注射同源小鼠黑色素瘤细胞以评估其在肺部的转移潜能

摘要

转移在癌症的致病性中起着至关重要的作用，据估计导致约90%的癌症死亡。我们报道了一种用于小鼠的转移性黑色素瘤模型方案，该模型可用于评估治疗药物针对这一临床现象的有效性。

摘要

大约90%的人类癌症死亡与转移有关。尽管癌症转移普遍存在且危害严重，但目前仍缺乏有效的治疗或预防手段。本文报道了一种在小鼠中建立肺转移的方法，可用于研究这一现象。将B16-BL6细胞通过尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内，是黑色素瘤转移研究中最常用模型之一。部分循环肿瘤细胞会在小鼠肺部定植，形成“实验性”转移灶。利用该模型可评估治疗药物对癌症转移发展的相对影响。通过比较经治疗与未治疗小鼠肺部转移灶数量的差异，可判断抑制转移的效果。然而，在开展药物干预研究之前，必须首先确定用于定量分析转移灶的B16-BL6细胞最佳接种数量。注射过多细胞可能导致转移灶过度增多，影响准确定量，并掩盖抗癌疗法的作用效果；而注射过少细胞则会妨碍治疗组与对照组之间的有效比较。

引言

转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。癌细胞的转移扩散过程尚不完全清楚，但似乎涉及多个步骤，包括侵入邻近组织、进入淋巴系统和血管系统、在循环系统中存活并迁移、从转移部位的血管中渗出、适应新位点的微环境，以及通过增殖形成继发性肿瘤¹。这些生物学事件均涉及转移性肿瘤细胞的转化、播散和存活。例如，肿瘤细胞从上皮表型向间充质表型转化，并与细胞外基质成功相互作用，使其能够侵入邻近组织并扩散至身体其他部位^2,3。此外，这些转移性细胞必须在循环血液中存活，并逃避免疫系统的监视^4,5。最后，当肿瘤细胞植入体内远端部位时，必须适应其微环境，才能增殖并形成继发性肿瘤^6,7。因此，尽管转移在癌症患者中是一种常见现象，但转移性肿瘤细胞存在多个可被治疗干预的脆弱环节。

鉴于黑色素瘤具有免疫原性，以及近年来对免疫疗法的关注，黑色素瘤模型正变得越来越有价值。⁸ 仅在美国，黑色素瘤每年估计导致约9,000人死亡。⁹ 黑色素瘤常见的转移部位包括骨骼、脑、肝脏和肺。大多数远处转移通过血液传播发生。循环中的肿瘤细胞必须逃避免疫清除，到达远端器官的毛细血管床，并穿过血管内皮细胞，才能成功定植。^{4-7,10, 11}

为了模拟常见的高致病性转移现象，研究人员建立了小鼠B16-BL6细胞系。B16-BL6是亲代C57BL/6黑色素瘤细胞系B16-F0的衍生细胞系，经过连续10次通过尾静脉注射筛选肺转移能力（获得B16-F10），再经过连续6次筛选膀胱膜穿透能力而最终获得¹²。因此，该细胞系是建立小鼠转移灶的可靠黑色素瘤细胞系，尤其适用于尾静脉注射¹³。

将足量的B16-BL6细胞注射到B57BL/6小鼠尾静脉后，经过两周或更长时间以允许B16/BL6细胞植入并生长，肺部将形成转移灶。在实施安乐死后，通过解剖显微镜观察，可对存在的单个转移灶数量进行定量。由此可建立剂量-转移效应关系，因为注射的B16-BL6细胞数量与肺表面形成的转移灶数量相关。该模型被称为"实验性转移"，即将已知具有转移能力的细胞直接引入血液循环，从而促进其在肺、肝或其他研究器官中快速且可预测地扩散和定植。这与"自发性转移"相对，后者通常将肿瘤细胞植入皮下，转移灶则起源于自然脱落的癌细胞。^14,15

向小鼠尾静脉注射适量的 B16/BL6 细胞至关重要。注射细胞过多，肺部将布满转移灶，相邻病灶之间将难以区分；注射过少，则由于不同注射操作之间固有的差异，治疗剂的作用效果将无法被察觉。为了在 C57BL/6 小鼠肺部获得数量理想的病灶，有必要将注射的细胞数量与肺表面形成的转移性病灶数量相关联，同时考虑各个病灶的可分辨性。本方案将演示一种用于 C57BL/6 小鼠的转移性小鼠黑色素瘤模型。

