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三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

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DOI：

10.3791/54055

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2016年5月13日

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

本文内容

摘要

转基因操作和基因组编辑对于功能验证基因和cis-调控元件的作用至关重要。本文针对新兴的模式鱼类——三刺棘背鱼，详细介绍了用于产生基因组修饰（包括Tol2介导的荧光报告转基因构建体、TALENs和CRISPRs）的显微注射方案。

摘要

三刺棘背鱼已成为研究多种形态学、生理学和行为表型遗传基础的有力模型系统。随着海洋种群适应无数淡水环境而演化出极为多样的表型，加之海洋型与淡水型之间可进行杂交，这为脊椎动物中罕见的遗传研究体系提供了可能，使得研究人员能够利用遗传学方法定位控制演化性状的基因组区域。目前已有优质的基因组资源，有助于对演化改变进行分子遗传学解析。尽管基因定位实验能够产生一系列有趣的候选基因列表，但仍需通过功能遗传操作来验证这些基因的作用。利用Tol2转座酶系统将转基因报告质粒和BAC整合到基因组中，可研究基因调控。通过TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑工具诱导靶向突变，可评估特定候选基因及cis-调控元件的功能。所有这些方法均需将核酸导入受精后的单细胞棘背鱼胚胎，但由于棘背鱼胚胎具有较厚的绒毛膜以及相对较小且薄的卵裂球，该操作颇具挑战性。本文详细描述了将核酸显微注射至棘背鱼胚胎的操作流程，适用于转基因和基因组编辑研究，以分析基因表达与功能，并介绍了评估转基因成功与否及建立稳定品系的技术方法。

引言

理解生物多样性产生机制的一个基本组成部分是确定自然界中进化表型变化的遗传和发育基础。三刺棘背鱼（Gasterosteus aculeatus）已成为研究进化遗传基础的优秀模式生物。随着海洋鱼类不断迁入北半球无数的淡水环境，棘背鱼经历了多种适应性进化改变，导致了显著的形态学、生理学和行为学变化1。已有21个棘背鱼种群个体的基因组被测序并完成组装，并构建了高密度连锁图谱以进一步优化基因组组装质量2,3。遗传定位实验已鉴定出控制进化表型的基因组区域4-6，在少数情况下，特定候选基因的功能作用也已得到验证7,8。目前已发现多个与形态变化相关的基因组区域，并提出了有潜力的候选基因，但这些候选基因尚未经过功能验证9-12。此外，棘背鱼也是种群遗传学/基因组学13,14、物种形成15、行为学1、内分泌学16、生态毒理学17、免疫学18和寄生虫学19研究中常用的模型生物。未来在这些领域的研究都将受益于在棘背鱼中进行功能遗传操作的能力。除了对编码序列进行操作外，还可通过研究候选基因的cis-调控序列，或功能性地增强、减弱或消除候选基因的表达来评估其作用。棘背鱼中的显微注射和转基因技术已较为成熟7,8,20，最初采用的是基于巨核酸酶介导的方法21，该方法最早在青鳉鱼中被描述22。本文所介绍的改进版显微注射方法已针对Tol2介导的转基因以及近年来发展的基因组编辑工具（包括TALENs和CRISPRs）进行了优化。

人们认为，cis-调控元件的改变对形态进化至关重要，因为cis-调控变化可以避免编码区突变带来的负面多效性后果23。因此，检测和比较假定的cis-调控序列已成为越来越多进化研究的核心目标。此外，大多数人类疾病相关变异属于调控性变异24,25，而研究cis-调控元件的功能与调控机制迫切需要合适的模式脊椎动物系统。体外受精且产卵数量大的鱼类为研究cis-调控提供了强有力的脊椎动物模型。Tol2转座子系统可高效地将质粒构建体整合到鱼类基因组中，该系统将待整合的外源DNA置于Tol2转座酶结合位点之间，并与Tol2转座酶mRNA共注射26-28。通常，将潜在的增强子克隆至基础启动子（如hsp70l29）上游，并插入Tol2载体中，与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）或mCherry等荧光报告基因连接，随后与转座酶mRNA共同注射26。通过观察荧光报告基因在注射后胚胎或稳定整合转基因后代中的表达情况，可获得该假定增强子驱动基因表达的时空调控信息。在后续实验中，经验证的增强子可用于驱动目的基因在特定组织中的过表达。

