一种高产率的一步法负向纯化重组蛋白方法 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌中过表达的中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP） 大肠杆菌 通过使用二乙氨基乙基树脂进行批次纯化的方法进行了描述。采用该方法纯化的HP-NAP有助于开发针对幽门螺杆菌的疫苗、药物或诊断试剂 H. pylori相关疾病.
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摘要
摘要
幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白（HP-NAP）是幽门螺杆菌（H. pylori）的一种主要毒力因子。它通过激活多种天然免疫白细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和肥大细胞），在H. pylori诱导的胃部炎症中发挥关键作用。HP-NAP具有免疫原性和免疫调节特性，使其成为H. pylori诊断和疫苗开发的潜在候选分子，同时也是一种新型癌症治疗药物的候选物。为了获得足量高纯度的HP-NAP以用于临床应用，亟需建立一种高效、高产且高纯度的蛋白纯化方法。
在本方案中，我们描述了一种一步法阴离子层析纯化在大肠杆菌中过表达的重组HP-NAP的方法 大肠杆菌 (E. coli) 通过使用二乙氨基乙基（DEAE）离子交换树脂（例如，Sephadex）进行批量纯化。重组HP-NAP约占总蛋白的70% E. coli 在pH 9.0条件下细胞裂解后，几乎全部存在于可溶性组分中。在pH 8.0的最佳条件下，大部分HP-NAP存在于未结合组分中，而内源性蛋白质则来自 E. coli 可被树脂高效去除。
利用DEAE离子交换树脂进行负模式分批色谱纯化的方法，能够以高得率和高纯度从大肠杆菌（E. coli）中获得天然形式且具有功能活性的HP-NAP蛋白。纯化后的HP-NAP可用于幽门螺杆菌（H. pylori）相关疾病的预防、治疗和预后，以及癌症治疗。
引言
幽门螺杆菌 (H. pylori) 是导致胃炎和消化性溃疡的主要原因。1994年，世界卫生组织下属的国际癌症研究机构已将该细菌归类为人类致癌物。据估计，其感染率 H. pylori 在发展中国家感染率为70%，在工业化国家为30-40%1。尽管感染率 H. pylori 在工业化国家呈下降趋势，但感染率 H. pylori 在发展中国家仍然很高2. 根除的标准治疗方法 H. pylori 感染治疗包括给予一种质子泵抑制剂（PPI）和两种抗生素，即克拉霉素联合阿莫西林或甲硝唑3然而，抗生素耐药性的上升 H. pylori相关溃疡治疗迫切需要开发新的策略以预防或治愈感染。针对该感染的预防性和/或治疗性疫苗的研发 H. pylori 可提供一种控制的替代方法 H. pylori 感染
Helicobacter pylori 中性粒细胞活化蛋白（HP-NAP）是 H. pylori 的一种主要毒力因子，最初在 H. pylori 的水提取物中被发现，具有激活中性粒细胞使其黏附于内皮细胞并产生活性氧（ROS）的能力4。在患有活动性胃炎的 H. pylori 感染患者中，....
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方案
人血样来自中国台湾新竹市国立清华大学机构审查委员会批准并签署知情同意书的健康志愿者。
1. 重组HP-NAP的表达 E. coli
- 准备含有幽门螺杆菌中性激活蛋白（HP-NAP）DNA序列的质粒pET42a-NAP H. pylori 26695 菌株，如先前所述16. 按照所述方法制备含有目标点突变HP-NAP DNA序列的质粒（见方案，步骤8）。
- 将上述DNA质粒10 ng转化至 E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞在 42 °C 下热激 45 秒，将细胞涂布于含有 50 µg/ml 的溶菌肉汤（LB）琼脂平板上 卡那霉素，并在37 °C下孵育平板16小时。
- 接种单个菌落至分别含有5 ml的试管中 在含有50 µg/ml卡那霉素的LB肉汤中培养，37 °C、170 rpm振荡培养16小时，作为预培养物。
- 将上述预培养的菌液2 ml接种至含有50 µg/ml卡那霉素的200 ml LB液体培养基中，置于1 L锥形瓶内。将接种后的培养瓶在37 °C、170 rpm振荡条件下培养约2小时，直至紫外-可见分光光度计测定的600 nm处吸光度达到约0.4–0.5。
- 向上述培养物中加入80 µl的1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使终浓度为0.4 mM，以诱导HP-NAP的表达。继续培养3小时，直....
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结果
重组HP-NAP在负向纯化实验流程示意图 E. coli 通过分批模式使用DEAE离子交换树脂的示例示于 图1该纯化技术基于宿主细胞蛋白及/或除HP-NAP以外的杂质与树脂的结合。在pH 8.0条件下，未结合组分中几乎不回收除天然形式HP-NAP以外的其他蛋白质（图2A 和 B）。通过抗HP-NAP抗体在未结合组分中对纯化的HP-NAP进行免疫检测（图2C），其纯度经银染验证高于97%图 2D）。此外，通过天然PAGE分析发现，纯化的重组HP-NAP保持了其寡聚体形式（图2B) 和凝胶过滤层析（图3A）。圆二色光谱分析表明，纯化的蛋白质主要由α-螺旋构成（图3B）。此外，纯化的HP-NAP能够刺激人中性粒细胞产生ROS（图3C因此，通过该方法纯化的重组H.......
