本文描述了利用一种生物发光的非洲锥虫株系来追踪晚期感染，并展示了如何 体内 活体成像可用于实时观察中枢神经系统内的感染过程。
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本文内容
摘要
摘要
人类非洲锥虫病（HAT）是一种多阶段疾病，表现为两个阶段：早期血液阶段和晚期阶段，后者指寄生虫侵入中枢神经系统（CNS）的阶段。In vivo 对晚期阶段的研究受到限制，因为传统方法需要切除脑组织以确定寄生虫的存在。
生物发光成像是一种非侵入性、高灵敏度的光学成像技术，可实现对转染荧光素酶的病原体进行实时可视化观察。通过使用一种经转染且能够在小鼠体内引发晚期疾病阶段的锥虫株，我们能够在单个动物体内全程研究中枢神经系统感染的动力学过程，同时观察系统性感染中病原体的移动与播散情况。
本文介绍了一种利用非洲锥虫病生物发光模型研究中枢神经系统感染的可靠方案，可实现无创实时观察，并可结合可选的后续分析方法进行进一步研究。
引言
人类非洲锥虫病（HAT），又称昏睡病，是由通过媒介传播的Trypanosoma brucei种属原生动物寄生虫引起的1。目前每年估计病例数少于7000例，但非洲大陆约有7000万人面临感染该寄生虫的风险。该疾病若未经治疗，通常具有致命性，其病程包括早期血液淋巴系统阶段，此时寄生虫存在于血液中；随后进展至晚期阶段，寄生虫侵入中枢神经系统（CNS），此时对早期阶段使用的抗锥虫药物不再敏感2。目前针对晚期HAT的药物治疗方案复杂且疗程漫长，同时伴随严重不良反应，并已有耐药性报道，因此开发新型药物疗法的研究至关重要3,4。
在传统小鼠模型中研究晚期人类非洲锥虫病（HAT）耗时且复杂，需切除脑组织以监测寄生虫负荷5。动物感染株 T. b. brucei 被用作锥虫病的研究模型，其晚期阶段出现在感染后21天（dpi）。为了监测小鼠模型中野生型非生物发光寄生虫的感染情况，仅能通过外周血涂片或定量PCR来确定寄生虫负荷。对于脑内的寄生虫负荷，必须处死小鼠、取出脑组织，并对组织进行qPCR检测，这使得无法在晚期感染过程中多个时间点连续追踪寄生虫。因此，难以实现在中枢神经系统（CNS）内对感染过程的实时动态观察。
体内 生物发光成像（BLI）可在小鼠模型中高度灵敏、无创地检测寄生虫扩散和疾病进展过程，....
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方案
伦理学
所有工作均在英国国内事务部《1986年动物（科学程序）法》以及伦敦卫生与热带医学院动物实验伦理委员会的批准下进行。 &；热带医学动物福利与伦理审查委员会。本报告遵循ARRIVE指南。
1. 活体内 发光布氏布氏锥虫的传代
- 移除一份冷冻保存的菌种储备液（称为稳定剂） T. b. brucei 菌株 GVR35-VSL-2（可向伦敦卫生与热带医学院的 John Kelly 教授索取） & 通过 MTA 获取热带医学相关材料)9 从液氮中取出并恢复至室温。将稳定剂稀释至 2 x 104 布氏锥虫/ml，置于无菌磷酸盐缓冲葡萄糖盐水（PBS-G）pH 8.0（1 L PBS + 15 g葡萄糖）中10.
注意： T. b. brucei GVR35-VSL-2 对人类无感染性，但实验需在具备 SAPO 许可资质的设施中进行。 - 通过腹腔注射（i.p.）途径，使用25 G针头向一只20–25 g的雌性CD1小鼠注射0.2 ml稀释的锥虫。这是 "供体小鼠"将感染的小鼠放入特定病原体阴性（SPF）笼具中饲养 随意摄取.
注意：CD1小鼠为远交系品系 T. b. brucei GVR35....