用于较大样本的分析 顺式-调控区域，已利用细菌人工染色体（BACs）为海洋和淡水刺鱼构建了高质量的大片段基因组文库30这些BAC可通过重组工程技术，在长达150-200 kb的基因组区域内，将目标基因替换为荧光报告基因。31荧光报告基因随后将根据BAC内调控序列决定的时空模式进行表达。在鱼类研究中，可在BAC上添加Tol2位点以促进其基因组整合32,33发育的后期阶段，当 原位 杂交在技术上具有挑战性，但BAC的荧光读出可用于研究基因表达模式，这一点已在刺鱼中得到证实 骨形态发生蛋白6 (Bmp6)20此外，可以对个体中的荧光表达模式进行随时间追踪，而这是传统方法无法实现的 原位 杂交。BAC还可用于添加基因组区域的额外拷贝，以增加目的基因的剂量。

在基因功能研究中，基因组编辑是一个迅速发展的领域，可用于在多种生物体中对基因组序列进行靶向修饰34。转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）是一类模块化、序列特异性的核酸酶，最初来源于植物病原体，可被精确设计以直接结合特定的基因组序列，并产生双链断裂35,36。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统最初在细菌中发现，利用向导RNA和Cas9 蛋白在与向导序列互补的目标DNA序列上造成断裂37。TALENs和CRISPR介导的双链断裂在后续修复过程中常导致小片段的插入或缺失，从而破坏目标序列的功能35-37。在刺鱼中，TALENs已被用于靶向增强子以干扰基因表达20，而TALENs和CRISPR均已在编码序列中成功诱导突变（未发表数据）。针对斑马鱼设计CRISPR的详细实验方案可作为开发刺鱼CRISPR工具的参考指南38。

转基因和基因组编辑实验需要将核酸导入新受精的单细胞胚胎中。通过在发育早期引入转基因或基因组编辑工具，可使胚胎中遗传操作的子代细胞数量最大化。随后对注射后的胚胎进行荧光观察或分子检测，以筛选基因组修饰。如果成功靶向了生殖系来源的细胞，即使注射后胚胎致死率较高，转基因或突变仍可传递给部分子代。嵌合体鱼可通过杂交或互交，并对其子代进行筛选，以获得目标突变等位基因或稳定整合的转基因。本方案描述了将转基因和基因组编辑试剂导入单细胞刺鱼胚胎，并检测基因组修饰是否成功的方法。

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方案

所有鱼类实验均经加州大学伯克利分校机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 R330）。

1. 准备注射用核酸

  1. Tol2 质粒转基因技术（改编自 Fisher）26).
    1. 切割 10 µg 转座酶质粒（pCS-Tp）39 使用10 U NotI及提供的缓冲液，37 °C孵育1小时 37 °C 线性化。
      注意：获取 Tol2 质粒可能需要签订材料转移协议。
    2. 根据标准方案，使用25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液抽提切割后的质粒，并用乙酸钠进行乙醇沉淀40. 将质粒重悬于 50 µl 无RNase水
      注意：苯酚-氯仿应在通风橱中使用，废液必须根据机构规定妥善处理。
    3. 根据制造商说明书设置 Sp6 转录反应。
    4. 使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书纯化转录反应产物；将RNA重悬于 50 µL 无RNase水
    5. 移除 a 1 µl RNA 分装。加热至 65 °C 5分钟以变性二级结构，然后立即置于冰上冷却。将剩余的转录反应物在-80 °C.
    6. 在0.5×TAE（Tris碱，乙酸，乙二胺四乙酸）电泳缓冲液中，使用含RNA大小标准品的一道，对RNA分装样品进行1%琼脂糖凝胶电泳。预期产物为2,200 bp；若不符合则弃用 >总RNA中有5%出现在小于2,200 bp的弥散条带上，表明存在严重降解（图1).
    7. 使用分光光度计在 260 nm 处定量 RNA。稀释至 350 ng/µl 在无RNase的水中并储存 1 µl -80 ℃分装保存80 °C （至少两年内有效）。
    8. 克隆 Tol2 报告质粒（例如使用 pT2HE）8 或 Tol2 试剂盒中的质粒41）与 顺式-目的调控元件。简言之，使用含有质粒中相应限制性内切酶识别位点的引物，通过PCR扩增目的基因组DNA片段，将PCR产物和载体分别用相应的限制性内切酶消化，连接插入片段与载体，然后将连接产物转化至感受态细胞中 E. coli40使用包含内毒素清洗步骤的试剂盒，按照制造商提供的方案提取质粒。
    9. 使用PCR纯化试剂盒按照生产商说明书对Tol2质粒进行第二次纯化。洗脱于 30 µl 无RNase水
      注意：此步骤的产量可能较低（有时低于输入质粒的50%）。
    10. 将质粒稀释至约 125 ng/μLµl 在无RNase的水中。

