斑马鱼行为综合征的勇敢性、攻击性和群集行为检测

摘要

本文描述了斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面的实验设置、实施与分析方法，并检测是否存在行为综合征。采用标准化的行为量化方法将有助于不同研究之间的比较。本实验方案可根据需要进行修改，每种行为检测均可独立进行。

摘要

当特定行为在不同情境下相互关联时，即存在行为综合征。斑马鱼在近期研究中被用作实验对象，因此标准化实验方案对于确保分析和解释的准确性至关重要。在我们之前的研究中，通过监测一系列行为（在水面附近的时间、转移潜伏期、转移次数和快速冲刺行为），在1.5 L的梯形水箱中评估了斑马鱼的胆量。同样，在19 L的矩形水箱中，通过观察咬合行为、侧身展示、快速冲刺行为以及在倾斜镜面附近停留的时间来量化攻击性。通过将76 L的水箱均分为三部分，我们还考察了群集偏好。群集实验是一种高度可定制的实验方法，可根据具体假设进行调整。然而，该实验的方案也必须实现标准化，同时保留足够的灵活性以支持个性化修改。在以往的研究中，末端腔室或为空置，或包含5条或10条斑马鱼，或包含5条珍珠丹鱼（D. albolineatus）。在下文的手稿中，我们提供了一套详细的实验方案及代表性数据，以支持该方案的成功应用，从而实现行为综合征实验的可重复性。

引言

越来越多的研究文献开始探讨同一群体中个体动物不同行为之间的关联。这类关联被称为行为综合征，其测量指标通常包括大胆性、攻击性、探索行为和社会性^1-5。行为综合征具有直接和间接的重要价值。直接而言，对行为综合征的认识有助于更全面地理解进化理论、种群结构和种群动态³；间接而言，有关行为关联的知识可为药理学⁶、毒理学⁷、行为遗传学^8,9和内分泌学¹⁰等量化行为的学科提供参考。由于这些直接与间接的价值，深入了解行为综合征在常用模式生物（如斑马鱼）中尤为重要。斑马鱼的研究广泛分布于多个学科领域，其中包括行为综合征的分析^11-13。为了推动行为综合征研究的发展，并考虑到其他学科也常利用行为测量进行假设检验，必须提供可靠且简洁的行为描述，以确保分析与解释的有效性，同时标准化的实验方案将有助于同一物种内不同研究之间的比较。本实验方案旨在测量一组实验室饲养的斑马鱼群体中的大胆性—攻击性—群集性行为综合征¹⁴。然而，该方案的基础（如对个体鱼的行为追踪、确保适当的随机化以及合理的数据分析）可轻松调整，以适用于多种其他行为测量。此外，大胆性、攻击性或群集性检测也可单独进行，以检验特定假设。因此，尽管我们的目标是描述如何开展行为综合征研究以及成功实现个体水平行为测量的实验流程，但该程序的各个组成部分均可独立使用。

关于行为综合征的研究文献涵盖了多个分类群，从节肢动物到人类⁴。为了测量一种行为综合征，必须对至少两种行为情境进行量化。然而，目前在不同行为维度上用于量化行为的实验方法往往缺乏一致性。例如，在鱼类中，胆量（boldness）可通过T型迷宫实验、开放场实验或引入新异刺激或外来刺激来评估¹⁵。鱼类的攻击性研究可能涉及成对个体互动、视频刺激实验或黏土模型实验^12,16,17。同样，对群集行为（shoaling behavior）的分析通常包括对同伴偏好程度的测量，可在不同类型的水族箱中进行，并采用不同的方法来确定个体的接近或伴随时间^21-23。本实验方案介绍了一套特定的行为测试子集，具体而言，该方案提供了一种方法，可对个体在胆量、攻击性和群集行为测试中的表现进行追踪，从而便于在个体内部进行比较，以判断这些行为特征在种群内所有个体中是否具有一致性。我们在此前的研究中已将该方案应用于斑马鱼和慈鲷鱼（Amatitlania nigrofasciata）^14,18，该方法也适用于其他体型相似的淡水鱼类。

