测量放射性标记底物在Drosophila melanogaster中产生的二氧化碳

摘要

本文介绍了一种测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）燃料氧化的方法，该方法通过向果蝇喂食微量特定的放射性标记代谢底物，收集并测定燃料氧化所产生的呼出放射性标记的CO₂。

摘要

力量 黑腹果蝇 遗传学正越来越多地应用于研究激素信号传导与代谢问题，以及利用该生物体构建人类疾病模型。为了推动对果蝇等小型动物生理学和疾病机制的理解，亟需灵敏的方法来测量其代谢率等参数。本文所述方法通过检测摄食了含微量标记底物食物的少量成年果蝇的燃料氧化情况，实现对代谢活性的评估。 ¹⁴C标记的底物，如葡萄糖或脂肪酸。在饲喂期及任何其他实验处理结束后，将果蝇转移至带有网状封口的短管中，然后将短管放入含有KOH饱和滤纸的玻璃小瓶内，以捕获果蝇呼出的放射性标记的CO₂。₂ 由放射性标记底物氧化生成的碳酸氢钾（KHCO₃）₃通过闪烁计数法测定放射性标记的碳酸氢盐。这是一种定量、可重复且简便的方法，用于研究燃料分子的氧化。利用放射性标记的葡萄糖、脂肪酸或氨基酸，可确定这些不同能源物质在不同条件（如进食与禁食状态）以及不同遗传背景下对能量代谢的贡献。该方法可与其他用于测量能量代谢的手段相互补充。 体内 能量代谢，并应加深对代谢调控的理解。

引言

模式生物中的研究工作 Drosophila melanogaster 极大地促进了对遗传学原理、发育过程、生长、衰老、行为、免疫以及人类疾病的理解^1,2. 遗传学和细胞生物学领域的多种方法 果蝇 推动了这些领域的进展。然而，由于在如此微小的动物中测量代谢参数存在较大困难，果蝇代谢研究的发展相对缓慢。人们对利用果蝇作为模型研究代谢的兴趣正在增加 果蝇 作为研究糖尿病等人类疾病以及理解代谢对生长和各种病理过程影响的模型，推动了该领域为这种生物体开发和改进代谢研究技术^3,4.

目前已有可靠的方法可用于测量果蝇的多种代谢参数。例如，可直接测定食物摄入量⁵、甘油三酯和糖原的储存水平，以及血淋巴中葡萄糖和果蝇主要循环糖——海藻糖的浓度，其中海藻糖是由两分子葡萄糖组成的二糖⁴。利用代谢示踪剂，可研究营养物质从食物中的吸收过程，以及吸收后的营养物质（如葡萄糖）转化为糖原和甘油三酯等储存形式的过程⁶。通过测定氧气消耗量^7,8和二氧化碳（CO₂）生成量，可评估果蝇的代谢速率。柠檬酸循环可氧化乙酰辅酶A（CoA）形式进入循环的二碳单位，而乙酰辅酶A来源于膳食和储存的碳水化合物及脂肪酸的代谢。每完成一轮循环，可生成一分子GTP（或ATP）和作为电子供体的FADH₂、三分子NADH，以及两分子代谢废物CO₂。通过CO₂生成量可估算基础代谢率。在Drosophila中，可使用 commercially-available 或自制的呼吸测定仪来定量总CO₂生成量^9-10,11。

总二氧化碳（CO₂）生成量的测定，尤其是结合氧气（O₂）消耗量的测定，可为机体整体能量代谢提供重要信息。然而，该指标无法识别用于三磷酸腺苷（ATP）生成的被氧化营养物质。三类主要营养物质在转化为乙酰辅酶A（acetyl CoA）后可进入三羧酸循环：碳水化合物、脂肪酸和蛋白质。来自膳食葡萄糖或储存糖原的葡萄糖-6-磷酸可转化为丙酮酸，后者经丙酮酸脱氢酶脱羧生成乙酰辅酶A。来自膳食或储存甘油三酯的脂肪酸通过β-氧化分解产生乙酰辅酶A，随后进入三羧酸循环。最后，大多数氨基酸在转化为丙酮酸、乙酰辅酶A或三羧酸循环中间产物（如α-酮戊二酸）后，也可进入三羧酸循环。