RNA转录凝胶电泳，转座酶mRNA，最小降解，RNA标记物。
图1. 转座酶mRNA凝胶图谱。 取1 µl纯化的转录反应产物，于65 °C加热后冰上冷却，随后在含0.5×TAE电泳缓冲液的1%琼脂糖凝胶中以100 V进行电泳。左侧标注了RNA标记物的千碱基（kb）大小。全长转座酶mRNA在约2.2 kb处呈现一条明亮条带。在2.2 kb以下可见少量但可接受的降解或不完整mRNA。 请点击此处查看该图的高清版本。

  1. BAC 转基因（有关 BAC 重组技术，请参见 Suster32,33）
    1. 根据制造商说明书，使用 BAC 纯化试剂盒从 E. coli 中制备 BAC。采用乙醇沉淀法，通过标准的醋酸钠-乙醇提取40回收 DNA，并将 DNA 重悬于无 RNase 水中，浓度约为 250 ng/µl。
    2. 按照第 1.1 节方法制备转座酶 mRNA。
  2. 使用 TALEN 诱导突变（有关 TALEN 设计，请参见 Cermak35）
    1. 使用基于网络的应用程序设计目标基因的 TALEN42。如有可能，应设计 TALEN 以破坏限制性内切酶切割位点，以便于分子分析。
    2. 克隆 TALEN 并按照已发表的方案35制备用于转录的质粒。
    3. 根据制造商说明，使用 Sp6 转录反应合成 TALEN mRNA，并按照第 1.1.4 节中转座酶 mRNA 的方法纯化 mRNA。使用分光光度计定量后，用无 RNase 水稀释至 200 ng/µl。将 TALEN mRNA 在凝胶上电泳，以确认其大小正确且未降解，方法见步骤 1.1.6。
    4. 使用引物设计工具和目标 DNA 序列43，设计一对 PCR 引物，用于扩增 TALEN 靶序列周围约 100–200 bp 的片段。根据第 1.3.1 步的结果，订购合适的限制性内切酶，用于检测靶位点的突变。
  3. CRISPR 转基因（有关 CRISPR 的设计与制备，请参见 Talbot 和 Amacher38）：
    1. 根据方案38设计并制备 CRISPR 和 Cas9 mRNA，并按照第 1.3.4 步所述订购适当的验证引物和限制性内切酶。