方案

伦理声明：在研究中使用小鼠仅在可能促进人类对基础生物学的理解或最终疾病治疗的情况下才是可接受的。

1. 订购

1. 购买6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，每组5只。让小鼠适应数天。

2. B16-BL6 细胞的制备

1. 从37摄氏度培养箱中取出细胞培养板，放入无菌操作台。此时培养板中的B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞融合度应约为70%。过高的融合度可能改变细胞的转移潜能。
2. 每块培养板加入1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，静置1分钟，然后吸除胰蛋白酶-培养基混合液。
3. 每块培养板再加入1 ml胰蛋白酶溶液，并将培养板放回培养箱中孵育10分钟。
4. 将培养板从培养箱转移至无菌操作台后，向每块培养板中加入4 ml无血清的罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）。
5. 使用无菌电动移液器收集细胞。将移液器枪头以轻微倾斜的角度紧贴培养板底部反复吹打，使细胞充分解离。重复多次，以确保细胞团块充分分散，避免堵塞后续注射针头。重新收集细胞悬液并转移至50 ml锥形管中。
6. 使用血细胞计数板测定细胞密度。在保持B16-BL6细胞总数不变的前提下，计算所需无血清RPMI培养基的体积，以配制终浓度分别为0、0.065、0.015、0.25和0.5×10⁶个细胞/ml的细胞悬液。
7. 将50 ml锥形管中的细胞悬液等量分装至15 ml锥形管中。在2,250 × g离心5分钟。弃去上清液。加入适量无血清RPMI培养基，通过血细胞计数板确认目标细胞密度。根据需要，通过添加额外RPMI或离心后重悬于较小体积中，调整细胞密度。
8. 将每种细胞悬液各500 µl分装至预先标记并置于冰上的1.8 ml离心管中。

3. 尾静脉注射

1. 取一只小鼠，抓住其尾巴，将其尾部朝向引导进入小鼠固定器中。将躯干置于固定器主腔内，尾巴留在外侧，将小鼠拉向固定器末端。插入固定器推杆，持续推动直至小鼠被牢固固定。
2. 将小鼠旋转 90度，使一侧尾侧静脉朝上。使用酒精棉片用力擦拭小鼠尾巴侧面，特别是尾静脉最清晰可见的区域。
   注意：良好的照明对于在B57BL/6J小鼠上有效观察尾静脉至关重要。加热灯或加热手术垫虽非必需，但可通过扩张尾静脉体积而提供帮助。
3. 在无菌培养罩内，从浓度为2百万细胞/毫升的试管中吸取300 µl细胞培养基。翻转针头，轻弹侧面并推动推杆，以排出注射器内的气泡。排出部分培养-RPMI，使最终体积为250 µl。
4. 用非惯用手伸直小鼠尾巴。用非惯用手的食指托起尾巴近端，拇指压住远端，使尾巴保持伸展状态。
   注意：通过此方式，尾静脉可保持在侧向位置，与固定器表面平行，便于在尾巴更远端的位置进行一致的穿刺进入。
5. 将针头以微小的向下角度刺入尾静脉，起始时朝向远端，随着进一步插入，调整针头方向以匹配尾静脉的走向（相对于针头降低注射器推杆端）。
6. 将针头插入尾静脉约1 cm。插入后开始推动推杆，同时保持针头稳定。
   注意：若针头位于尾静脉内且针尖未受阻，培养基应顺畅流入静脉，无任何阻碍。 有效注射的特征是静脉内血液被迅速冲走。若感到阻力，或注射部位开始形成气泡，应立即拔出针头，并在尾静脉更近端的位置重新尝试。 
7. 拔出针头并丢弃。用纱布按压穿刺部位以止血。
8. 取出固定器的推杆，将小鼠放入受体笼中。
9. 对所有其他浓度重复上述操作。
   注意：肺部病灶的形成大约需要2至3周，具体时间因细胞系及所需病灶大小而异。⁹ 在此期间，应持续监测小鼠是否出现需提前实施安乐死的症状，例如过度喘息。 