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结果
本方案展示了如何通过感染小鼠T. b. brucei（人非洲锥虫病的动物模型）后追踪疾病进展。图1展示了实验方案的时间线，说明了治疗和成像步骤的时间安排。图2展示了一个典型的固定后吉姆萨染色血涂片视野，用于定量外周血中的寄生虫血症，其中可见锥虫和红细胞。可通过检测生物发光信号来追踪动物体内感染的发展情况，如图3所示，该图展示了同一实验过程中同一批动物在各个时间点的成像结果。在感染过程中，前21天内所有动物的生物发光信号均逐渐增强且分布更广，在脾脏区域出现高强度的BLI信号（热图尺度中以红色表示）。在第21天（D21），根据图1所述方案，在成像后给予二脒腙乙酸盐治疗，至第28天（D28）时可见生物发光信号下降，表明外周感染已被清除，仅在小鼠头部区域残留低水平信号。至第35天（D35），信号仍持续存在于头部区域且强度增加，提示可能存在脑部感染。随后取出脑组织以确认生物发光信号确实存在于脑组织内，并可通过qPCR进行定量分析。.......
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讨论
生物发光型 T. b. brucei GVR35 菌株的建立使得从早期到晚期全程可视化锥虫感染成为可能。以往的感染模型无法实时检测晚期阶段（即寄生虫已进入脑部）的感染情况，必须通过处死感染小鼠并取出脑组织来确定寄生虫负荷12。生物发光技术降低了个体小鼠间的差异，因为可对同一只小鼠在整个感染过程中进行连续追踪，并在任何阶段快速进行定性评估。生物发光成像具有高度敏感性，能够比血涂片显微镜检查更早地发现低水平感染，成像技术可检测到低至100个锥虫，而显微镜检查的检测下限为每毫升5 × 103个锥虫9。此外，通过全程追踪同一批动物，无需为每个时间点设置独立的动物组，从而显著减少了实验动物的使用量。
此处所述的成像方案可根据科学需求进行调整，由于其具有非侵入性，因此可以在获得适当动物伦理批准的前提下，进行更多次和更频繁的成像；但针对脑部感染的评估，第21天（D21）是最小时间点。此时，早期阶段药物已无法有效清除晚期阶段的寄生虫。同时，必须确保小鼠在每个时间点均在相同条件下进行成像。例如，应使用相同的曝光时间以.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢约翰·凯利（John Kelly）和马丁·泰勒（Martin Taylor）（伦敦卫生与热带医学院） & 热带医学）提供 T. b. brucei GVR35-VSL-2 以及伦敦卫生与热带医学院的 Andrea Zelmer 博士提供的建议 体内 成像。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会全球健康项目（资助编号 OPPGH5337）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | Sigma，英国 | P4417 | pH 7.4 的片剂 |
| 葡萄糖 | Sigma，英国 | G8270 | 99.5%（分子级） |
| 氯化铵 | Sigma，英国 | A9434 | 99.5%（分子级） |
| 肝素（锂盐） | Sigma，英国 | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco，Life Technologies，英国 | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma，英国 | D4031 | 无菌过滤 |
| Mr. Frosty | Nalgene，英国 | ||
| 吉姆萨染液 | Sigma，英国 | G5637 | |
| D-荧光素 | Perkin Elmer，英国 | ||
| Sigma，英国 | 115144-35-9 | ||
| 二脒那嗪乙酸盐 | Sigma，英国 | D7770 | 分析纯 |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer，英国 | 其他生物成像仪也可使用 例如 Bruker、Kodak 的产品 | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer，英国 | Perkin Elmer IVIS 仪器的专有软件；其他仪器可能配备各自的软件 | |
| 1 ml 注射器 | Fisher Scientific，英国 | 10142104 | |
| 20 ml 注射器 | Fisher Scientific，英国 | 10743785 | |
| 25 G 针头 | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G 针头 | Greiner Bio-one | N2138 | |
| 双面磨砂载玻片 | VWR，英国 | 631-0117 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | StarLab，英国 | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou 管 | StarLab，英国 | E1412-0710 | |
| 小鼠固定器 | Sigma，英国 | Z756903 | 我们的固定器为自制，此为类似型号 |
参考文献
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R.
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重印与许可
