需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca2+的敏感性

9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54057

⸱

2016年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 2Yan Bian University Hospital, 3Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于评估大鼠心脏分离心肌细胞在收缩过程中肌丝对Ca2+敏感性变化的实验方案。该检测方法结合心脏电生理学、收缩期/舒张期胞质Ca2+水平以及收缩/舒张功能，对于揭示健康与病变心脏中心肌兴奋-收缩耦联机制具有重要意义。

摘要

心力衰竭和心脏心律失常是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。然而，病变心脏中病理发生机制及心肌功能障碍仍未完全阐明。近年来强有力的证据表明，肌丝对Ca2+敏感性的改变会影响心肌细胞内Ca2+稳态以及离子通道活性，而这些正是健康与病变心脏中产生心脏动作电位和收缩功能的核心机制。事实上，通常通过检测介导心脏动作电位的离子通道和转运体活性（例如，Na+、Ca2+和K+通道以及Na+-Ca2+交换体）以及细胞内Ca2+调控蛋白（例如，兰尼碱受体、肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA2a）、磷胶蛋白及其磷酸化状态）来评估心肌兴奋-收缩（E-C）耦联的基本机制。细胞膜上的电活动与细胞内Ca2+变化是E-C耦联的触发信号，而肌丝则是收缩与舒张的功能单位，肌丝对Ca2+的敏感性在肌原纤维功能实现中至关重要。然而，除非研究重点即为此，否则极少有研究在心肌功能分析中纳入肌丝Ca2+敏感性的评估。本文介绍一种通过Fura-2 AM（比率检测法）测量大鼠心脏心肌细胞中肌节缩短/再伸长及细胞内Ca2+水平，并评估肌丝Ca2+敏感性变化的实验方案。主要目的在于强调，在进行机制性分析时，应将肌丝Ca2+敏感性纳入E-C耦联的研究范畴。全面探究健康与病变心脏中心肌细胞收缩力背后的离子通道、离子转运体、细胞内Ca2+调控以及肌丝Ca2+敏感性，将为设计更具转化意义和治疗价值的干预策略提供重要信息。

引言

心脏兴奋-收缩（E-C）耦联是分析心肌机械特性的基本方案， 即， 心脏的收缩功能1,2. E-C 耦联由肌膜离子通道活动引起的膜去极化所启动（例如， 电压门控Na+ 通道，可进行测量 通过 膜片钳技术）。随后激活电压门控L型Ca2+ 通道（LTCCs）和Ca2+ 流入 通过 LTCCs 触发大部分 Ca2+ 通过兰尼碱受体（RyRs）释放，增加胞质 Ca2+ 从纳摩尔（nM）到微摩尔（µM）浓度水平。这种细胞质 Ca²⁺ 浓度的升高2+ 促进 Ca2+ 与细丝中的肌钙蛋白C（TnC）结合，引发肌丝复合物的构象改变，促进肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用，从而实现心肌收缩3. 相反，细胞质中的 Ca2+ 被重新摄取 回到肌浆网（SR）中，通过 Ca2+-ATP酶（SERCA2a）在肌质网（SR）中，或被排出心肌细胞外 通过 Na+/Ca2+ 交换体和质膜Ca2+ ATP酶1,2因此，胞质中 Ca2+ 引发细丝构象恢复至原始状态，导致肌动蛋白-肌球蛋白解离及心肌细胞舒张1-3在此机制中，SERCA2a 的活性通常被认为决定了心肌舒张的速度，因为它介导了胞质中 70 - 90% 的 Ca²⁺2+ 大多数哺乳动物心肌细胞中的去除1因此，异常的 Ca2+ LTCC、RyR 和 SERCA2a 等对钙离子的调控已被认为是病变心脏收缩和舒张功能受损的主要机制1-4.