在基础状态和刺激条件下，可通过放射性示踪剂监测特定营养物质对能量代谢的贡献。本文所述方案改编自用于评估培养细胞氧化能力的实验方法^12,13，适用于黑腹果蝇（Drosophila）。该方法中，果蝇在短时间内（数小时）或长时间内（数天）摄取含有¹⁴C标记的代谢底物（如碳水化合物、脂肪酸或氨基酸）的食物，随后转移至未标记的食物中进行“追踪”阶段，再暴露于含有氢氧化钾（KOH）饱和滤纸的密闭 chamber 中，以将呼出的CO₂捕获为碳酸氢盐。通过闪烁计数法可定量检测放射性标记的 碳酸氢盐。不同实验组果蝇在放射性标记的CO₂产生量上的差异，可能反映了在长期禁食过程中所使用的能量底物不同，或不同基因型之间在燃料代谢上的内在差异。

方案

1. 含放射性标记代谢底物的果蝇食物制备

1. 在微量离心管中，将1 - 2 µCi放射性标记底物（D-[6-¹⁴C]-葡萄糖、D-[1-¹⁴C]-葡萄糖或[1-¹⁴C]-棕榈酸，40 - 60 mCi/mmol）与15 µl FD&C No. 1蓝色食用染料及H₂O混合，总体积为25 µl。
   注意：碳-14是一种低能量β射线发射体，在空气中的射程较短。然而，必须小心防止放射性标记分子的溢出或实验人员意外摄入。果蝇培养管容易倾倒；务必将其放置于可防止倾倒的容器中，尤其是在放射性标记物处于液态（步骤1.2）或未凝固食物中（步骤1.4）时。正在摄食或已摄食放射性标记底物的果蝇会开始呼出少量放射性标记的CO₂。这些果蝇应饲养在通风橱内的丙烯酸盒中，并可在盒内放置一小碟KOH作为CO₂吸收剂。
2. 用移液器将全部放射性标记底物与蓝色染料的混合液加入空的果蝇培养管底部（高度：9.4 cm，宽度：2.2 cm）。
3. 将标准果蝇食物在微波炉中加热，直至食物刚好液化（高功率下加热一个含10 ml食物的培养管约15 - 20秒）。
4. 向放射性标记底物与蓝色染料的混合液中加入975 µl熔融食物，并迅速涡旋混匀，通过观察蓝色是否均匀分布来确保混合完全。
5. 让食物在室温下冷却并完全凝固，持续20 - 30分钟。

2. 向成年果蝇喂食放射性标记的代谢底物

1. 使用 CO₂ 麻醉成年果蝇₂ 由多孔聚乙烯与丙烯酸基座熔接而成并连接至CO的麻醉装置₂ 带有压力调节器的气罐。通入CO₂ 以5 L/min的流速通入麻醉装置。
   1. 将麻醉后的果蝇转移至含有放射性标记并添加蓝色染料的食物的小瓶中（每瓶15–30只果蝇）。用泡沫塞封口，水平放置直至果蝇苏醒。将小瓶转移至带盖的亚克力容器（180 cm × 180 cm × 240 cm 高）中。
2. 短期饲喂时，先将果蝇饥饿处理18–24小时，然后转移至放射性标记的食物中饲喂2–3小时。 T饥饿处理步骤非常重要，因为喂食充足的果蝇不会稳定地摄取新提供的食物。对于持续5至7天的长期喂养，果蝇无需进行饥饿处理，但实验人员应监测果蝇饲养瓶中放射性标记食物的水分含量，并使用针头和注射器向食物干燥的瓶中补充水分。
3. 将果蝇转移至无标记的食物中 "轻敲" 将它们转移至一个新的离心管中。初始追迹期为2–4小时，以使果蝇清除体壁上的放射性标记食物颗粒，并完成肠道内残留放射性食物的消化。通过肉眼观察果蝇腹部是否呈现蓝色，监测食物在肠道中的推进情况。
4. 随后，将果蝇转移至不同类型的食物（在标准食物或1%琼脂上饲养12–24小时，以检测摄食与禁食状态对呼吸作用的影响）或不同环境温度下（在18 ˚C或30 ˚C条件下处理12–96小时，用于利用温度敏感型GAL80（GAL80^ts），用于 例如).
   注意：此追踪时间的长短将根据所进行的实验而有所不同。对于 例如，对于使用GAL80的实验，可能需要在30 ˚C下进行96小时的追踪^ts 以充分激活GAL4依赖的转基因表达。

