本文描述了斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面的实验设置、实施与分析方法，并检测是否存在行为综合征。采用标准化的行为量化方法将有助于不同研究之间的比较。本实验方案可根据需要进行修改，每种行为检测均可独立进行。
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本文内容
摘要
摘要
当特定行为在不同情境下相互关联时，即存在行为综合征。斑马鱼在近期研究中被用作实验对象，因此标准化实验方案对于确保分析和解释的准确性至关重要。在我们之前的研究中，通过监测一系列行为（在水面附近的时间、转移潜伏期、转移次数和快速冲刺行为），在1.5 L的梯形水箱中评估了斑马鱼的胆量。同样，在19 L的矩形水箱中，通过观察咬合行为、侧身展示、快速冲刺行为以及在倾斜镜面附近停留的时间来量化攻击性。通过将76 L的水箱均分为三部分，我们还考察了群集偏好。群集实验是一种高度可定制的实验方法，可根据具体假设进行调整。然而，该实验的方案也必须实现标准化，同时保留足够的灵活性以支持个性化修改。在以往的研究中，末端腔室或为空置，或包含5条或10条斑马鱼，或包含5条珍珠丹鱼（D. albolineatus）。在下文的手稿中，我们提供了一套详细的实验方案及代表性数据，以支持该方案的成功应用，从而实现行为综合征实验的可重复性。
引言
越来越多的研究文献开始探讨同一群体中个体动物不同行为之间的关联。这类关联被称为行为综合征，其测量指标通常包括大胆性、攻击性、探索行为和社会性1-5。行为综合征具有直接和间接的重要价值。直接而言，对行为综合征的认识有助于更全面地理解进化理论、种群结构和种群动态3；间接而言，有关行为关联的知识可为药理学6、毒理学7、行为遗传学8,9和内分泌学10等量化行为的学科提供参考。由于这些直接与间接的价值，深入了解行为综合征在常用模式生物（如斑马鱼）中尤为重要。斑马鱼的研究广泛分布于多个学科领域，其中包括行为综合征的分析11-13。为了推动行为综合征研究的发展，并考虑到其他学科也常利用行为测量进行假设检验，必须提供可靠且简洁的行为描述，以确保分析与解释的有效性，同时标准化的实验方案将有助于同一物种内不同研究之间的比较。本实验方案旨在测量一组实验室饲养的斑马鱼群体中的大胆性—攻击性—群集性行为综合征14。然而，该方案的基础（如对个体鱼的行为追踪、确保适当的随机化以及合理的数据分析）可轻松调整，以适用于多种其他行为测量。此外，大胆性、攻击性或群集性检测也可单独进行，以检验特定假设。因此，尽管我们的目标是描述如何开展行为综合征研究以及成功实现个体水平行为测量的实验流程，但该程序的各个组成部分均可独立使用。
关于行为综合征的....
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方案
以下关于斑马鱼的饲养、护理和研究方法均已获得圣约瑟夫大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 斑马鱼的饲养与护理
- 从本地供应商或野生种群中获取实验用斑马鱼。请注意，饲养斑马鱼需遵守IACUC指南，且饲养野生捕获种群需要额外的许可。
- 根据性别识别并分离斑马鱼。或者，可根据研究假设跳过此步骤，或采用其他分离方法。
注意：斑马鱼的性别特征较难判断，尤其是雌性个体。请参考这些指南10或有用的在线手册以区分性别。 - 将种群进一步随机分为适当比例的实验鱼与刺激鱼。注意：实验鱼是指在一系列行为检测中被持续观察的测试个体，而刺激鱼则是占据攻击性和群集行为检测中刺激腔室的个体。
注意：传统上，在群集行为检测中每条实验鱼对应1至5条刺激鱼，而在攻击性检测中采用1:1的刺激鱼与实验鱼比例14,17。然而，研究人员需根据研究假设具体设计实验（例如，是否应保持刺激鱼不变以维持实验鱼行为的一致性，或是否应在每次检测之间轮换刺激鱼以确保充分随机化）。 - 将所有鱼类饲养于斑马鱼养殖架中（27.5–28.5 °C），并维持严格的12小时光照/12小时黑暗循环。在非实验日，每天投喂实验鱼和刺激鱼薄片饲料，每周投喂一次卤虫。
- 确保所有测试均在ZT1至ZT5（时间授时因子时间）之间进行，以避免昼夜节律的影响....
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结果
根据研究的性质和所采用的具体方案，行为综合征实验可能产生多种不同的结果。下表和下图（如标注所示）改编自我们先前发表在《行为过程》期刊14和《斑马鱼》期刊17的研究。当完整实施上述方案时，预期将得到两组结果：“单次实验内的相关性”和“不同实验间的相关性”（图1）。
第一组结果描述了单次实验内的重复性。具体而言，这些结果分别描述了在胆量实验和攻击性实验中，各项行为指标在单个实验内部的相互关联性。表1和表2展示了胆量实验和攻击性实验中预期的相关性模式，所呈现的数据改编自先前的一项研究14。在胆量实验中，预期在水箱上半区域的穿梭次数与停留时间呈正相关，而进入上半区域的潜伏期则呈负相关。针对在胆量实验水箱（见步骤4.1）中测量的行为胆量维度个体，其代表性结果见表1.......
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讨论
本方案旨在确定斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面是否存在一致的行为关联。如果在特定种群中，上述任何行为之间存在稳定的相关性，则表明存在行为综合征。通过研究种群的自然行为综合征，研究人员可以更全面地理解其行为动态、种群结构以及可能的进化历史3。此外，通过操控影响这些行为综合征的环境因素——例如在药理学6、毒理学7、行为遗传学8,9和内分泌学10研究中——有助于揭示不同因素如何影响行为之间的关联。本方案中所描述的攻击性-胆量-群集行为综合征的具体构成，涵盖了模式生物斑马鱼中已被广泛研究的常见行为11-13。尽管该方法可应用于任何鱼类物种，但斑马鱼的广泛应用可能有助于本方案在跨学科领域的标准化。上述每种行为检测方法相比其他类似技术更易于控制和操作。例如，攻击性检测采用倾斜镜面诱发更广泛的行为反应，而非使用活体或黏土模型、视频刺激或垂直镜像刺激17。胆量检测中的行为指标相比T型迷宫或大型开放场测试更易于量化15。最后，本方案所描述的群集行为检测能够轻松追踪个体行为，这对于.......
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披露
作者（GW 和 SPM）不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。
致谢
本工作得到了霍华德·休斯医学研究所教育资助以及圣约瑟夫大学西格玛赛分会内部资助的支持。我们还要感谢三位匿名审稿人，他们帮助加强了本方案的严谨性和解释的准确性。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斑马鱼 Rack 系统 | Aquaneering 公司 | 货号 ZS550 | |
| Pet Valu 热带鱼粮，224.0 克 | 宠物价值 | 货号 # 31700 | |
| 优质卤虫卵，16盎司 | 卤虫直接法 | ||
| 1.5 L 梯形培养箱 | Pentair 水生生态系统 | 货号 itsts-a | |
| 19 L 矩形水箱 | 那条鱼的地方 | 211932 | |
| 76 L矩形水箱 | 那条鱼的地方 | 212180 | |
| 日立 KP-D20A CCD 相机 | Prescott公司 | ||
| 尼康 AF Nikkor 35-105 mm f/3.5~4.5s MACRO 镜头 | 尼康公司 | ||
| ArtMinds 方形镜子，经济装，3 件装" × 3" | Michaels | 货号 # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | R 基金会 |
参考文献
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J.
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重印与许可