4. 计数肺部病灶

1. 将小鼠放入 CO₂ 安乐死舱，以每分钟 10-30% 舱体体积的速度通入 100% CO₂，持续 5 分钟，随后进行颈椎脱臼。 
2. 将小鼠仰面固定于泡沫板上，使用手术剪沿胸骨做手术切口。
3. 从胸骨切口顶端向小鼠双肩方向分别做两个附加切口，暴露肋骨 cage。
4. 沿胸骨两侧各做一剪切，移除肋骨 cage，暴露肺和心脏。
5. 用手术镊夹住心脏，剪断食管和气管，将心脏和肺从小鼠体内分离。将组织置于解剖显微镜下，在 10 倍放大倍数下观察，以获得更清晰的视野。
6. 将心脏从肺组织中分离，并移除胸腺，仅保留两片肺。
7. 在解剖显微镜下观察肺组织，开始计数肺部病灶。每个病灶应表现为肺表面圆形的棕褐色突起。
   1. 为保证小鼠间计数的一致性，先计数肺叶表面的病灶数量，然后翻转该肺叶。依次单独处理四个肺叶，有助于更准确地计数。
8. 如需进行免疫组化（IHC），则保存并固定肺组织；否则，丢弃剩余组织。

结果

通过肉眼观察，表面病灶的差异显而易见。在解剖显微镜下计数肿瘤数量，应能获得注射肿瘤细胞数与形成且可计数的病灶数之间的线性关系。使用最佳数量的可注射细胞时，应达到肺部既不被完全覆盖（如图1A中500,000个细胞/ml的情况），也不过于稀疏（如62,500个细胞/ml和125,000个细胞/ml的情况）。这一结果也可通过线性相关性进行量化（图1B）。

图1. 尾静脉注射B16/BL6细胞后小鼠肺部病灶结果。(A) 在C57BL/6小鼠肺表面可观察到呈褐色圆形团块的肺部病灶（箭头下方为典型病灶示例）。随着注射细胞培养物密度（每张图像上方）的增加，相应出现的肺部病灶数量（每张图像下方）也随之增多。注射细胞密度最高的小鼠，其肺部病灶的肉眼可见覆盖范围最大。比例尺表示20 mm。(B) 肺部病灶数量与细胞培养密度的关系。根据血细胞计数板测定，当细胞密度高于125,000 个/ml时，二者之间呈近似线性关系。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过尾静脉注射的循环肿瘤细胞代表了那些逃避原发灶生长部位，并通过血液或淋巴系统等途径迁移的转移细胞，偶尔会在远端位置的毛细血管床中定植。¹⁴ 上述方案可作为继发性转移的模型。在注射适量B16-BL6细胞的情况下，实验人员可评估给药药物或免疫细胞群体在中和处理后对癌细胞转移的相对影响。

该方案存在局限性。循环肿瘤细胞因其具有转移能力而被筛选出来，因此不具备免疫原性，其主要组织相容性复合体I类分子水平较低¹²。此外，大量转移灶突然且成簇地出现，与患者体内典型的转移过程不同，在后者中，少量转移性肿瘤细胞会从原发肿瘤部位在较长时间内逐渐播散。另外，通过静脉注射引入的肿瘤细胞来源于组织培养，而非原发性肿瘤。因此，这些细胞与因细胞黏附、迁移、免疫识别及在受体器官定植等过程发生改变而形成的继发性转移灶存在差异^15,16。

另一种方案是皮下注射B16/BL6细胞以生成原发性肿瘤，并分析由此产生的"自发性"肺转移灶。研究发现，这些"自发性"转移灶比"实验性"转移灶具有更高的异质性，更接近人类患者的转移特征。该方案在评估实验化合物对转移影响方面存在局限性。通过侧尾静脉注射，可使用血细胞计数板估算注入血液中的黑色素瘤细胞数量；然而，在"自发性"转移模型中，肿瘤之间的异质性更大，导致最终肺部病灶数量增加了额外的变异性。¹⁶

综上所述，尾静脉注射B16-BL6小鼠黑色素瘤模型是一种用于评估治疗或免疫疗法对转移影响的简单模型。通过静脉注射循环肿瘤细胞，研究人员可在一定程度上模拟患者在肿瘤转移后的状态。鉴于转移性肿瘤细胞对癌症患者具有破坏性作用，该模型是研究转移多步骤过程的有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶	Corning	MT25052CV
RPMI 1640 培养基	Corning	MT15040CM
相差血细胞计数板	Hausser	02-671-54
微型精细胰岛素注射器（IV型）	BD	14-829-1D
无菌酒精消毒片	Fisherbrand	22-363-750
小鼠固定器	Braintree Scientific	NC9999969	固定器的选择取决于小鼠的年龄/体型
加热垫	Harry Schein	NC0012697	可选