实际上，游离的胞质 Ca2+ 在兴奋-收缩耦联中作为信使发挥作用的细胞内钙约占总细胞内钙的1%2+ 以及大多数Ca2+ 与细胞内 Ca 结合2+ 缓冲液5,6。这是由于不同的Ca2+ 缓冲液在心肌细胞中含量丰富， 例如， 膜磷脂、ATP、磷酸肌酸、钙调蛋白、副肌球蛋白、肌原纤维肌钙蛋白C、肌球蛋白、肌浆网钙泵2a（SERCA2a）以及肌质网中的钙结合蛋白（calsequestrin）。5,6,7其中，SERCA2a 和 TnC 是主要的 Ca2+ 缓冲液5,6,7。此外，Ca2+ 在抽搐过程中，与缓冲液的结合是一个动态过程例如， 30-50% 的 Ca2+ 与肌钙蛋白C（TnC）结合，并在Ca²⁺存在下与其解离2+ 瞬时表达7）以及Ca的变化2+ 结合导致额外 "释放" 游离 Ca2+ 进入细胞质后，导致细胞内 Ca 的改变2+ 浓度。因此，细胞内 Ca 的扰动2+ 水平升高会引发肌丝异常运动，这是收缩功能障碍和心律失常的前兆8,9许多因素（包括生理性和病理性因素）均可导致肌丝蛋白的转录后修饰，从而影响肌丝对钙离子的敏感性2+ 缓冲与肌丝钙2+ 灵敏度8-10最近有报道称，肌丝蛋白的突变会增加钙离子敏感性2+ 结合亲和力和细胞内 Ca2+ 处理，触发依赖于暂停的钙离子增强效应2+ 瞬变，异常Ca2+ 释放，以及心律失常8。与此概念一致，我们也已证明肌丝钙离子2+ 高血压大鼠心脏中由于神经元型一氧化氮合酶上调所致的去敏感化与舒张期和收缩期钙离子水平升高相关2+ 水平11，进而增加LTCC对Ca的易损性2+依赖性失活12因此，肌丝Ca2+ 敏感性是一种 "活性" 细胞内钙调节因子2+ 稳态与心肌细胞收缩功能。分析肌丝与钙离子之间的相互作用已变得十分必要2+ 处理蛋白质以深入研究心肌细胞的兴奋-收缩耦联及心脏功能。

在此，我们描述了一种用于评估肌丝钙敏感性变化的实验方案。该方法通过分离心肌纤维并测定其在不同钙离子浓度下的收缩力，以分析肌丝对钙离子的响应特性。该技术可用于研究心力衰竭、心肌病及其他影响心肌收缩功能的病理状态下肌丝功能的改变。2+ 分离心肌细胞中的敏感性。综合分析 细胞内 Ca2+ 谱型，肌丝钙2+ 敏感性和收缩性将揭示心肌力学的新型潜在机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案遵循联合国国立卫生研究院（NIH出版物第85-23号，1996年修订版）发布的《实验动物护理与使用指南》，并已获得首尔国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（IACUC批准编号：SNU-101213-1）。

1. 缓冲液制备（见材料与设备表）

  1. 在实验当天配制 300 ml 新鲜分离液（单位：mM：NaCl 135；KCl 5.4；MgCl2 3.5；葡萄糖 5；HEPES 5；Na2HPO4 0.4；牛磺酸 20；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
  2. 在实验当天配制 100 ml 新鲜保存液（单位：mM：NaCl 120；KCl 5.4；MgSO4 5；CaCl2 0.2；丙酮酸钠 5；葡萄糖 5.5；牛磺酸 20；HEPES 10；甘露醇 29；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
  3. 配制 1 L 灌流液（单位：mM：NaCl 141.4；KCl 4；NaH2PO4 0.33；MgCl2 1；HEPES 10；葡萄糖 5.5；CaCl2 1.8；甘露醇 14.5；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
  4. 向 25 ml 分离液中加入胶原酶（1 mg/ml）、蛋白酶（0.1 mg/ml）、牛血清白蛋白（BSA，1.67 mg/ml）和 Ca2+（0.05 mM），配制成 30 ml 胶原酶溶液 1。
  5. 向 16.7 ml 分离液中加入胶原酶（1 mg/ml）、BSA（1.67 mg/ml）和 Ca2+（0.05 mM），配制成 20 ml 胶原酶溶液 2。
  6. 将 0.4 g BSA 加入 40 ml 分离液中，配制成 BSA 溶液。将该溶液分装至两个烧杯中，分别为 10 ml 和 30 ml。向 30 ml BSA 溶液中加入 Ca2+，使 BSA 溶液中 Ca2+ 的终浓度为 1 mM。

