跑步机疲劳测试：一种简单、高通量的小鼠类疲劳行为检测方法

摘要

疲劳是许多疾病和障碍中常见、治疗不足且常被误解的症状。新的临床前疲劳检测方法可能有助于增进对疲劳的现有认识并改善未来的治疗。为此，本方案提供了一种测量小鼠疲劳样行为的新方法。

摘要

疲劳是多种疾病和障碍中的显著症状，会降低许多人的生活质量。由于疲劳的发病机制尚不明确，且现有干预措施无法充分治疗所有患者的疲劳，因此亟需新的治疗方案。尽管临床前研究在发现潜在新型疗法方面具有重要的治疗意义和价值，但目前可用的疲劳临床前检测方法却很少。此外，用于评估疲劳样行为最常见的临床前检测方法——自主转轮跑动实验——并不适用于某些品系的小鼠，可能对减轻疲劳的药物不敏感，且通量相对较低。本方案介绍了一种新型的非自主性临床前疲劳样行为检测方法——跑步机疲劳测试，并提供了证据表明该方法能够有效检测经化疗药物处理后出现疲劳样行为的小鼠（该药物已知可在人类中引起疲劳，并在动物中引发疲劳样行为）。与转轮跑动实验相比，该检测方法可能是一种有益的替代方案，可在更短时间内对更多小鼠进行疲劳样行为及潜在干预措施的评估，从而加快新疗法的发现进程。

引言

疲劳影响着广泛的人群，可显著降低生活质量，且其发病机制常常不明确或未知。例如，大多数接受治疗的癌症患者都会经历癌症相关性疲劳（CRF），这种疲劳可在癌症治疗结束后长期持续，甚至在无明显可检测癌细胞的情况下依然存在¹。此外，疲劳也是多种其他疾病和障碍中的突出症状，包括慢性疲劳综合征、抑郁症、糖尿病和纤维肌痛。幸运的是，已有一些非药物干预措施能够帮助部分疲劳患者（例如，运动可减轻部分乳腺癌患者的CRF^2,3），但仍有许多患者缺乏有效治疗。此外，目前用于CRF的药物治疗尚未被证实具有广泛的有效性，甚至在某些情况下完全无效^4-7。

尽管临床上对治疗疲劳存在迫切需求，且目前缺乏有效的药物治疗手段，但用于支持新型抗疲劳药物发现与开发的临床前疲劳检测方法仍十分匮乏，尤其是在动物模型中。目前唯一可用于啮齿类动物研究的临床前疲劳检测方法之一是自主转轮跑动活动（voluntary wheel running activity, VWRA）^9-15，该方法允许小鼠或其他啮齿类动物自由接触转轮，并记录其每日的跑动活动。在许多研究中，VWRA是评估类疲劳行为的唯一指标，类疲劳行为被定义为实验组中所测得的体力活动减少（无论是通过VWRA还是本方案进行评估）。尽管VWRA可提供一种有用的纵向评估类疲劳行为的方法，但其通量相对较低，不同近交系小鼠之间的跑动行为存在显著差异¹⁶，且该方法要求实验动物单独饲养，这可能引起行为变化并影响测试表现^17-19。其他检测方法，如笼内行为监测与分析，也可实现连续数据采集，部分系统甚至允许动物成对饲养²⁰。这些方法具有一定应用价值，但在检测类疲劳行为方面的敏感性可能较低，且与转轮跑动类似，通量也较低。

