鳃部骨骼，包括鳃耙、咽齿和鳃弓骨，在大多数鱼类中是食物处理的主要部位。本文介绍了一种用于解剖并平铺三刺棘背鱼内部骨骼的方法。该方法同样适用于多种其他鱼类物种。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
脊椎动物头部的咽后节段发育形成鳃弓骨骼，这是鱼类食物处理的主要部位。鱼类鳃弓骨骼的形态与其物种的食性相适应。三刺棘背鱼（Gasterosteus aculeatus）已成为研究多种性状进化差异的遗传与发育基础的模式系统。棘背鱼的海洋种群已多次迁入大量新的淡水湖泊和溪流。在这些淡水环境中对新食性的适应，可能是导致多个独立演化的淡水种群中反复出现一系列颅面结构变化的原因。这些变化主要包括鳃弓骨骼的三种主要模式改变：鳃耙骨的数量和长度减少、咽部牙齿数量增加，以及鳃弓骨长度增加。本文详细描述了一种用于解剖并平铺三刺棘背鱼内部鳃弓骨骼的实验方案。将整个三维结构的鳃弓骨骼完整解剖并平展为近二维制备样品，可方便地观察和量化鳃弓骨骼的形态。该解剖方法成本低、速度快、相对简便，且适用于多种鱼类。在棘背鱼中，这一高效方法可用于遗传杂交后代骨骼形态的量化分析，进而定位控制颅面模式形成的基因组区域。
引言
在脊椎动物中，尤其是鱼类之间，头部骨骼存在极为丰富的多样性。在许多情况下，这种多样性有助于不同的摄食策略1-4，并可能涉及颅面结构在外部和内部模式上的重大改变。鳃部骨骼位于鱼类咽喉内部，环绕大部分口腔腔体。鳃部骨骼由5个依次同源的节段组成，其中前四个节段支撑着鳃。这五个节段共同发挥着鱼类与其食物之间相互作用界面的功能5。包括鳃耙、咽齿和鳃部骨骼在内的多种性状的变异，有助于鱼类高效地觅食不同种类的食物。
刺鱼在其海洋祖先迁移到北半球各地的淡水湖泊和溪流后，经历了适应性辐射。其食性从海洋中的小型浮游动物转变为淡水中的较大猎物，导致多种头骨面部特征发生显著的营养性变异6。尽管已有许多研究集中于刺鱼外部头骨面部差异7-13，但重要的头骨面部变化也反复出现在内部鳃部骨骼中。形态差异显著的刺鱼种群之间能够产生可育杂交后代，这为定位鳃部骨骼进化改变的遗传基础提供了极佳的研究机会。
一个具有重要生态意义的营养性状是鳃耙的排列模式，鳃耙是成对分布于鳃弓前后缘的周期性真皮骨，用于滤食猎物。通常以小型猎物为食的鱼类，其鳃耙往往比以较大猎物为食的鱼类更长且间距更密集14,15。种内和种间均已有报道显示鳃耙存在变异14–19，而鳃....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有鱼类实验均经加州大学伯克利分校机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 R330）。安乐死采用浸入含 0.1% 碳酸氢钠缓冲的 0.025% 三卡因-S 溶液进行39。所有步骤均在室温下进行。
1. 准备
注意：步骤 1.1–1.5 需在可严密封口并能水平放置的锥形管或闪烁瓶中进行。鱼类样本无需持续震荡，但应通过轻柔地倒置或晃动试管架/小瓶，尽可能频繁地混合溶液，使鱼体各面均能接触染色液，从而确保染料均匀渗透组织。切勿将大量鱼类样本置于平台摇床上震荡，因为液体的重量过大会导致摇床损坏。
- 使用10%中性缓冲福尔马林（NBF）对新鲜处死的鱼类或保存在乙醇中的鱼类进行固定，固定过夜。或者，可使用4%多聚甲醛溶于1× PBS溶液代替10% NBF。
注意：若需提取DNA，应在固定前剪取少量尾鳍或胸鳍组织，并保存于乙醇中。 - 在通风橱中妥善处理固定液，随后用自来水（pH约7.0）浸泡2小时。避免使用去离子水，因其常呈酸性，可能导致骨骼脱钙。
- 将鱼类移出固定液，用含1% KOH的0.008%茜素红S水溶液染色24小时。对于标准长度小于20 mm的鱼类，使用0.004%茜素红S。（可先配制100倍浓缩液（0.8%）茜素红S，使用时再稀释）。
- 移除染色液（倒入通风橱内的适当废液容器中），将鱼类转入自来水中浸泡数小时。根据需要更换水，直至洗液基本澄清。
