利用凝胶辅助再水合法制备巨型聚合物体

摘要

我们介绍一种快速制备巨型聚合物囊泡（pGVs）的实验方案。简言之，将聚合物溶液滴加在附着于盖玻片的干燥琼脂糖膜上进行脱水处理，随后对聚合物薄膜重新水化，即可迅速形成pGVs。该方法显著改进了合成型巨型囊泡的制备过程，可直接应用于仿生学研究。

摘要

聚合物囊泡（polymersomes）因其稳定性、坚固性、屏障特性、化学多样性和可调控的物理特性，正被广泛研究作为脂质囊泡的合成类似物。然而，制备巨型（> 4 µm）囊泡的常规方法通常耗时且劳动密集，所得完整聚合物囊泡数量较少。在此，我们首次提出利用凝胶辅助再水化法，快速高效地制备巨型（>4 µm）聚合物囊泡（polymersomes）。使用该方法，可从多种再水化溶液中形成聚合物囊泡，包括多种生理相容性缓冲液和完全细胞培养基，使其可直接适用于仿生学研究。该技术还能可靠地从不同聚合物组成中生成聚合物囊泡，产率显著高于传统方法，操作难度也大大降低。通过调节再水化过程中的温度或向聚合物膜中添加膜流动剂，可方便地调控聚合物囊泡的尺寸，从而获得巨型聚合物囊泡（>100 µm）。

引言

合成细胞大小的巨型单层囊泡（GUVs）的构建正受到越来越多的关注 体外 重建不同的细胞过程以构建人工类细胞系统的框架^1,2尽管由脂质膜构成的巨大囊泡（GUVs）能够很好地模拟天然生物膜，但其对环境波动敏感且稳定性较差，保质期较短。由于这些局限性，两亲性嵌段共聚物被用作脂质模拟物以形成聚合物囊泡（polymersomes）。在此背景下，聚合物囊泡因其更高的稳定性，在仿生细胞系统的构建中具有显著优势³，化学多功能性^4,5 可改变的物理特征^6-8.

目前制备巨型聚合物囊泡的方法包括电形成法⁹和模板辅助再水化法¹⁰，这两种方法均耗时较长、劳动强度大、需要专用设备，且产生的完整巨型聚合物囊泡产率较低。最近开发了一种简单的凝胶辅助再水化方法用于制备脂质大单层囊泡（GUVs）¹¹。本文中，我们描述了对凝胶辅助再水化技术的改进，可用于制备具有不同聚合物组成、可控尺寸以及在不同缓冲液条件下形成的巨型聚合物囊泡。

简而言之，将1% w/v标准DNA凝胶电泳琼脂糖薄膜脱水至玻璃盖玻片上。随后将用氯仿配制的聚合物溶液铺展在脱水的琼脂糖薄膜表面，并使其自然挥发。溶剂完全去除后，将聚合物薄膜置于所选缓冲液中，在适度加热（40–70 °C）条件下重新水化，30分钟内即可形成巨大（>4 µm）尺寸的多聚体囊泡（polymersomes）。该方法利用常规实验室设备和试剂，以极低的成本快速制备出数百个结构完整、形态良好的多聚体囊泡。

图1. 凝胶辅助再水化方法的示意图。 由二嵌段共聚物组成的巨型聚合物囊泡在再水化约30分钟后形成。亲水嵌段以品红色表示，疏水嵌段以绿色表示。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 聚合物和琼脂糖的制备