2. 准备注射试剂

  1. 使用硼硅酸盐毛细管按以下所述制备针头。
    注意：这些毛细管并非斑马鱼显微注射所用的标准毛细管，而是由更厚、更强韧的玻璃制成，这对于穿透刺鱼坚韧的卵膜至关重要。
    1. 操作针头时务必佩戴腈类或乳胶手套，且避免针头接触皮肤或皮肤油脂。
    2. 通过遵循移液器拉制仪制造商的说明，进行梯度测试以经验方式确定移液器拉制参数。例如，使用盒式灯丝时，确定以下参数为最佳：（加热值 = 515，拉力 = 60，速度 = 60，延迟 = 85，压力 = 500）。这些设置可制备出在约 12° 约2毫米，然后是一段长约6毫米、以约2°逐渐变细的长延伸部分（图2).
      注意：合适的参数因拉制仪和灯丝而异，若未先通过梯度测试确定参数而盲目使用程序，可能导致拉制仪的灯丝永久性损坏，而灯丝更换困难且成本较高。
    3. 按照制造商说明，使用2.1.2节中确定的参数，从硼硅酸盐玻璃中拉制至少4个微移液针。
    4. 将针头垂直存放于毛细管储存罐中，针尖朝下。
    5. 注射前，将毛细管储存罐置于冰上以冷却针头。在罐内加入一块湿润的纸巾，以防止针头填充后发生蒸发。
  2. 受精卵（所有步骤均在室温下进行）
    1. 通过轻轻挤压怀卵雌性刺鱼的腹部，并从前向后方向轻抚，将卵从泄殖腔挤出，收集至35 x 10 mm培养皿中2 培养皿。在培养皿的一侧放入一张湿润的纸巾（不要接触卵），以形成保湿环境。盖上培养皿盖，使卵保持湿润。
    2. 使用含0.1%碳酸氢钠缓冲的0.025%三卡因-S溶液处死雄性刺鱼。
    3. 切开腹部，取出睾丸并研磨于 250 µl Hank's 溶液（参见 Westerfield）44 完整方案请参见Hank's溶液的配制方法。
    4. 最多用100个卵进行受精 50 µl 精子溶液，并用移液器枪头轻轻搅拌，以确保所有卵子均受精。如果卵块 >100枚卵，将其中一半卵在稍后受精，以确保所有胚胎在注射时均处于单细胞期。卵可在室温下保持未受精状态长达1小时，精子通常在1-7天内保持活性 4 °C 在Hank's溶液中。
    5. 受精后用培养皿盖盖住胚胎，以防干燥。等待20-25分钟，直至第一个细胞出现并膨胀（此期间可准备注射材料）。
    6. 用刺鱼养殖用水填充一个150 mm × 15 mm的培养皿。（配制刺鱼养殖用水的方法：首先将碳酸氢钠配制成10%的溶液，溶于去离子水中；然后每1 L去离子水中加入3.5 g人工海水混合物和0.217 ml 10%碳酸氢钠溶液，充分搅拌或剧烈震荡以使盐完全溶解。）
  3. 制备注射溶液（在卵子受精期间）
    1. 根据说明制备注射液 表1 并置于冰上保存。
      注意：由于刺鱼卵裂球的体积大于斑马鱼，部分核酸的浓度相较于斑马鱼已有所提高。
试剂Tol2 注射BAC 注射TALEN 注射CRISPR 注射
Tol2 mRNA350 ng350 ng--
DNA150–200 ng 质粒200–300 ng BAC--
TALEN mRNA--每种 200 ng-
CRISPR guide RNA---200 ng
Cas9 mRNA---400 ng
0.5% phenol red in Dulbecco's PBS0.5 µl0.5 µl0.5 µl0.5 µl
RNA酶-free水加至 5 µl加至 5 µl加至 5 µl加至 5 µl

表1：注射试剂。所有混合物应配制为总体积5 µl，并置于冰上保存。

  1. 填充针头（置于冰上；至少预留10分钟让针头充分填充）。
    1. 将至少三根针头垂直悬挂在毛细管储存罐中，用移液器将0.5 µl注射液滴加到针头的钝端以进行反向填充。注意使液滴停留在顶端，避免沿侧壁流下，并防止产生气泡。
    2. 待红色液体大部分流至针头尖端后，再向钝端添加0.5 µl液体，并使其自然流下。