与VWRA相比，小鼠跑台实验不依赖于动物的自主活动，且可在较短时间内完成，从而实现更高的通量。与VWRA相比，这类实验采用外部激励手段。具体而言，通常在移动跑带后方设有一个带电的金属网格，当小鼠停止奔跑时会受到电击刺激。除了该电击网格外，还可通过其他多种方式激励小鼠在跑台上奔跑，包括用手、刷子或其他工具轻触、戳刺小鼠，或向其施加短暂的气流刺激。小鼠跑台实验通常并非用于评估疲劳，而是用于测量有氧和/或无氧运动能力^21-25。实验中通过电击刺激迫使小鼠持续奔跑，直至其无法或不愿继续奔跑以逃避进一步的电击。当小鼠达到力竭标准时，测试即终止。在这些实验方案中，为确保小鼠达到真正的生理力竭状态，力竭标准通常被定义为小鼠在电击网格上连续静卧达五秒，并在反复施加厌恶刺激的情况下仍无法恢复奔跑。因此，在典型的跑台实验中，由于外部激励手段及终止标准具有强烈的厌恶性质，类似疲劳的行为表现可能被掩盖。有趣的是，与许多其他使用啮齿类动物跑台的研究不同，最近一项研究描述了一种不同的跑台疲劳测试方法，并将其用于探究社会应激对小鼠的影响²⁶。尽管该研究团队所采用的方法与本实验方案存在显著差异（即，他们使用单通道跑台，并以持续10秒的电击作为测试终止标准），但该研究突显了开发一种快速、简便的小鼠跑台疲劳测试方法的实用价值与研究兴趣。

疲劳可能通过转轮跑动以外的其他方式以及日常行为的改变来检测。根据肌电图分析，慢性疲劳综合征（CRF）患者在肌肉疲劳程度较轻时即感到精疲力竭，而无CRF者则不会出现此种情况²⁷。此外，已有研究指出动机减退现象，并通过多种评估人类疲劳的量表对其进行测量^28,29。因此，一种有效的疲劳样行为的临床前检测方法应能基于非生理能力指标来区分健康小鼠与疲劳小鼠，且不应掩盖动机下降的情况。为实现这一目标，同时避免VWRA及其他检测方法的局限性，本研究通过改进小鼠跑台实验建立了新的方法。该方法仅使用电击网格作为外部刺激因素，促使小鼠在跑台上奔跑。小鼠会迅速学会网格可引起厌恶刺激，一旦被放置在跑台上便会立即远离该区域，并在奔跑过程中持续保持一定距离以避免接触。

当小鼠疲劳时，它们会逐渐在跑台后部停留更长时间，而无法继续在前端维持奔跑速度。因此，本实验方案的测试终止标准为在指定的疲劳区域持续停留五秒即跑台后部区域，范围从电击网格前约一个体长处直至并包括电击网格本身。该方法利用了网格本身的厌恶特性，使小鼠在训练后无需接受大量甚至任何实际电击即可完成测试。通过允许小鼠依据当前标准（如上所述）完成测试而非直至力竭，该方法可用于评估类似疲劳的行为表现，而非其最大（或接近最大）的生理能力。因此，该方法可提供一种简单、高通量的小鼠类似疲劳行为检测手段，既可作为独立指标，也可与其他类似疲劳行为检测方法相互补充。

方案

该实验方案已获国家糖尿病、消化病和肾脏病研究所动物护理与使用委员会批准。

1. 准备

1. 为便于在测试前快速识别每只小鼠，应对所有将接受训练和测试的小鼠尾巴进行纹身标记以作身份识别。
   注意：此步骤为可选。可使用记号笔或其他标识方法替代纹身标记。
2. 在训练和测试小鼠之前，确保跑步机放置在平坦的表面上，并将跑步机调节至所需的倾斜角度（推荐倾斜角度：10°，在整个训练和测试过程中保持一致），并适当设置电击频率和强度（推荐：2 Hz，1.22 mA）。
   注意：所使用的电击在未戴手套的手指接触时应仅产生轻微的刺痛感，并以脉冲方式释放（每次电击持续200毫秒）。
3. 在跑步机下方放置一张干净的牛皮纸或吸水垫，用于收集训练和测试期间的粪便颗粒和尿液。
4. 在跑台外壳的三分之一处覆盖一张纸或吸水垫即跑台通道上方的透明塑料盖，距离电击网格最远的一端。
   注意：此步骤为可选操作，但可形成较暗的空间，可能进一步促使避免跑台的下部区域。
5. 若计划在训练过程中使用金属刷以提供额外刺激，需确保在开始训练前已备好金属刷。
6. 确保在步骤 2.14 期间，任何用于诱导和/或缓解疲劳的药物或方法均可获得，并可进行配制或实施。