注意：在整个实验过程中，必须始终佩戴手套和实验服。在使用任何有机溶剂或任何可能产生飞溅的步骤中，同样需要佩戴安全护目镜。

1. 在玻璃小瓶中，将5 mg固体聚环氧乙烷-b-聚丁二烯（PEO-PBD，EO₂₂-BD₃₇）两嵌段共聚物溶于1 ml氯仿中，配制成5 mg/ml的聚合物溶液，轻轻旋转使其完全溶解。所有操作均需在通风橱中使用氯仿进行。
2. 将荧光标记脂质（已预先溶于氯仿中购买）以0.5 mol%的终浓度加入至99.5 mol%未标记聚合物中，混合均匀。
   1. 例如，取约12 µl浓度为1 mg/ml的荧光标记脂质氯仿溶液，加入997.58 µl溶于氯仿中的PEO-PBD，EO₂₂-BD₃₇聚合物溶液中（分子量为2,950道尔顿），最终获得含0.5 mol%标记脂质和99.5 mol%聚合物的混合溶液。
   2. 将溶液储存于带有耐氯仿盖子的密封小瓶中，置于-20 °C保存。在小瓶口螺纹处缠绕生料带，并拧紧瓶盖；再于瓶盖外部缠绕一层生料带，最后在外层包裹Parafilm膜，以最大限度减少溶剂挥发。
3. 在250 ml锥形瓶中，将0.5 mg标准琼脂糖溶于50 ml水（或50 ml 100 mM蔗糖溶液）中，配制成1% w/v琼脂糖溶液。将溶液放入普通微波炉中加热约1分钟（或加热至溶液澄清，表明琼脂糖完全溶解）。
   注意：琼脂糖溶液可在冷却数分钟后直接使用，也可冷却凝固后储存，并在需要时按相同方法重新加热熔化后使用。

2. 琼脂糖薄膜制备

1. 剪去1,000 µl枪头的末端，以防止堵塞。使用剪过的枪头，直接从生产商提供的容器中吸取300 µl熔化的琼脂糖溶液，滴加到25 mm的方形玻璃盖玻片上。
2. 在涂布前，让琼脂糖冷却至约65–75 °C。若琼脂糖温度过低，在涂布过程中会开始在表面结块；反之，若温度过高，则需要更长时间的涂布才能使琼脂糖牢固附着于盖玻片表面。
3. 用戴手套的手指仅捏住盖玻片边缘，使用另一支1,000 µl枪头的长边，将琼脂糖均匀地涂布在盖玻片表面。来回移动枪头，直至琼脂糖完全附着并覆盖整个盖玻片。
4. 将涂有琼脂糖的盖玻片放置在一片Parafilm上，琼脂糖面朝上。当完成所需数量的盖玻片涂布后，将带有盖玻片的Parafilm放入37 °C培养箱中，使琼脂糖在表面脱水至少1小时。
   注意：脱水完成的标志是可见的琼脂糖层消失，盖玻片表面应呈现平坦且透明的状态。一旦薄膜完全脱水，应将盖玻片琼脂糖面朝上存放于一次性塑料培养皿中。

3. 聚合物薄膜的形成

1. 用移液器将 30 µl 配制好的聚合物溶液滴加到琼脂糖薄膜上。
2. 用戴手套的手指夹住盖玻片边缘，使用 18 G 针头的长边，以环形涂布动作将溶液在琼脂糖薄膜上展开。持续涂布直至溶液完全挥发。
   注意：注意针头尖端锋利，避免划伤。
3. 将聚合物薄膜放入塑料培养皿中，聚合物面朝上，并将培养皿置于用铝箔包裹的标准家用真空干燥器中（以防止标记脂质发生光漂白），至少放置 1 小时，以彻底去除任何残留溶剂。

4. 聚合物囊泡的形成

1. 将一个盖玻片井（可使用自制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）井（一种厚度约0.5 cm的固化PDMS块，中间 punched 出直径约1 cm的孔），或市售的井）粘附到涂有聚合物薄膜的盖玻片上。轻轻按压盖玻片井，使其与涂有聚合物的一面朝上，并与盖玻片之间形成紧密密封。注意不要用力过猛，以免压碎盖玻片。
2. 向腔室内加入200–500 µl复水溶液（水即可，但也可使用多种缓冲液或培养基），复水体积取决于所粘附盖玻片井的大小。
3. 构建一个保湿 chamber 以减少复水溶液的蒸发。将一条卷起的湿润Kimwipe纸置于玻璃培养皿边缘。将带有粘附盖玻片井的聚合物薄膜放入该保湿 chamber 中，并盖上盖子。再用铝箔包裹培养皿以减少光漂白。将培养皿置于设定为40 °C的加热板上，至少放置30分钟。
4. 在复水过程中，通过调节加热板温度（24–70 °C）来调控所形成囊泡的大小（图5）。70 °C接近琼脂糖的T_m，因此超过此温度时应谨慎操作。