2. 左心室（LV）心肌细胞分离的准备工作

  1. 将8至12周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠转移至清洁的运输笼中，从动物饲养室运送至制备与分离室。
  2. 将两个水浴加热至37 o C.
    注意：使用一个水浴锅为Langendorff灌流系统的水套式储液器和灌流管路提供恒温环境。使用另一个水浴锅振荡心肌组织块，以分离单个心肌细胞。
  3. 加入5 ml和3.3 ml的BSA溶液（不含Ca2+将胶原酶溶液1加至25 ml，胶原酶溶液2加至16.7 ml，分别定容至30 ml和20 ml。
  4. 向Langendorff灌流系统的1号柱（Col. 1）和2号柱（Col. 2）分别加入分离液（100 ml）和胶原酶溶液1（30 ml）图1A).
  5. 在第1列和第2列中对分离溶液和胶原酶溶液1进行氧合 通过 Langendorff 灌流系统中的氧气连接管图1A）。类似地，在振荡水浴中用100% O₂预充氧胶原酶溶液2和BSA溶液2 通过 氧气连接管

3. LV 心肌细胞的分离

  1. 麻醉一只SD大鼠 通过 腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg），并通过脚趾夹捏无回缩反射来确认麻醉状态。
  2. 将大鼠移至解剖托盘中，仰卧位，用胶带将四肢固定在身体两侧。
  3. 用手术剪在胸部腋中线处做切口以打开胸腔，注意避免损伤心脏。使用另一把干净的手术剪将心脏从相连的血管处分离。例如， 上腔静脉和下腔静脉、肺血管、主动脉以及心包膜13.
  4. 保留足够长度（5 - 8 mm）的一段主动脉，用精细镊子夹住主动脉，并在1分钟内迅速将Langendorff灌流系统的套管插入并固定图1A用4/0缝合线在主动脉上打紧结。
  5. 打开第1列的阀门，用预热并充氧的分离溶液以12-14 ml/min的灌流速率灌注离体心脏10分钟。关闭第1列的阀门，打开第2列的阀门，用胶原酶溶液1灌注心脏8-10分钟。
  6. 用镊子夹住主动脉，剪断后取下已消化的心脏，并将其转移至含有新鲜分离溶液的烧瓶中（图1Bi）。使用精细剪刀和镊子将左心室游离壁（包括室间隔）的大部分组织剪成较小的片段（约22 mm， 图1Bii).
  7. 将组织块转移至含有预热且充氧的新鲜胶原酶溶液2的烧瓶中图1Biii）。振荡10分钟。持续向含有心肌细胞的胶原酶溶液中通入氧气2。
  8. 使用带吸球的滴管将心肌细胞悬液转移至10 ml离心管中，并加入Ca2+ - 加入等体积含牛血清白蛋白（BSA）的溶液，30 g 离心 2 分钟，弃上清液。将心肌细胞沉淀重悬于 5 ml BSA 溶液中，离心后弃去上清液。
  9. 重悬心肌细胞沉淀，并将心肌细胞置于10 ml预充氧的保存液中，在室温下保存（RT）图1Biv-vi).
  10. 用烧瓶中剩余的左心室组织重复上述步骤（步骤 3.7 - 3.9）。
    注意：重复步骤 3.7 至 3.9，直至大部分 LV 组织消失，以获得较大量的心肌细胞。
  11. 将心肌细胞置于储存液中，在室温下保存6-8小时，直至实验结束。