3. 准备显微注射装置和注射针

注意：这些步骤通常可以在卵子受精后进行。

  1. 打开解剖显微镜的透射光源，将一块约 13 cm × 13 cm 的玻璃板放置在显微镜光源底座上，并在玻璃板上方放置一个直径为 15 cm 的石膏锯片7。将锯片垂直于注射装置放置，使锯齿朝向针头夹持器。
  2. 打开气源，确保调压阀输出压力约为 200 kPa。
  3. 打开控制盒并调节设置：将压力设定为约 150–175 kPa，注射持续时间设定为 180 毫秒。
  4. 松开针头夹持器，将装有液体的针插入夹持器，直至感受到橡胶夹持器的阻力，然后用手拧紧至稳固。
  5. 调节针头角度至约 45°。
  6. 使用显微操作器控制装置调节针头位置，使其末端位于视野中央。放大至约 40 倍，聚焦于针尖，确保针尖未接触下方的玻璃表面。
  7. 用钟表匠镊子轻轻夹住针尖将其折断。理想情况下，不应垂直折断，而应以约 60° 角度折断。折断位置应靠近针尖（距离末端不超过 2–3 个镊子宽度，图 2）。

光纤拉制过程的显微图像，展示尖端精密变细的方法。
图2. 完整与断裂的显微注射针。 上方的针头完整，下方针头的尖端用镊子折断（箭头所示）。针内充满含0.05%酚红的溶液。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 多次踩下注射脚踏板，测试针头是否已断裂。轻踩几次后，针尖应开始出现微小的红色液滴。若无液滴出现，可尝试在稍高位置轻微折断针头。
  2. 若针头内有气泡，应调高回压装置，并快速踩压脚踏板数次，以排出气泡。
  3. 调节回压：
    1. 使用一次性移液器将数滴刺鱼用水滴加到玻璃板上。
    2. 缓慢将针头浸入水中。
    3. 逐渐增加回压，直至针尖有微弱的粉红色液体流出（表明处于正压状态）。
      注意：若回压不足，针头会因毛细作用吸入细胞质；若回压过高，可能导致注射体积意外偏大。
    4. 将针头尽可能回撤，以免在准备胚胎时损坏针头（见下文）。
  4. 或者，可将回压调至较高压力，使针头浸入水中时持续有较强的液流排出。此时无需踩压脚踏板即可完成注射；但注射操作必须迅速，以避免过量注射。
    注意：初学注射时请勿尝试此方法。

4. 显微注射

  1. 受精后约 25 分钟，使用两支 10 µl 移液枪头从卵群中取出 5-10 个胚胎，并转移至玻璃板上。
  2. 继续使用移液枪头，将胚胎轻柔地分开放入锯片的各个凹槽中。注意避免刺破胚胎。
  3. 使用剪去尖端的移液管，使刺鱼胚胎能够进入管内，加入足量刺鱼养殖用水以覆盖胚胎，保持 3-5 秒后，用移液管吸除多余液体，仅保留少量液体覆盖每个胚胎表面。
    注意：液体过多会导致卵膜硬化，从而损坏注射针头；但保留少量液体有助于将卵膜与细胞及卵黄分离（图 3A-B）。
  4. 从距离最远的胚胎开始，移动玻璃板并放大视野，使第一个胚胎占据视野约 25% 的范围。
  5. 将注射针头移入视野，然后用 10 µl 移液枪头轻柔旋转胚胎，识别卵裂球——即位于卵黄上方、呈颗粒状、略带黄色的细胞质隆起（图 3B），再旋转胚胎，使卵裂球正对针头末端且与之垂直（同时保持胚胎位于锯片凹槽内，图 3C）。
    注意：旋转胚胎时卵黄颗粒可能发生移动，因此不应以其位置作为卵裂球定位的参考。
  6. 将针头插入细胞质中，但不要穿透至下方的卵黄。穿刺卵膜时应缓慢均匀施加压力，以防针头断裂。若针头明显弯曲，应将其回撤，并在稍不同位置重新尝试。
  7. 踩下脚踏开关 3-4 次进行注射，使呈微扩散边缘的红色团块体积约占细胞质直径的 ~1/8（见 图 3D）。
    1. 应避免出现边缘锐利且不扩散的红色团块，这表明注射进入了细胞质下方的卵黄（图 3E）。
    2. 若亮粉红色斑点迅速扩散，说明针头未刺入卵裂球，需进一步插入以穿刺卵裂球。
    3. 若注射团块立即变为黄色，应旋转胚胎以确认卵裂球是否已准确靶向，并重新注射（图 3F）。