5. 通过光漂白后荧光恢复（FRAP）表征聚合物囊泡

1. 将带有粘附盖玻片的盖玻片直接转移至倒置显微镜下进行成像。
2. 根据聚合物溶液中所含的荧光脂质选择合适的滤光片组。对于掺入聚合物溶液中的罗丹明标记脂质，使用560/25 nm激发滤光片和607/36 nm发射滤光片，或性能相当的滤光片组。
3. 使用100X油镜聚焦于盖玻片的上表面，即聚合物囊泡将粘附的位置。如果聚合物囊泡特别大（>20 µm）或聚合物膜过厚，应使用较低倍数的物镜（例如，40X），以更清晰地观察聚合物囊泡。
4. 通过荧光显微镜识别聚合物囊泡。通过具有特征性空心球形结构且直径>5 µm的囊泡来确认聚合物囊泡。
5. 在配备可调聚光镜的荧光显微镜上，采用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术表征膜流动性。由于聚合物囊泡在基底上具有粘附性和紧密排列的特性，其自然运动受限，从而提高了FRAP成像质量。
   1. 将显微镜聚焦于目标聚合物囊泡。将聚光镜缩小至小区域，并确保囊泡边缘位于成像兴趣区域内。
   2. 增加相机曝光时间，并移除所有中性密度滤光片，以有效对目标区域进行光漂白。持续光漂白30–60秒，或直至荧光强度显著降低。
   3. 关闭光源并完全打开聚光镜。将曝光时间恢复至初始设置，并立即开始每30秒采集一次图像，持续3分钟。
   4. 采用标准方法计算膜扩散系数¹²。若漂白区域在3–5分钟内恢复荧光强度，则表明膜具有流动性。

6. 聚合物囊泡尺寸的表征

图6. 使用图像分析软件对多聚体进行尺寸分析的流程。 逐步说明如何测量所形成囊泡的直径。用户必须知晓所用显微镜的校准单位（像素/µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 在图像分析软件中打开所获得的多聚体囊泡图像¹³。
2. 通过点击“分析”下拉菜单并选择“设置比例尺”来设定图像的比例尺。
   1. 使用标准方法（例如，显微测微尺）对显微镜进行比例尺校准。
   2. 填写校准单位并点击“确定”。
3. 点击线条工具，并绘制一条跨越囊泡直径的直线。
4. 通过点击“分析”下拉菜单并选择“测量”，获取长度数据。
5. 按照上述步骤继续测量各个单独的囊泡，每次新的测量结果将自动添加到测量数据窗口中。
6. 每次绘制直线并完成长度测量后，按“Ctrl + D”，将所画线条标记在图像上，以便更清晰地追踪已分析的囊泡。

结果

聚合物囊泡采用上述方法（图1）制备，并使用 图2 所示的常规实验设备。将聚合物囊泡用去离子水重水化（图3），并在倒置显微镜下使用100倍油镜通过落射荧光模式进行成像。需注意，若无法观察到聚合物囊泡，可能是其尺寸过大，超出了100倍油镜的成像范围；此时应改用较低倍数的物镜。凝胶辅助重水化方法的一个优势在于，可在多种不同的重水化溶液中形成聚合物囊泡。如 图4 所示，聚合物囊泡已在去离子水、完整的哺乳动物细胞培养基、蔗糖溶液以及两种生理相关的缓冲溶液（磷酸盐缓冲液（PBS）或Tris缓冲盐水（TBS））中成功形成。在标准条件下（40 °C下以去离子水重水化1小时），通常在40 × 40 µm² 的视野中可观察到超过约70个聚合物囊泡。尽管聚合物囊泡在表面的生成并不完全均一，但存在数十个具有代表性的高产视野。此外，聚合物囊泡在溶液中至少可稳定存在24小时。

通过在不同温度下重新水化聚合物薄膜，可轻松调节聚合物囊泡的尺寸。在室温下于去离子水中形成的聚合物囊泡，其平均直径为2.9 ± 0.7 µm。随着再水化过程中温度的升高，聚合物囊泡的平均尺寸也随之增大（表1）。在较高温度（> 60 °C）下，形成的聚合物囊泡尺寸甚至可超过100 µm（图5）。