在1.5 L的梯形水箱中进行胆量实验，水箱内有一条水平线将水箱上下两部分划分为面积相等的区域。量化的行为包括测试鱼在水箱上下部分之间的穿越次数、在每个区域停留的时间、 dart（快速冲刺）次数以及首次进入上部区域的潜伏期。攻击性实验在19 L的矩形水箱中进行，水箱左下角放置一个3英寸×5英寸的镜子，倾斜角度约为22°¹⁹。量化的行为包括目标鱼与镜像互动的总时间²⁰，以及特定的攻击性指标——咬击次数、侧身展示次数、测试鱼与其镜像之间的dart次数。对于这些特定指标，咬击定义为张口快速冲向镜子的动作；侧身展示定义为朝向镜子方向展开侧鳍、胸鳍、臀鳍和背鳍；dart则指任何不朝向镜子的突发性不规则运动。最后，群集行为实验用于量化测试鱼在三室水箱中央腔室中的行为。水箱的两个侧腔室要么为空，要么包含一个"目标鱼群"，测量测试鱼在每个侧腔室附近停留的时间^21-23。针对每个个体测试鱼，根据特定刺激计算出一个综合评分，称为群集强度（Strength of Shoaling, SoS），可用于后续分析¹⁴。所有行为均由单个观察者或多个观察者使用名为JWatcher的免费行为量化软件进行评分²⁴。

检验行为综合征的存在主要是一项统计学工作，建议遵循Budeav 2010年提出的相关指南²⁵建议对经过中心化和标准化处理的数据进行主成分分析（PCA），其中输入数据为个体在包含多项行为测量指标的实验中所表现出的行为向量。即， 大胆性和攻击性）。对相关性矩阵进行主成分分析（PCA），可降低行为测量数据的维度，从而提取出能够解释大部分变异的最重要信息。随后可根据个体行为对应的高因子载荷来解释提取出的主成分，并基于这些解释性主成分计算每个个体的回归得分。这些回归得分可进一步与SoS测量值以及其他各类非行为学测量指标（如鱼体大小或性别）进行比较。

该工作流程已应用于斑马鱼行为综合征的研究中，并发现了一种存在于雄性个体中的特定性别行为综合征，即大胆性与群集行为之间的关联¹⁴。在此情况下，更大胆的雄性斑马鱼更倾向于与体型较大且更具攻击性的白线斑马鱼（D. albolineatus）聚集，但这种关联在雌性中并不存在。该工作流程还被用于对未成年 convict 慈鲷（Amatitlania nigrofasciata）亲缘关系的研究¹⁸，但未发现明显的行为综合征，这可能表明该物种具有行为可塑性。因此，本方案旨在明确三种特定行为检测（大胆性、攻击性和群集行为）在个体水平行为综合征研究框架中的性质。

方案

以下关于斑马鱼的饲养、护理和研究方法均已获得圣约瑟夫大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼的饲养与护理

1. 从本地供应商或野生种群中获取实验用斑马鱼。请注意，饲养斑马鱼需遵守IACUC指南，且饲养野生捕获种群需要额外的许可。
2. 根据性别识别并分离斑马鱼。或者，可根据研究假设跳过此步骤，或采用其他分离方法。
   注意：斑马鱼的性别特征较难判断，尤其是雌性个体。请参考这些指南¹⁰或有用的在线手册以区分性别。
3. 将种群进一步随机分为适当比例的实验鱼与刺激鱼。注意：实验鱼是指在一系列行为检测中被持续观察的测试个体，而刺激鱼则是占据攻击性和群集行为检测中刺激腔室的个体。
   注意：传统上，在群集行为检测中每条实验鱼对应1至5条刺激鱼，而在攻击性检测中采用1:1的刺激鱼与实验鱼比例^14,17。然而，研究人员需根据研究假设具体设计实验（例如，是否应保持刺激鱼不变以维持实验鱼行为的一致性，或是否应在每次检测之间轮换刺激鱼以确保充分随机化）。
4. 将所有鱼类饲养于斑马鱼养殖架中（27.5–28.5 °C），并维持严格的12小时光照/12小时黑暗循环。在非实验日，每天投喂实验鱼和刺激鱼薄片饲料，每周投喂一次卤虫。
5. 确保所有测试均在ZT1至ZT5（时间授时因子时间）之间进行，以避免昼夜节律的影响²⁶。