3. 一氧化碳的制备₂收集装置

1. 准备材料以制作"果蝇培养舱"，即带有网帽的试管，用于容纳标记有¹⁴C-葡萄糖或¹⁴C-棕榈酸的果蝇，并保持与大气相通。将12 mm × 75 mm的聚丙烯试管顶部50 mm部分切除，留下25 mm长、圆底的试管。准备35 mm × 35 mm的130 µm尼龙网片。同时准备好装在胶带分配器中的透明胶带。
2. 准备CO₂收集装置所需材料。每个果蝇培养舱需配备一个20 ml玻璃闪烁瓶、一个带有偏心孔的橡胶塞、一个可插入橡胶塞孔中的中心小室，以及GF/B级玻璃微纤维滤纸（直径2.1 cm的圆形，孔径1 µm）。选用GF/B滤纸是因为其具有较高的湿强度和高负载能力。
3. 在使用当天新鲜配制5% KOH溶液。在步骤3.4开始前，将圆形GF/B滤纸折叠后放入穿过橡胶塞孔的中心小室中，并加入100 µl的5% KOH使其充分浸润。参见图1。
4. 在未标记培养基上孵育后，用CO₂麻醉果蝇。用毛刷将果蝇转移至截短的聚丙烯试管中，用尼龙网片封口，并用透明胶带将网片固定在试管上。操作应迅速，以防止果蝇在网片固定前苏醒并逃逸。在同一实验中，每个果蝇培养舱应使用相同数量的果蝇；每个培养舱放置10–20只果蝇可产生足够的放射性标记CO₂，以便通过液体闪烁计数（见下文步骤4.1）进行检测。
5. 将果蝇培养舱转移至20 ml玻璃闪烁瓶中。用带有含KOH浸润GF/B滤纸中心小室的橡胶塞密封玻璃瓶。将橡胶塞的宽顶部翻折覆盖在玻璃闪烁瓶的瓶口边缘。参见图1。
6. 将装有果蝇的玻璃瓶置于带盖的丙烯酸容器中，在不同时间（2–12小时效果良好）进行孵育。

4. 结果分析

1. 孵育结束后，打开玻璃小瓶，将浸有KOH的GF/B滤纸转移至含有4 ml闪烁液的6 ml塑料闪烁瓶中。
2. 如有需要，将果蝇在干冰上的果蝇保存管中冷冻，并于-80 ˚C保存，以备后续测定储存底物。请注意，这些样品具有放射性，必须相应地妥善保存。
3. 准备额外的闪烁瓶：一个含有未使用的GF/B滤纸作为背景对照，另准备一至两个含有0.1 - 0.5 µCi放射性标记底物的闪烁瓶，用于测定cpm/µCi。
4. 根据制造商的操作说明，使用闪烁计数器测定每个样品的cpm值。
5. 计算每cpm对应的pmol ¹⁴CO₂，以及每只果蝇每小时产生的pmol ¹⁴CO₂。从每个样品的cpm值中减去背景cpm值。根据纯放射性标记底物的数据，计算经背景校正后的样品cpm/µCi。
   1. 利用制造商提供的放射性标记底物的比活性和放射化学浓度（例如，分别为50 µCi/µmol和0.1 µCi/µl），计算pmol/cpm的换算因子。使用该因子将经背景校正的果蝇保存管数据从每样品cpm ¹⁴CO₂转换为每样品pmol ¹⁴CO₂，然后除以果蝇数量和果蝇保存管中的小时数。

结果

呼出和滞留的放射性标记CO的量₂ 由放射性底物代谢所产生的信号应与果蝇舱中的果蝇数量以及动物在CO环境中停留的时间成正比₂ 收集装置。为验证这一点，将饥饿处理18小时的果蝇饲喂放射性标记的棕榈酸（palmitic acid）0.02 µCi/µl 食物）2 小时，然后检测放射性标记的 CO₂₂ 以每组12或25只动物进行3或6小时孵育。CO的生成量₂ 由25只果蝇产生的量几乎是12只果蝇产生量的两倍，且当孵育时间从3小时延长至6小时时，每组的产量均翻倍（图2A）。pmol ¹⁴CO₂ / 果蝇 / hr 在各组中几乎相当。