所有图像处理均使用开源成像软件完成（图6）。采集的图像在软件程序中打开，将校准后的像素尺寸输入到设定比例尺的对话框中。使用直线工具，沿颗粒直径画线。每画完一条线后，测量其校准后的长度，并将数据添加至结果框中。随后可将数据导入任意选定的数学软件进行绘图分析。例如Excel、Prism、Origin 等等。)

图2. 形成聚合物囊泡所需的常见且廉价的实验材料照片。 所需物品包括：封口膜、18.5 G针头、溶于氯仿或其他合适溶剂中的聚合物、1,000 µl移液器吸头、锥形瓶、镊子、琼脂糖、25 mm方形盖玻片、PDMS成像孔板和玻璃培养皿。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 凝胶辅助再水化方法的示意图。 将溶解的琼脂糖均匀涂布于25 mm见方的盖玻片上，形成覆盖整个盖玻片的均匀薄膜。随后将盖玻片置于37 °C培养箱中，使薄膜脱水。将聚合物溶液滴加至脱水后的琼脂糖薄膜上，并用针头以环形运动方式涂布。然后将盖玻片放入干燥器中过夜，以彻底蒸发残留溶剂。最后，将成像腔室粘附至基底上，用选定溶液对聚合物进行再水化，并将样品置于40 °C的培养皿中至少25分钟，以促进聚合物囊泡（polymersomes）的形成。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 多种不同缓冲液中均可形成聚合物囊泡。 将PEO-PBD聚合物膜在指定缓冲液中于40 °C下再水合1小时。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 再水化过程中升高温度会增加聚合物囊泡的尺寸。 在指定再水化温度下于水中形成的聚合物囊泡的代表性倒置荧光图像。温度升高导致聚合物囊泡尺寸增大。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

温度 (°C)	平均尺寸 (µm)
24	2.93 ± 0.7
40	5.76 ± 2.5
50	6.65 ± 2.4
60	11.46 ± 5.8
70	14.04 ± 7.0

表1. 复水过程中温度升高导致聚合物囊泡尺寸增大。 针对不同温度条件下水中超过100个聚合物囊泡的平均直径进行了计算，并在此展示。误差线表示标准差。

讨论

聚合物囊泡正被广泛探索作为生物膜的模拟物。聚合物具有坚固且多功能的特性，使其在需要膜功能化、长效性和可调控响应性的研究中备受青睐。传统制备巨型聚合物囊泡^9,10（>4 µm）的方法费时费力，且需要昂贵且专用的设备。在此，我们首次提出一种快速、多功能且可靠的制备巨型聚合物囊泡的方法，仅需使用常规且廉价的实验室试剂和设备即可完成。

利用凝胶辅助再水化方法，可在多种再水化溶液（包括细胞培养基）中快速（<30 分钟）形成单层聚合物囊泡，并适用于多种不同的聚合物（数据未显示）。该技术未观察到多层或不对称囊泡的形成。本研究中，我们使用了聚环氧乙烷-b-聚丁二烯（PEO-PBD, EO₂₂-BD₃₇）中性双嵌段共聚物。许多不同组成的聚合物（包括带电双嵌段共聚物）均能通过该方法有效形成囊泡（未展示）。然而，一些市售的三嵌段共聚物以及较高分子量的双嵌段共聚物（~ >5,000 道尔顿）则无法形成清晰的聚合物囊泡。在本论文的所有实验中，仅为了可视化目的，在聚合物溶液中掺入了低浓度的标记脂质。其他可视化方法，包括直接功能化荧光染料的聚合物，也可使用。聚合物囊泡同样可通过明场显微镜成像，但荧光显微镜可提供更高的分辨率。