2. 训练小鼠使用跑步机

注意：必须进行训练，以确保小鼠熟悉跑台设备和任务，以便在测试时能够正常表现。如果在训练过程中，大多数小鼠频繁受到电击或表现不佳，则应增加额外的训练次数。在第一天训练中，大多数小鼠会多次受到电击。到第二天训练时，小鼠应极少再接触到电栅。若某只小鼠持续表现出训练效果差的情况，应将其从研究中剔除。对于雌性C57BL/6NCr小鼠而言，这种情况极为罕见（因训练表现差而被剔除的研究对象不足1%），但需注意，其他品系的小鼠在训练中的表现可能有所不同。

1. 关闭跑台（并将速度设为 0 m/min），逐个抓住小鼠尾巴将其放入小鼠跑台的不同通道中。每放置一只小鼠到跑台上后，立即开启对应的电刺激网格。确保小鼠直接放置在跑台传送带上。
   注意：为尽量减少抓握小鼠尾巴的时间和距离，应在转移小鼠前将笼子置于跑台附近，和/或让小鼠站在一个稳固平台（例如，金属丝笼盖）上，直到它们接近跑台且实验人员准备将其放入跑台。
2. 让小鼠自由探索跑台 1–3 分钟，或直到每只小鼠已探索其所在通道和/或至少接受过一次网格电刺激。
3. 开启跑台，并缓慢增加速度直至传送带开始移动（约 1.5 至 3.0 m/min）。监测所有小鼠，确保它们开始行走。如果某只小鼠未开始行走或朝电刺激网格方向行走，应准备通过使用金属丝刷轻触或轻挠尾巴的方式进行干预。
4. 将跑台速度缓慢增加至 8 m/min。启动计时器，并继续观察行为。
5. 在第 5 分钟时将跑台速度增至 9 m/min，第 7 分钟时增至 10 m/min，并在第 10 分钟时停止跑台。
6. 让小鼠短暂地继续探索跑台，然后将其逐一取出并放回各自的笼子中。
7. 用酒精清洁跑台和电刺激网格，并更换跑台下方的纸张或吸水垫。
8. 如需训练其他小鼠，请重复步骤 2.1 至 2.7。
   注意：在将新小鼠放置到跑台前，应确保酒精已完全干燥。
9. 在训练的第二天，重复步骤 2.1。开启跑台并将速度增至 10 m/min。启动计时器。
   注意：跑台速度的增加可比第一天训练时更快。
10. 在第 5 分钟时将跑台速度增至 11 m/min，第 10 分钟时增至 12 m/min，并在第 15 分钟时停止跑台。
11. 取出小鼠并将其放回各自的笼子中。
12. 用酒精清洁跑台和电刺激网格，并更换跑台下方的纸张或吸水垫。如需训练其他小鼠，请重复步骤 2.9 至 2.12。
13. 以与第二天相同的方式再进行额外 3 天的训练。
    注意：此步骤为可选，但如果所训练的大多数或全部小鼠（相同性别和品系）在任务中表现出困难，则强烈建议执行。通常情况下，经过 3 天训练（即，额外增加一天训练）的小鼠在步骤 3 中表现良好；然而，具体训练天数可根据小鼠在第二天训练中的表现以及步骤 2.14 的持续时间适当增减。
14. 在进入步骤 3 之前，至少间隔一整天，期间不得让小鼠接触跑台。
    注意：任何用于诱导和/或缓解疲劳的药物均应在该阶段给予。
    注意：该时间段的长度可根据需要调整，可用于诱导疲劳和/或测试干预措施以减轻或消除疲劳。若在完成训练后超过 7 天再进行测试，建议先开展预实验，以确认所用小鼠在测试期间仍能正常表现。

