻璃底培养皿	Willco	HBSB-5040	Willco培养皿
可重复使用粘合剂	Bostick	371351	Blu-Tack
硅胶弹性体	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
无尘擦拭纸	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
小鼠脑切片模具	Roboz	SA-2175	组织切片
模具刀片	Roboz	RS-9887	组织切片
蠕动泵	Cole-Parmer	77122-24	灌注
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP5	显微成像
成像软件	Leica	LAS AF	显微成像