禁食会通过β氧化促进脂肪酸的分解；因此，与进食状态的动物相比，禁食动物中脂肪酸氧化产生的CO₂应有所升高。为了验证这一情况，将禁食18小时的果蝇给予放射性标记的棕榈酸喂养2小时。在此短时间喂养后，果蝇被分为两组，分别转移至未标记的果蝇食物或1%琼脂中3小时，随后转移至果蝇培养舱中2小时。在两个独立实验中，琼脂组果蝇产生的放射性标记CO₂显著高于食物组果蝇（图2B），表明禁食动物中β氧化增强。

图1.收集呼出的放射性标记CO₂的装置。
摄入了放射性标记代谢底物的果蝇被放入“果蝇舱”（FP）中，即一个管口封有筛网（M）的截断离心管。将果蝇舱置于20 ml玻璃闪烁瓶中，并用带有偏心孔的橡胶塞（S）密封，在该孔中放置一个中心小室（CW），其中含有经100 µl 5% KOH饱和的GF/B滤纸。果蝇呼出的CO₂与KOH反应后以碳酸氢盐形式被捕获在滤纸上。被捕获的放射性标记CO₂可通过闪烁计数法对饱和滤纸进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. ¹⁴CO₂ 产率与果蝇饲养罐中果蝇的数量及时间相关，并对摄食与禁食条件产生响应。
（A） 量 ¹⁴CO₂ 在饲喂放射性标记棕榈酸盐的果蝇中，产生的物质与检测的果蝇数量（n = 12（空心柱）或 25（实心柱））以及果蝇在飞行舱中的停留时间（3 或 6 小时）相关。以每只果蝇计，果蝇产生的量分别为 0.99、1.13、1.10 和 1.01 pmol ¹⁴CO₂ / 小时（数据按与图表数据相同的从左到右顺序列出）。
（B） 在琼脂上被追逐的果蝇比在食物上被追逐的果蝇氧化了更多的放射性标记棕榈酸盐。数据来自两次实验，以均值±标准差表示，每组 n = 16–17 只果蝇（实验1）；每组 n = 10 只果蝇（实验2）。*p = 0.017，Student t检验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种用于测量成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中特定放射性标记底物氧化的方法。该技术操作简便、定量准确、可重复且灵敏度高，能够与现有的总CO₂生成和O₂消耗测量方法相互补充，因为它可用于鉴定用于ATP生成的正在被氧化的营养物质。

采用本文所述方法测量特定放射性标记底物氧化过程中释放的 CO₂，可作为测定总 CO₂ 生成量技术的补充。总 CO₂ 生成量（V_CO2）可用于估算代谢率，当总 O₂ 消耗量（V_O2）已知时，可进一步计算代谢率，并根据呼吸交换比（V_CO2 / V_O2 = RER）推断氧化所用的燃料来源。当碳水化合物为唯一底物时，RER = 1；而当脂肪酸为唯一来源时，RER = 0.7，这是由于葡萄糖与脂质氧化反应的化学计量关系所致。在缺乏可测量 Drosophila¹⁴ 耗氧量的设备时，无法确定其氧化燃料来源。然而，通过用微量的不同放射性底物标记果蝇，并测定放射性标记 CO₂ 的生成速率，可推断果蝇在刺激过程中的不同时间点氧化特定底物的能力，或评估特定突变对燃料氧化的影响。

本方案中有若干关键步骤。首先，使用放射性材料时应格外小心，避免洒漏并防止研究区域受到污染。其次，在步骤 2.1 和 3.4 中对果蝇进行麻醉时，实验人员应迅速操作，以避免长时间暴露于 CO₂ 对果蝇代谢和行为产生影响。一组 20 只果蝇可在 20 秒 或更短时间内完成麻醉并转移至新试管或果蝇培养盒中。当将果蝇从麻醉装置转移至含食物的试管时，应将试管侧放，防止麻醉后的果蝇粘附在食物表面。在步骤 2.2 中，若果蝇在数天内持续摄食放射性标记的食物，实验人员应确保食物不会干燥，因为果蝇对脱水非常敏感。