3. 跑台疲劳测试

注意：在此测试中，类似疲劳的行为定义为在"疲劳区域"持续停留5秒。疲劳区域是指跑带表面靠近电击网格约一个体长范围内的区域，以及电击网格本身。测试前，应确保实验人员明确该区域的分界点，例如在跑带通道的顶部或侧面做标记以示区分。

1. 将跑步机速度设置为 12 m/min。此时不要启动跑步机。确保电击网格已关闭。
2. 将小鼠分别放入跑步机的不同跑道中。每放置一只小鼠到跑步机上后，立即开启对应的电击网格。
3. 同时启动跑步机和秒表。
   注意：测试过程中不得干预，除非移除符合终止标准的小鼠（见步骤 3.5）。
4. 按照表 1所示逐步增加跑步机速度。在整个测试过程中密切观察所有小鼠。
   注意：表 1中列出的跑步机速度是基于成年雌性 C57BL/6NCr 小鼠的观察结果选定的。对于体型更大（例如，远交系 CD-1 小鼠）或运动能力更强的小鼠，可能需要更高的跑步机速度。
5. 若某只小鼠在疲劳区停留达连续 5 秒，应立即将其从跑步机上移除，并记录其跑步持续时间和跑步距离。
6. 当所有小鼠均已被移除后，停止跑步机运行。使用酒精清洁跑步机和电击网格，并更换跑步机下方的纸张或吸水垫。
7. 如需测试更多小鼠，请重复步骤 3.1 至 3.6。
   注意：此步骤为可选步骤。

结果

本方案通过跑步机测量小鼠的疲劳样行为。本节所示数据采用当前方案训练和测试三组不同的小鼠获得（不包括图1A和1C）。为诱导疲劳，给予5-氟尿嘧啶（5-FU），这是一种已知可在人类中引起疲劳³⁰、在小鼠中引起疲劳样行为^10,13的细胞毒性化疗药物。所有数据均来自成年雌性C57BL/6NCr小鼠。测试时小鼠年龄为9-10周（图1和2）或9-13周（图3）。

图1展示了小鼠在经过5天训练后，采用先前已发表模型¹⁰中描述的方法，接受5-FU处理（60 mg/kg/天，持续5天）以诱导疲劳状态的数据。完成处理后，使用运动能力测试对小鼠进行评估（图1A），该测试采用表2中列出的跑步机速度，并通...

讨论

本方案描述了如何使用小鼠跑台来测量类似疲劳的行为。与常用的临床前疲劳样行为检测方法VWRA相比，该方法具有多项优势。VWRA要求小鼠主动选择与测试装置互动，因此某些近交系小鼠极少与转轮互动¹⁶，其跑步量极低，可能导致难以甚至无法识别疲劳引起的活动减少。相比之下，跑台疲劳测试消除了这一选择性，因此为不使用跑轮的小鼠提供了可行的替代性疲劳样行为检测方法。本方案可作为VWRA或其他疲劳样行为测量方法的替代或补充，尤其适用于在小鼠模型中测试潜在的药物疗法以减轻疲劳。在通过预实验确认特定小鼠模型中可观察到疲劳样行为后，可给予潜在治疗干预以缓解疲劳并减少疲劳样行为。若药物干预在本方案测试中能够减弱疲劳样行为，则该药物（或类似药物）可能对治疗某些类型的人类疲劳具有治疗价值。此外，尽管从临床前研究过渡到临床试验仍需经历诸多必要步骤，但与VWRA相比，本方案可在更短时间内测试更多小鼠，从而更快地研究和理解疲劳样效应及潜在治疗方法。

使用本方案时需注意若干重要限制与考虑因素。首先需指出，由于该实验需通过体力活动来测量类似疲劳的行为，因此可能不适用于诱导恶病质或肌肉萎缩的实验条件<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Exer 3/6 动物跑台	Columbus Instruments	1050-RM Exer-3/6
秒表	Daigger	EF24490M
金属刷	Fisher Scientific	03-572-5
压缩空气	Dust-Off	FALDSXLPW
吸水垫	Daigger	EF2175CX
牛皮纸	Newell Paper Company	4620510
酒精（70%）	Fisher Scientific	BP82011