4. 同时测量细胞内 Ca2+ 瞬变和心肌细胞收缩

  1. 用乙酰甲酯Fura-2 AM（2 µM）负载LV心肌细胞。
    注意：所有负载操作及对已负载心肌细胞的实验均需在避光试管中进行（图1Bvii）。
    1. 将心肌细胞悬液（1 ml）在2,000 × g下离心10秒。弃去上清液，并将心肌细胞沉淀重悬于1 ml低Ca2+浓度（250 µM，见材料与设备表）的Tyrode溶液中。
    2. 加入Fura-2AM和泊洛沙姆407（2 µl），轻轻混匀心肌细胞悬液，并在室温（20 - 24o C）下孵育15分钟 （图1Bvii）。
    3. 将混合液离心5秒，弃去上清液，并将心肌细胞沉淀分散于含500 µM Ca2+的1 ml灌流液中。10分钟后，再次离心5秒并弃去上清液。
    4. 加入新鲜灌流液（含500 µM Ca2+，1 ml），并将负载了Fura-2AM的心肌细胞沉淀保存在此溶液中用于记录。
  2. LV心肌细胞收缩及细胞内Ca2+的测量
    1. 记录前，将预热至36 o C的Tyrode溶液注入穿过水浴夹套的灌流管中。
    2. 取数滴已负载Fura-2 AM的LV心肌细胞悬液滴加至倒置荧光显微镜的样品室中，静置5 - 8分钟。以2.2 ml/min的速度缓慢灌流Tyrode溶液。
    3. 按下数字刺激器前面板上的"开始"按钮，启动场刺激（2 Hz）。
      注意：输出电压（10 V，持续时间5毫秒）通过位于样品室两侧的铂丝电极施加于样品室中的心肌细胞。
      1. 选择收缩稳定的心肌细胞（排除过度收缩或收缩不足的细胞）进行记录。
    4. 调整目标心肌细胞在基于视频的肌节检测系统中的水平位置，并调节显微镜焦距，以获得清晰的肌节图像。将紫色矩形框置于肌节清晰可见的区域，直至肌节长度平均值（红色峰）呈现单一尖锐峰形（图2A，下图）。
    5. 记录心肌细胞在场刺激下肌节长度的变化（图2A和B）。
      注意：负载后的心肌细胞应在1 - 2小时内使用。
    6. 调节相机光圈，使基于视频的肌节检测系统中的视野大小与心肌细胞相匹配（图2A）。以360 nm/380 nm激发、510 nm发射（采集频率1,000 Hz）对心肌细胞进行刺激，并同步记录肌节缩短程度及Fura-2 AM荧光比值（图2B）。

5. 肌原纤维Ca2+敏感性的评估

  1. 平均肌节长度和Ca2+ 稳态下的瞬变信号（10–20 次扫描），绘制 Fura-2 比值的相平面环路 与 同一心肌细胞的肌节长度（包括测量值和变化量）； 图 2C).
  2. 在每个图中，定义Fura-2比值在50%松弛时的值（EC50, 图2C）。比较环状结构和EC50 每种干预措施

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

从正常和高血压大鼠心脏中分离左心室心肌细胞。选择具有清晰横纹（代表肌节）且在电场刺激下能产生稳定收缩的杆状心肌细胞作为理想细胞用于记录图2A）。在图F所示的示例中图2A将负载Fura 2 AM的左心室心肌细胞水平放置，并调节相机光圈，使心肌细胞占据记录视野的大部分区域，同时尽量减少背景区域的纳入。在记录视野中，通过计算机屏幕上的记录程序点击并拖动紫色方框，调整其尺寸。当平均肌节长度显示为一个清晰的红色峰时，开始记录图2A，下图）。

在同一心肌细胞中同时记录肌节长度和细胞内Ca2+瞬变（Fura-2比值）（图3A）。肌节长度和Ca2+瞬变的平均轨迹如图3B所示。分别测量舒张期/收缩期肌节长度、达峰时间（PT）和肌节缩短程度，以评估心肌细胞收缩功...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

此处，我们描述了评估肌丝钙敏感性变化的实验方案，以及在分离的肌纤维中测量ATP酶活性的方法。2+ 单个分离心肌细胞中的敏感性，并强调在测量电生理特性、细胞内Ca的同时，检测该参数的重要性2+ 瞬变过程以及肌丝动力学。这是因为仅记录其中一个或两个参数可能无法阐明心肌收缩和舒张的潜在机制。与仅测量心肌细胞收缩和细胞内Ca2+ 单独分析每个样本1, 本方法在同一批心肌细胞中同时检测这两个参数.