- 移除水后，将鱼类放入含50%甘油和....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本实验方案可获得解剖后平铺固定的鳃部骨骼（图4），便于对多种重要的摄食相关性状进行量化分析。从背侧观察，所有鳃耙列、咽齿板以及几乎所有的鳃弓骨骼均可清晰识别并量化22-24,35,36,38,42。茜素红S在罗丹明或类似的红色滤光片下亦可产生荧光，因此可与其他标记物（例如，转基因GFP42）进行双重标记，并提供另一种可视化方法。荧光在光照下会迅速褪去，因此若计划进行荧光成像或表型分析，应将样品避光保存。从腹侧观察，可清晰看到鳃组织，并可对其色素沉积进行量化分析43。样品可长期保存于100%甘油中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
鳃弓骨骼是鱼类咽喉内一组复杂的骨骼结构，在食物进入食道的过程中起到操控、过滤和研磨的作用。许多有趣的摄食相关性状，如鳃耙的排列模式、咽齿以及鳃弓骨骼的形态，在不同物种之间乃至同一物种内部均存在变异。对于这些性状中的大多数而言，若以完整的鳃弓骨骼进行测量，准确测定极为困难甚至几乎无法实现。 原位 (例如，鳃耙长度，鳃弓骨长度）。该平铺式制备方法可将所有鳃部骨骼结构置于一个简单的二维平面中，便于对多个性状进行成像和量化分析。
本方案的一个局限性在于，尽管在此种平铺的二维制备样本中，牙齿、鳃耙以及大多数软骨内骨骼可以轻松成像并定量，但第二至第四上鳃骨由于具有更强的三维结构，难以清晰观察，需要额外解剖才能准确测量。本方案的第二个局限性是该方法对鱼头具有轻微破坏性。然而，仅有两个骨骼会受到损伤，每个骨骼仅被切割一次，即副蝶骨和额骨。所有其他颅面骨骼结构均可在后续时间点重新取出并进行测量。
该实验方案虽然最初是为刺鱼开发的，但也可用于许多其他鱼类物种，尽管有时需要进行修改。例如，某些鱼类（如斑马鱼）具.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 #DE021475 基金（资助 CTM）以及美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（资助 NAE）提供支持。感谢 Miles Johnson 在成像方面的协助，以及 Priscilla Erickson 对稿件的审阅。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氢氧化钾 (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7893-4L | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
| 茜素红 S | EMD | AX0485-3 | |
| 显微镜盖玻片 22 mm × 60 mm | VWR | 16004-350 | |
| 100 mm × 10 mm 玻璃培养皿 | Kimble Chase | 23064-10010 | 用于样品解剖 |
| Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | 可倒入玻璃或塑料培养皿中以制作解剖板 |
| 油灰模型黏土 | Sargent Art | 22-4000 | 1 磅，乳白色 |
| 闪烁瓶（每箱 500 个） | Wheaton | 986586 | 硼硅酸盐玻璃，带螺旋盖 |
| 镊子-Dumont #5 Inox（生物学尖头） | FST | 11252-20 | Dumostars 可作为替代品 |
| 解剖剪 | FST | 15003-08 | 可根据样品大小选择其他尺寸 |
| 体视显微镜 | Leica | S6E 配 KL300 LED | 其他多种型号也可使用，具有平坦底座者更佳 |
| 微量离心管 1.7 ml | Denville | C2170 | |
| 纸板载玻片托盘 | Fisher | 12-587-10 |
参考文献
- Cooper, W. J., Westneat, M. W. Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches. BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).
- Albertson, R. C., Kocher, T. D. Genetic and developmental basis of cichlid t....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