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讨论
采用DEAE阴离子交换树脂的负模式批次色谱法适用于纯化在大肠杆菌中过表达的重组HP-NAP 大肠杆菌细胞裂解和纯化步骤中所用缓冲液的pH值对于确保HP-NAP的溶解度至关重要 E. coli 裂解物及高效分离重组HP-NAP与宿主细胞杂质。细菌细胞应在pH 9.0条件下裂解，负相纯化应在pH 8.0条件下进行，以获得高得率和高纯度的HP-NAP。HP-NAP的典型回收率为90%，典型纯度为95%24由于HP-NAP存在于未结合组分中，应使用最小但足量的树脂，以实现其对杂质的最大吸附能力。在本实验中，最大载样量为每1.5 mg可溶性蛋白质 E. coli 每毫升树脂对应的裂解液量。
所提供的方案旨在从50 ml样品中纯化重组HP-NAP E. coli 培养. HP-NAP 的产量约为 15 mg。纯化过程可根据需要进行相应缩小或放大。例如，两种重组 HP-NAPY101H 和 HP-NAPE97GY101H 突变体从1中纯化&#.......
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披露
HWF 和 YCY 是专利 TW I 432579 和 US 8,673,312 的发明人，该专利涉及一步法纯化方法 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白。论文中描述的所有材料均可用于科研目的。作者确认，此声明不会改变其对JoVE所有数据与材料共享政策的遵守。
致谢
我们感谢中国台湾国立清华大学的程超生博士协助完成圆二色性测量。我们还感谢美国梅奥诊所的Evanthia Galanis博士和Ianko D. Iankov博士提供抗HP-NAP单克隆抗体。我们感谢中国台湾新竹马偕纪念医院的张汉文博士和陈仲珠博士在伦理审查委员会（IRB）申请方面提供的建议，感谢中国台湾新竹马偕纪念医院的蔡德隆先生对分离中性粒细胞分析工作的指导，以及感谢中国台湾国立清华大学的翁郁晨女士提供的技术协助。本研究得到了中国台湾科技部资助项目（MOST 104-2311-B-007-003、NSC101-2311-B-007-007 和 NSC98-2311-B-007-006-MY3）、国立清华大学与马偕纪念医院联合研究计划（100N7727E1、101N2727E1、103N2773E1）以及国立清华大学研究计划（104N2052E1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | 制备方法见参考文献15的补充数据 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | 赛默飞世尔科技公司 | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| 卡那霉素 | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | MD Biomedical 公司 | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma-Aldrich | 10837091001 | 蛋白酶抑制剂 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮（TLCK） | Sigma-Aldrich | T7254 | 蛋白酶抑制剂 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK） | Sigma-Aldrich | T4376 | 蛋白酶抑制剂 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| 蛋白标准品（牛血清白蛋白） | Sigma-Aldrich | P5619 | Bio-Rad 蛋白测定试剂盒的标准蛋白 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 氯化物形式 | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por 透析管 | Spectrum Laboratories | 132720 | 截留分子量为14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® 单元，含 Mustang® E 膜 | Pall | MSTG25E3 | 用于去除内毒素；操作流速范围为1至4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| 小鼠单克隆抗体 MAb 16F4 | N/A | N/A | 针对幽门螺杆菌NCTC 11637菌株纯化的HP-NAP制备，方法见参考文献23；由美国梅奥诊所Evanthia Galanis博士和Ianko D. Iankov博士惠赠 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE 医疗生命科学 | 28989335 | 用于凝胶过滤层析 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne 银染试剂盒（蛋白） | GE 医疗生命科学 | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE 医疗生命科学 | 17-1440-02 | 用于密度梯度离心法纯化人中性粒细胞 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| 平底96孔白色板 | 赛默飞世尔科技公司 | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| 鲁米诺 | Sigma-Aldrich | A8511 | 避光保存 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand 长片段PCR系统 | Sigma-Aldrich | 11681834001 | 高保真PCR酶混合物来源 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | 新英格兰生物实验室 | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | 新英格兰生物实验室 | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | 赛默飞世尔科技公司 | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| 名称 | 公司 | 产品编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| U-2800 双光束紫外/可见分光光度计 | 日立 | N/A | 已退市并升级为新型号 http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 高压均质机 | Avestin 公司 | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| 日立工机 himac CP80WX 通用超速离心机 | 日立工机株式会社 | 90106401 | 用于从E. coli 裂解液中分离可溶性和不溶性蛋白组分 http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE 医疗生命科学 | 18-1900-26 | 用于凝胶过滤层析 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS 圆二色光谱仪 | Aviv Biomedical | N/A | 已退市并升级为新型号 http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 成像系统 | 富士胶片 | N/A | 已停产并被替代 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) 多功能微孔板检测仪 | 珀金埃尔默 | 1420-018 | 用于化学发光检测 http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
参考文献
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer....
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重印与许可