2. 随机分组与水箱设置

1. 随机化所有个体 先验的 到特定的行为实验序列。使用在线随机序列生成器建立一致的随机化方案²⁷ 或使用统计软件包（R）中的随机序列生成器。
   1. 将每次实验按1到3编号，并保持编号一致。为每个个体分配一个随机序列，并根据行为实验的编号映射该序列。例如，对于三项实验（1对应群集行为，2对应大胆性，3对应攻击性），某个个体的随机序列为“2,3,1”，则该个体需按此顺序依次完成相应的行为实验。
2. 在实验室中设置行为实验水箱（用于 Boldness、Aggression 和 Shoaling 实验）时，应选择能最大限度减少外界不良刺激的位置，并确保留有足够空间以便摄像机完整拍摄整个水箱。摄像机应具备足够清晰度，能够清楚识别水箱标签，并能分辨目标鱼的细微行为，将摄像机置于符合上述要求的位置。
3. 使用摄像机记录所有行为学实验时，应保持摄像机位置固定，并确保完整视野覆盖指定的实验缸，以尽量减少因录制条件差异导致的行为评分偏差。
   注意：避免将鱼缸放置在人员频繁走动的区域或门附近，因为移动和噪音会影响斑马鱼的行为。
4. 建立独特的 JWatcher 协议²⁴ 用于对每项行为实验进行评分。请参考 JWatcher 手册，学习如何创建焦点主文件以将行为分配给键盘按键，以及如何创建焦点分析文件以汇总收集的数据。
   注：JWatcher 是一种行为评分软件，可实现可靠且可重复的定制化行为评分²⁴.
5. 定义一种标记方案，用于记录所有行为实验的日期、鱼编号和实验编号例如， “F5-B-123115”表示第5号鱼，胆量实验，于12月31日进行^st，2015）并在水箱外侧贴上标签，确保标签在摄像头视野内且对焦清晰。将此信息记录在实验记录本中，以便快速查阅和后续质量控制。
6. 在所有检测之间以及个体从饲养架取出后，均使用一个驯化水箱进行适应。
   注意：驯化箱和终点箱为小型水族箱（40 cm × 20 cm × 25 cm），内含砾石和过滤器，其环境与饲养架高度相似。
7. 所有实验完成后，将个体转移至一个独立的终末饲养缸中，该饲养缸将作为所有已使用焦点个体的最终安置容器。选择足够大的饲养缸，以容纳这些个体在余下的生命周期中共同生活（例如， 25 加仑
   注意：所有水箱中的水温及环境条件必须保持一致且相似，包括饲养、适应及所有测试用的水箱。

3. 进行攻击行为检测

1. 在尺寸为 30 cm × 15 cm × 10 cm 的 19 L 长方形水族箱中进行攻击行为检测。用水族箱外部不透明隔板遮挡其三侧，仅留前面用于观察，以减少不必要的外界刺激。通过外部标记将水族箱划分为四个相等的矩形象限，并在左下象限内永久固定一面镜子（使用硅胶密封剂），使其与水族箱最左侧壁呈 22.5° 倾斜，形成一个直角三角形结构。
2. 确保驯化水族箱和攻击行为检测水族箱中的水温与饲养架水温相差不超过 2 °C。为此，需提前准备好已除氯并预热至 27.5–28.5 °C 的新鲜水，用于加入攻击行为检测水族箱。请注意，每次检测之间必须更换水体，以消除不必要的嗅觉线索。
3. 用手持小杯的方式将一条目标鱼从饲养架转移至单独的驯化水族箱中，使其适应环境 10 分钟。
   注意：必须尽量减少因操作不当而对鱼造成的刺激。个体转移方法应如前所述²⁷。
   1. 具体操作为：手动小心地将一个小型透明塑料杯放入目标鱼所在的水族箱中。在不惊扰鱼的前提下，缓慢将鱼连水一并舀入杯中，避免使用网具转移所造成的干扰。
4. 在将个体转移至攻击行为检测水族箱前，确认摄像机已准备就绪，并确保攻击行为检测水族箱（见步骤 3.1）处于清晰对焦状态，随后立即启动设备开始录像。通过手持小杯的方式将目标鱼从驯化水族箱转移至攻击行为检测水族箱。
   注意：必须在鱼进入攻击行为检测水族箱之前开始录像，以便准确记录其进入时间。
5. 对攻击行为检测水族箱连续录像 10 分钟 30 秒，随后用小杯将目标鱼从攻击行为检测水族箱转移回驯化水族箱。
6. 回放录像时，在鱼被放入水族箱后需等待 30 秒，作为额外的适应期，之后再开始行为评分。
7. 使用为攻击行为定义的 JWatcher 行为分析系统，对以下行为进行 10 分钟的定量分析：靠近镜子的时间、接近镜子的次数、快速冲刺次数、试图咬击次数（朝向镜子张口）、以及侧身展示次数（背鳍、胸鳍、臀鳍和尾鳍竖起）⁹。
8. 每项攻击行为检测至少独立评分两次，直至各次评分结果之间具有高度一致性。