细胞质注射方法；示意图展示理想的、次优的和错过的注射情况。
图3. 刺鱼胚胎注射前后的外观。所有胚胎均以显微镜下俯视角度绘制（C' 和 G 除外）。(A) 加水前，受精胚胎外观均匀，油滴漂浮在卵黄顶部附近。(B) 加水后，绒毛膜膨胀，显示出一个从卵黄突出的卵裂球，并可在侧面观察到。(C) 胚胎旋转，使针头垂直于绒毛膜和卵裂球进入。(C') 针头刺穿绒毛膜并尖端位于细胞质中的侧面视图。(D) 向细胞质内注射会产生边缘弥散、随时间逐渐消退的红色斑点。(E) 向细胞质下方的卵黄注射会产生边缘清晰的红色斑点。(F) 向与细胞质相对一侧的卵黄注射会导致 pH 诱导的颜色变化，由红色变为黄色。(G) 注射结果的侧面视图，X 标记表示次优注射位置。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用显微操作仪的控制装置将针头回撤；若胚胎粘附在针头上，可用10 µl吸头压住胚胎以防止其随针头带出。
  2. 回撤针头后，移动玻璃载片，使下一个胚胎与针头对齐。
  3. 完成所有胚胎注射后，使用移液管向胚胎中加入水，然后用移液管收集胚胎，并转移至盛有刺鱼培养用水的150 mm培养皿中。
  4. 用纸巾将玻璃载片擦干，避免积聚过多水分。
  5. 将新鲜胚胎重新分布到切割架上，重复步骤4.4至4.10。
  6. 保留约10%的胚胎作为未注射对照组，以确保未注射胚胎能够正常发育，并作为后续所述分子检测中的野生型对照。

5. 注射后护理

  1. 注射后将胚胎置于培养皿中，在 18 °C 条件下孵育直至孵化10。孵化后按文献所述方法在水族箱中饲养幼鱼10。
  2. 注射后一天，轻轻倒出刺鱼用水，并更换为新鲜的刺鱼用水。此后至少每隔一天更换一次新鲜刺鱼用水。
  3. 每天检查是否有死亡或畸形的胚胎。及时移除此类胚胎，以防止腐败污染水质。