标记前的喂食或禁食状态、标记物的选择、标记时间的长短、果蝇在果蝇代谢舱中的停留时间以及麻醉方式，都是使用该技术时可进行排查和优化的参数。首先，若标记时间较短（2–3 小时），果蝇通常难以摄入足量的放射性标记食物，除非在标记前进行禁食处理。其次，标记物的选择会影响对代谢表型结论的解读。例如，由 D-[1-¹⁴C]-葡萄糖产生的放射性标记 CO₂ 可反映通过三羧酸循环或磷酸戊糖旁路的氧化过程，而由 D-[6-¹⁴C]-葡萄糖产生的放射性标记 CO₂ 仅反映三羧酸循环中的氧化过程^12,15,16。使用一种必需氨基酸的放射性示踪剂喂养果蝇^17,18，是评估源自蛋白质的氨基酸氧化情况的有效策略。最后，使用放射性标记葡萄糖进行长时间标记，也可能导致该前体物质掺入其他类型的分子中，例如甘油三酯¹⁹，或易于与丙酮酸相互转化的丙氨酸等氨基酸。可通过测定这些不同类别分子中掺入的放射性来评估这一过程⁶。实际上，可采用相同方式用放射性标记底物喂养不同的果蝇组，随后用于果蝇代谢舱实验，或测定在喂食与禁食条件下储存在糖原和甘油三酯中的放射性标记物含量⁶。另一种策略是采用较短的标记时间，以更准确地反映放射性标记膳食营养物质自身的氧化情况，而非其储存形式的氧化。第三，两组果蝇在特定时间段内的 ¹⁴CO₂ 生成速率可能总体相同，但初始阶段的速率可能差异显著。因此，在评估表型差异时，调整果蝇在果蝇代谢舱中的停留时间可能是关键的优化参数。最后，本实验方案建议在将果蝇放入果蝇代谢舱装置时，采用短暂的 CO₂ 麻醉。然而，CO₂ 麻醉可能会影响果蝇在代谢舱实验过程中的代谢功能。另一种替代方法是使用氮气麻醉，其对代谢速率无显著影响²⁰。

与任何测量燃料氧化和代谢率这类复杂系统的技术一样，本文所述方法也存在局限性。首先，不同组的果蝇可能摄取不同量的放射性标记食物，从而导致进入CO₂收集管的放射性底物量存在差异。₂ 实验的收集阶段中，由于底物起始量不同，可能导致结果差异。这一问题可在一定程度上通过增大样本量以及对果蝇进行群体饲喂来控制。在短时间标记期间，肠道呈现相似蓝色的果蝇表明已摄入放射性标记物，可继续用于实验的追踪阶段。此外，实验结束时，也可测量一组果蝇体内残留的放射性标记物含量，并在另一批果蝇中检测摄食结束及初始追踪期结束后的残留量。其次，不同组果蝇在果蝇培养舱内的活动水平可能存在差异。这一点需通过实验确定，并在数据分析时予以考虑。第三，该技术无法测量总的CO₂₂ 生成，仅指特定膳食营养素的生成或该营养素的储存形式。本方案并非替代，而是对VCO₂测量的补充₂ 因为它提供了不同且额外的信息。

此处所述方法用于测量呼出的放射性标记一氧化碳₂ 这是由特定代谢底物微量氧化所产生的产物。通过更换标记物——如葡萄糖、脂肪酸或氨基酸——可设计出日益复杂的实验，以评估不同生理条件（如饥饿状态）及不同遗传背景下，各类底物对代谢的贡献。该技术未来的应用包括在发育的幼虫期和蛹期两个阶段中测量代谢活动，这两个阶段的 果蝇 分别以营养物质的极端储存和分解为特征的生命周期阶段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
棕榈酸，[1-14C]-，50 µCi	PerkinElmer	NEC075H050UC
葡萄糖，D-[6-14C]-，50 µCi	PerkinElmer	NEC045X050UC
葡萄糖，D-[1-14C]-，50µCi	PerkinElmer	NEC043X050UC
果蝇培养管，窄口，聚苯乙烯材质	Genesee Scientific	32-116
圆底聚丙烯管，12 x 75 mm	Fisher Scientific	14-959AA
尼龙网筛，Nitex 材质，120 µm	Genesee Scientific	57-102
20 ml 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-15
带偏心孔的烧瓶塞	Fisher Scientific	K882310-0000
聚丙烯中心小室	Fisher Scientific	K882320-0000
Whatman GF/B 玻璃微纤维滤纸，圆形，直径 2.1 cm	Fisher Scientific	09-874-20
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273
6 ml 闪烁瓶，带按压/旋转盖	National Diagnostics	SVC-06