4. 进行胆量测定实验

1. 在小型1.5 L梯形水箱中进行胆量行为测试，水箱尺寸为高15 cm × 上底26.5 cm × 下底22.5 cm × 宽6 cm。用水不透明纸包裹水箱四周，仅留前面用于观察。在水箱外侧贴一条细胶带，以区分水箱的上部与下部区域。
2. 确保胆量测试水箱中的水温与饲养架水温相差不超过2 °C（见步骤3.2）。
3. 将目标鱼从饲养架转移至适应水箱（见步骤3.3），静置适应10分钟。
4. 确保摄像机已准备就绪，可开始录制胆量行为测试；在准备转移目标鱼时，启动设备开始录制。将目标鱼从适应水箱转移至胆量测试水箱，并持续录制8分30秒。
5. 观看录像时，在鱼被放入水箱后，额外给予30秒的适应期，之后再开始行为评分。
6. 使用JWatcher软件对8分钟内的胆量相关行为进行量化分析。具体行为指标包括：靠近水面的时间、进入上部区域的潜伏期、进入上部区域的次数，以及异常运动（急冲）的次数²⁹。
7. 每项胆量行为测试至少独立评分两次，直至各次评分结果间达到高度一致性。

5. 进行群集行为实验

1. 在容积为76 L的实验水箱中进行群集行为实验，该水箱由两块用硅胶密封的玻璃隔板分隔成三个区域（形成两个刺激区和一个焦点鱼所在区）。在水箱外部标记两个偏好区域，分别距离每个刺激区的玻璃隔板6.35 cm，相当于两条鱼体长³⁰。在群集实验水箱的外侧三面安装不透明隔板，仅保留正面用于观察。
   注意：可根据不同体型物种的研究假设，自定义该偏好区域的范围。
2. 根据研究目的，选择用于刺激的鱼群，并在测试前至少适应环境12小时，且在整个实验过程中持续保留在群集实验水箱中。
   注意：刺激鱼群是指用于评估焦点鱼在有无这些鱼群存在时行为反应的一组个体鱼。可通过选择不同的刺激鱼群组合，检验多种多样的群集行为假设。每次实验后应轮换刺激鱼群在两个刺激区之间的位置，以避免侧向偏好偏差，同时确保刺激鱼群在测试前至少有12小时的适应期。
3. 将焦点鱼转移至适应性水箱中，操作方法如前所述（见步骤3.3）。
4. 用手杯法将焦点鱼从中间的适应性水箱转移至群集实验水箱的中央区域。
5. 在开始10分钟的实时行为记录观察期之前，先给予10分钟的适应时间。也可选择录制群集实验视频，后续使用JWatcher软件进行行为分析。当焦点鱼位于目标鱼群所在腔室的偏好区域内时，判定其处于群集状态。
6. 量化焦点鱼在每个偏好区域中停留的时间，以及在中央区域停留的时间。
7. 作为额外的描述性指标，可计算“群集强度”（SoS）。赋予一个介于-1到+1之间的数值，其绝对值表示个体鱼进行群集行为的频繁程度。
8. 计算群集时间与群集区域面积的比值，减去非群集时间与非群集区域面积的比值，再将所得结果除以各区域停留时间与其各自体积比值之和。有关该计算方法的更多细节可参见先前的研究¹⁴。

6. 数据质量控制

1. 使用传统的数据分析工具分析数据^31-32。
2. 对所有行为数据使用非参数Levene检验进行方差齐性检验。若某行为数据方差不齐，则进行对数转换³³。
3. 在方差齐性的数据上，使用Kruskal-Wallis方差分析检验是否存在序列效应（即随机化顺序未影响个体行为）³⁴。
4. 通过以侧边为固定因子，对SoS指数构建单变量一般线性模型，验证群集实验中是否存在侧边偏好偏差³⁵。
   注意：若数据基本无问题，可进行后续分析；若存在问题，应通过额外的数据转换、生物学上合理的解释进行调和，和/或增加样本量。