6. 注射结果的分析

  1. 注射荧光报告基因后，在暗室中每日使用配备 GFP 或 RFP 滤光片（根据荧光转基因选择）的荧光体视显微镜观察胚胎。通过数字照片和/或文字描述记录基因表达的解剖学模式，并统计在不同表达区域中具有表达的鱼类数量图4 和 5).
    注意：刺鱼在受精后4天（dpf）开始，在GFP滤光片下可见具有自发荧光的星状色素细胞。
    1. 为获得稳定品系，保存可检测到荧光的胚胎，并按所述方法培育至成年10.
    2. 将已注射的成年鱼与野生型鱼进行杂交 体外 按照第2.2节所述的受精程序操作，并按步骤6.1所述筛选后代的荧光情况，以寻找具有荧光的后代，表明转基因成功传递。
    3. 为了观察孵化后自由游动幼虫中的荧光，添加 500 µl 向150 mm培养皿中加入0.8% Tricaine以麻醉鱼类，待鱼停止游动后进行成像。观察与成像后立即用新鲜的刺鱼养殖水反复冲洗数次。
    4. 可选地，为保留荧光以进行后续成像，使用含0.025%（250 mg/L）Tricaine并以0.1%碳酸氢钠缓冲的溶液处死幼虫，并在4%多聚甲醛（溶于1×磷酸盐缓冲液，PBS）中固定4小时，置于 4 °C在1×PBS中保存，可存放长达两周。
      注意：背景自发荧光随时间延长而增强。
  2. 利用CRISPR或TALEN进行突变诱导的诊断性PCR/酶切基因分型——最佳操作时间为受精后2天
    1. 使用移液管将10个已注射的胚胎（2 dpf，仍处于卵膜内）转移至12孔PCR条状管的前10个孔中，将未注射的对照组鱼放入最后两孔。
    2. 去除多余的刺鱼培养用水。
    3. 添加 50 µl 裂解缓冲液（10 mM Tris pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂）2，0.3% Tween-20 和 0.3% NP-40）加入每个孔中。
    4. 将管盖盖好，置于指定条件下孵育 95 °C 在PCR仪中孵育20分钟。
      注意：煮沸步骤后，蛋黄会变为白色且呈橡胶状。
    5. 移除盖子，并使用另一个洁净的 1,000 µl 用移液器吸头在每根试管中研磨胚胎。
      注意：白色碎屑将积聚在管底。
    6. 添加 2.5 µl 每孔加入 10 mg/ml 蛋白酶 K。
    7. 更换盖子并在指定条件下孵育 55 °C 消化蛋白质1小时，随后 95 °C 20分钟以灭活蛋白酶K。储存于-80℃。20 °C 以避免霉菌生长。
    8. 使用高保真聚合酶按照制造商说明书进行PCR扩增，以胚胎裂解液作为DNA模板。
      注意：吸取试管上层液体作为DNA模板时，需小心操作，避免吸到管底可见的卵壳膜或卵黄碎片。
    9. 将PCR产物与等体积的限制性内切酶预混液混合，预混液包含1x酶特异性缓冲液和 0.25 µl 每份样品加入相应的酶。务必保留一半未切割的PCR产物，用于琼脂糖凝胶电泳检测，以确认PCR产物的大小符合预期。将PCR产物与酶混合后，在限制性内切酶所需的适宜条件下进行孵育。
      注意：某些酶可能需要不同的酶缓冲液与PCR产物比例；若未注射的对照组未显示完全消化，则应调整缓冲液浓度。
    10. 消化完成后，将产物与DNA分子量标记物一同在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物大小符合预期。
      注：注射胚胎中未切割的条带表明存在分子损伤（图6）和未注射的对照组必须完全消化，以正确解读实验结果。
    11. 为确认突变位点，从琼脂糖凝胶中切下未切割的条带，并使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。采用Sanger测序法对产物进行测序，建议使用位于PCR引物内部的测序引物，以确认突变位点。在F0 注射后的胚胎中，可能会出现多种突变并存的情况，导致目标位点附近的Sanger测序结果质量下降。
    12. 为获得稳定品系，保存所有经检测显示分子损伤呈阳性的注射胚胎。将鱼体培育至性成熟后进行杂交，随后对部分F1 按照步骤6.2.1至6.2.11所述，对胚胎进行分子缺陷检测。若鉴定出杂合子携带者，则继续培养剩余的F1 从胚胎培育至成体，并利用尾鳍组织提取的DNA鉴定杂合个体。

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结果

对于具有增强子活性的报告基因转基因，成功注射将导致转基因在特定细胞中表达（图4A，4C）。注射后的鱼可与野生型鱼杂交，以建立稳定品系（BAC稳定品系示例如图4B所示）。将DNA注射到刺鱼胚胎中通常比单独注射RNA导致更高的致死率。注射Tol2报告基因构建体后，通常会观察到高达50%（有时甚至更高）的胚胎死亡或畸形（见图4D-F，4I），这与先前描述的巨核酸酶方法21类似。然而，结果会因具体构建体、胚胎形态以及操作者技术水平而有较大差异。对于具有活性的增强子，通常有40–50%的胚胎会表现出组织特异性转基因表达，例如在中鳍和胸鳍中（图5）。背景荧光及非特异性荧光（图4G-I）的程度因所用启动子的不同而差异显著；斑马鱼hsp70l启动子...

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讨论

对三刺鱼胚胎进行单细胞显微注射以实现转基因或基因组编辑时，主要面临三个挑战。首先，与斑马鱼胚胎相比，三刺鱼胚胎的卵膜较为坚韧，常常导致注射针头断裂。该问题可通过使用更粗、更坚固的玻璃毛细注射针，并以垂直于卵膜的角度进行注射来部分解决（参见实验方案，图2）。确保加入胚胎的水量尽可能少（仅需使卵膜膨胀并脱离细胞即可），有助于降低卵膜硬度。卵膜会随着时间推移而逐渐硬化，因此在湿润胚胎后应尽快完成操作。在注射前将胚胎置于湿度恒定的培养环境中，防止其干燥，也至关重要。某些卵块甚至个别胚胎的卵膜天然更厚更坚韧；此时，跳过当前胚胎或更换另一批卵块可能是最简便的解决方案。与其更换损坏的针头，不如直接跳过一个难以注射的胚胎更为高效。准备备用针头可在针头断裂时确保注射持续进行。在注射BAC（细菌人工染色体）时，针头常会发生堵塞。此时可通过镊子轻轻刮擦或重新折断针尖，或使用恒定气压开关冲洗针道，以清除堵塞物。