对方案进行的大多数小幅修改通常不会改变实验结果。例如，滴加到盖玻片上的聚合物溶液浓度存在微小差异，并不会影响所形成的聚合物薄膜。尽管尚未确定完整的浓度范围，但聚合物囊泡的形成可在较宽的聚合物薄膜浓度范围内成功实现。例如，1-10 mg/ml）。然而，某些实验方案的改动会对聚合物囊泡的形成产生不利影响。其中最显著的是使用圆形玻璃盖玻片（而非方形）会导致聚合物囊泡形成效果极差。我们认为这是由于琼脂糖在玻璃表面形成了极为均匀的涂层，反而阻碍了聚合物囊泡的形成。

该技术最具挑战性的问题之一是以高回收率从表面回收聚合物囊泡。在某些情况下，将聚合物囊泡从原始表面移除可能具有优势。由于脱水聚合物膜会产生较高的背景荧光，将单个聚合物囊泡移除并黏附到洁净的盖玻片上，可提高成像质量和表征效果（尤其是在进行FRAP分析时）。为此，可使用末端被截断的移液枪头进行轻柔吹打，使聚合物囊泡从表面解吸（尽管回收的囊泡数量显著低于最初形成的数量）。随后可将聚合物囊泡置于经过修饰的盖玻片表面，使其与新的盖玻片发生相互作用。通常情况下，对于中性的PEO-PBD聚合物囊泡，经臭氧处理15分钟的盖玻片可促使聚合物囊泡沉降到表面以供成像。不同组成的聚合物囊泡需要采用不同的表面修饰方法（例如，带负电或正电的聚合物）。

本实验方案中使用的大多数材料均可成功储存并使用数天至数周。凝固的琼脂糖可重新煮沸并重复使用，直至琼脂糖在煮沸后仍出现聚集现象，或凝固的琼脂糖开始变干。带有干燥琼脂糖薄膜的盖玻片可无限期储存和使用（例如，数月）。溶于氯仿中的聚合物可在 -20 °C 下保存数月。然而，一旦聚合物薄膜在琼脂糖薄膜上干燥，这些薄膜必须在常压真空条件下储存，并在两周内使用（更长期的储存效果尚未直接确定，但使用超过两周的聚合物薄膜所形成的聚合物体在性能上已出现明显差异）。

采用本文介绍的凝胶辅助水合方法，仅需使用常规设备和廉价的实验室试剂，在数小时内即可快速制备出数百个形态均一的聚合物囊泡。此外，聚合物囊泡可在多种生理缓冲溶液中形成，并可由不同的聚合物组成制备（未展示）。对本方法进行的微小调整不会对聚合物囊泡的形成产生负面影响，使得凝胶辅助水合成为一种适用于不同技术水平科研人员的通用且易于实施的技术。

轻松构建尺寸与细胞相当的巨型聚合物囊泡，对于开发类细胞的人工系统至关重要。利用凝胶辅助再水化技术制备这些聚合物囊泡，操作简便且用途广泛，为生物模拟领域带来了重大进展，有助于构建结构稳定的细胞膜模拟物。例如，借助该技术，可设计多种策略，如包封不同的细胞内组分、在聚合物上功能化修饰细胞膜蛋白，以及整合膜转运蛋白等，从而构建基于聚合物囊泡的人工细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125 ml 锥形瓶	VWR	89000-360
18 号针头	VWR	BD-305196
25 mm 方形盖玻片	VWR	48366-089
琼脂糖	Sigma	A9539	用于DNA凝胶电泳的标准琼脂糖
氯仿	Sigma	288306-2L
商用CoverWell密封圈	Electron Microscopy Sciences	70336	压合式硅胶隔离器
Fiji图像分析软件	ImageJ		免费下载：http://fiji.sc/Fiji
带聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃小瓶	VWR	66009-556	容量1.9 ml，每箱144个
罗丹明B标记的PE脂质（Liss-rhodamine B PE Lipid）	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg脂质，溶于氯仿，浓度为1 mg/ml
封口膜（Parafilm）	VWR	52858-000	10.2 cm × 38.1 m
聚环氧乙烷-嵌段-聚丁二烯（poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene)）或PEO-PBD（分子量为2,940）	Polymer Source	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
塑料培养皿	VWR	25384-092
聚四氟乙烯生料带（Teflon tape）	VWR	300001-057	1/2" 宽度