7. 分析数据

1. 分别在胆量和攻击性测试中，对所有行为计算双尾Spearman等级相关系数³⁶。
2. 对于同一受试个体多次进行的行为测试，采用双因素混合模型并基于一致性计算组内相关系数（ICC）³⁶。在此情况下，ICC用于衡量某条鱼在多次重复测试中行为表现的一致性程度。
3. 对胆量和攻击性行为数据进行预处理，通过中心化和标准化所有行为变量，为后续主成分分析（PCA）²⁵的输入做准备。
   注意：通过中心化和标准化对测量值进行预处理是至关重要的步骤。若不进行此步骤，发生频率较高或变异性较大的行为将过度影响所提取主成分的解释结果。中心化和标准化过程可消除此类偏差。
4. 利用相关矩阵进行主成分分析（PCA），以判断胆量与攻击性是否共同构成一种行为综合征。将各主成分中载荷值大于>0.6的行为视为具有显著意义并予以解释。有关行为学研究中PCA结果报告的全面指南，请参见Budaev 2010²⁴。碎石图有助于判断应保留哪些特征向量用于解释。
5. 使用R或SPSS等统计软件包^31,32，提取每个个体在各主成分上的得分。该得分表示特定个体的行为在多大程度上可由该主成分解释。
6. 计算因子回归得分与群集行为强度之间的Spearman等级相关系数³⁶。
   注意：若胆量和攻击性行为共同载荷于同一主成分，或任何具有显著可解释载荷的主成分与群集行为强度存在相关性，则认为存在行为综合征。此外需注意，群集行为强度未被纳入PCA分析，以便更清晰地解释更为复杂的行为量化指标（即胆量和攻击性）。PCA将正交压缩胆量和攻击性特征为若干特征向量，以最大化解释变异量，因此特别适用于此类复杂测量。通过解释所得特征向量，并将群集行为强度测量值对每个特征向量进行回归，可更直观地理解这些复杂行为（胆量和攻击性）如何与一个定义更明确的二元群集行为指标（i.e., 鱼是否参与群集）相关联。

结果

根据研究的性质和所采用的具体方案，行为综合征实验可能产生多种不同的结果。下表和下图（如标注所示）改编自我们此前发表在《行为过程》期刊¹⁴和《斑马鱼》期刊¹⁷的研究。当上述方案被完整实施时，预期将得到两组结果，即“单次实验内的相关性”和“不同实验间的相关性”（图1）。

第一组结果描述了单个实验内部的一致性。具体而言，这些结果分别描述了在胆量实验和攻击性实验中，各种行为在各自实验内部的相关性。表1和表2展示了胆量实验和攻击性实验中这些相关性应有的表现形式，所呈现的数据改编自先前的一项研究¹⁴。在胆量实验中，预期在水箱上层区域的穿梭次数与停留时间呈正相关，而进入上层区域的潜伏期则呈负相关。在胆量水箱中对个体行为胆量维度进行测量的代表性结果见表1（参见步骤4.1...

讨论

本方案旨在确定斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面是否存在一致的行为关联。如果在特定种群中，上述任何行为之间存在稳定的相关性，则表明存在行为综合征。通过研究种群的自然行为综合征，研究人员可以更全面地理解其行为动态、种群结构以及可能的进化历史³。此外，通过操控影响这些行为综合征的环境因素——例如在药理学⁶、毒理学⁷、行为遗传学^8,9和内分泌学¹⁰研究中——有助于揭示不同因素如何影响行为之间的关联。本方案中所描述的攻击性-胆量-群集行为综合征的具体构成，涵盖了模式生物斑马鱼中已被广泛研究的常见行为^11-13。尽管该方法可应用于任何鱼类物种，但斑马鱼的广泛应用可能有助于本方案在跨学科领域的标准化。上述每种行为检测方法相比其他类似技术更易于控制和操作。例如，攻击性检测采用倾斜镜面诱发更广泛的行为反应，而非使用活体或黏土模型、视频刺激或垂直镜像刺激¹⁷。胆量检测中的行为指标相比T型迷宫或大型开放场测试更易于量化¹⁵。最后，本方案所描述的群集行为检测能够轻松追踪个体行为，这对于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斑马鱼 Rack 系统	Aquaneering 公司	货号 ZS550
Pet Valu 热带鱼粮，224.0 克	宠物价值	货号 # 31700
优质卤虫卵，16盎司	卤虫直接法
1.5 L 梯形培养箱	Pentair 水生生态系统	货号 itsts-a
19 L 矩形水箱	那条鱼的地方	211932
76 L矩形水箱	那条鱼的地方	212180
日立 KP-D20A CCD 相机	Prescott公司
尼康 AF Nikkor 35-105 mm f/3.5~4.5s MACRO 镜头	尼康公司
ArtMinds 方形镜子，经济装，3 件装" × 3"	Michaels	货号 # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics Base	IBM
R	R 基金会