其次，识别胚胎中的第一个细胞具有挑战性；该细胞通常非常扁平，初学者很难观察到，尤其是直接观察时尤其难以看见。通常只能从侧面看到卵裂球呈现为略微隆起的小突起。因此，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 #DE021475（CTM）、NIH 预博培训基金 5T32GM007127（PAE）以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（NAE）资助。我们感谢 Kevin Schwalbach 进行 BAC 重组工程和显微注射操作，Nick Donde 提供 CRISPR Sanger 测序数据，以及 Katherine Lipari 对注射方案提出的有益反馈。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带透射照明的体视显微镜LeicaS6e/ KL300 LED
手动显微操作器Applied Scientific InstrumentationMM33Marzhauser M33 显微操作器
压力注射系统Applied Scientific InstrumentationMPPI-3
背压单元Applied Scientific InstrumentationBPU
微量移液器固定夹具套装Applied Scientific InstrumentationMPIP
磁性底座夹具Applied Scientific InstrumentationMagnetic base
脚踏开关Applied Scientific InstrumentationFSW
铁板（磁性底座）NarishigeIP
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-97
一次性转移移液管Fisher13-711-7M
DPBS 中的 0.5% 酚红Sigma P0290注射示踪剂
#5 镊子，biologie dumoxel Fine Science Tools11252-30用于折断针头
微量移液器储存罐World Precision InstrumentsE210用于存放针头
6"，每英寸6齿的石膏板锯Lenox20571 (S636RP)用于固定卵进行注射
13 cm x 13 cm 玻璃板任意五金商店-
硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.0 mm/内径0.58 mm World Precision Instruments1B100-F4*比斑马鱼注射用毛细管更硬的玻璃
150 x 15 mm 培养皿FisherFB0875714用于三刺鱼胚胎培养
35 mm × 10 mm 培养皿Fisher08-757-100A用于注射前储存卵
Instant Ocean 海盐Instant OceanSS15-10
碳酸氢钠SigmaS5761-500G
三卡因甲磺酸盐/MS-222Western Chemical IncMS222鱼类麻醉/安乐死剂
Sp6 转录试剂盒AmbionAM1340用于TALENs和转座酶mRNA的体外转录
RNeasy 纯化试剂盒Qiagen74104纯化转座酶或TALEN RNA
QiaQuick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104用于纯化注射用质粒
蛋白酶K 20 mg/mlAmbionAM2546用于DNA制备
Nucleobond BAC 100 试剂盒Clontech740579用于BAC DNA制备
NotINEBR0189L
Phusion 聚合酶FisherF-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi 试剂盒Qiagen12943含内毒素冲洗缓冲液
QIAQuick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704 用于测序诱导突变
苯酚:氯仿:异戊醇SigmaP2069-100ML
乙酸钠SigmaS2889-250G
乙醇（分子生物学级）SigmaE7023-500ML
琼脂糖SigmaA9539
50x Tris-乙酸-EDTA 缓冲液ThermoFisherB49
0.5-10 Kb RNA 标准品ThermoFisher15623-200
Nanodrop  分光光度计Thermo ScientificNanodrop 2000
多聚甲醛Sigma158127-500G
10x PBSThermoFisher70011-044
1 kb Plus DNA 标准品ThermoFisher10787-018
氯化钾SigmaP9541-500G
氯化镁SigmaM8266-100G
NP-40ThermoFisher28324
Tween 20SigmaP1379-500ML
Tris pH 8.3TeknovaT1083
12联排PCR管Thermo ScientificAB-1113

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Tol2 TALEN CRISPR

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