通常采用多种方法来评估肌丝对钙离子的敏感性2+ 肌肉或肌细胞的敏感性15,16,17, 例如， 外源性Ca相互作用的检测2+ 以及去膜心肌细胞（经皂苷或β-伊辛等去污剂处理以通透细胞膜）中肌节/细胞长度/张力的测量。长度通过光电二极管与激光束衍射技术测定，张力则使用力传感器或碳纤维测定。这些技术在肌肉研究中被广泛应用，因其可实现肌丝对钙离子反应的定量评估2+ 灵敏度。然而，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国教育科技部资助的基础科学研究中心项目（2013068067）；韩国教育科技部脑科学BK21研究生项目、首尔国立大学医院、韩国高血压学会（2013）、SK电信研究基金（编号3420130290）以及国家自然科学基金委员会（NSFC 31460265；NSFC 81260035）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sprague Dawley 大鼠Koatech8-12 周
戊巴比妥钠韩国韩林制药公司AHN901保险代码：645301220
NaClSigmaS9625
KClSigmaP4504
NaH2PO4SigmaS8282
HEPESSigmaH3375
葡萄糖SigmaG8270
CaCl2BiosesangC2002
MgCl₂2BiosesangM2001
甘露醇SigmaM4125
MgSO₄4SigmaM5921
丙酮酸钠SigmaP2256
牛磺酸默克8.08616.1000
Na2HPO4 Sigma71649
牛胎盘白蛋白SigmaA7906
II型胶原酶沃辛顿LS004177
蛋白酶SigmaP6911
Fura-2 (AM)分子探针F1221
DMSO 中 20% Pluronic F127 溶液InvitrogenP3000MP
振荡水浴箱张 Shin 科学型号：C-108
IonWizard 软件套件IonOptix Ltd实验设计工具心肌细胞中兴奋-收缩耦合数据的采集与分析
心肌细胞钙 && 收缩力记录系统IonOptix Ltd
循环水浴BS-TechBW2-8
心肌细胞荧光显微镜尼康DIATPHOTO 200
MyoCam-S 功率IonOptix
荧光 &和视频检测IonOptixMyoCam-S
CFA300
PMT400
荧光 &和系统接口IonOptixFSI700
激发光源IonOptixmSTEP
高强度ARC灯电源供应器凯恩研究
滤光轮控制器IonOptixGB/MUS200
数字刺激器Medical Systems CorporationS-98 多模式
<强>实验溶液的组成
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
分离液（pH：7.4，NaOH）
NaClSigmaS9625浓度（mmol）135
KClSigmaP4504浓度（mmol）5.4
HEPESSigmaH3375浓度（mmol）5
葡萄糖SigmaG8270浓度（mmol）5
MgCl₂2BiosesangM2001浓度（mmol）3.5
牛磺酸SigmaCB2742654浓度（mmol）20
Na2HPO4 Sigma71649浓度（mmol）0.4
储存溶液（pH：7.4，NaOH）
NaClSigmaS9625浓度（mmol）120
KClSigmaP4504浓度（mmol）5.4
HEPESSigmaH3375浓度（mmol）10
葡萄糖SigmaG8270浓度（mmol）5.5
CaCl2BiosesangC2002浓度（mmol）0.2
甘露醇SigmaM4125浓度（mmol）29
MgSO₄4SigmaM5921浓度（mmol）5
丙酮酸钠SigmaP2256浓度（mmol）5
牛磺酸SigmaCB2742654浓度（mmol）20
灌流液（Tyrode 溶液，pH：7.4，NaOH）
NaClSigmaS9625浓度（mmol）141.4
KClSigmaP4504浓度（mmol）4
NaH2PO4SigmaS8282浓度（mmol）0.33
HEPESSigmaH3375浓度（mmol）10
葡萄糖SigmaG8270浓度（mmol）5.5
CaCl2BiosesangC2002浓度（mmol）1.8      Fura 2AM 负载时，CaCl2 浓度分别为 0.25 mM 和 0.5 mM
MgCl₂2BiosesangM2001浓度（mmol）1
甘露醇SigmaM4125浓度（mmol）14.5
胶原酶溶液1
分离液（30 mL）
牛胎血清白蛋白（BSA 溶液 5 ml）浓度（mmol）1.67 mg/mL
II型胶原酶沃辛顿LS004177浓度（mmol）1 mg/mL
蛋白酶SigmaP6911浓度（mmol）0.1 mg/mL
CaCl2BiosesangC2002浓度（mmol）0.05 mM
胶原酶溶液2
分离液（20 mL）
牛胎血清白蛋白（BSA 溶液 3.3 mL）浓度（mmol）1.67 mg/mL
II型胶原酶沃辛顿LS004177浓度（mmol）1 mg/mL
CaCl2BiosesangC2002浓度（mmol）0.05 mM
BSA 溶液
分离液（40 mL）
牛胎血清白蛋白SigmaA7906浓度（mmol）400 mg
CaCl2BiosesangC2002浓度（mmol）1 mM

参考文献

  1. Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  2. Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
  3. Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
  4. Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
  5. Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
  6. Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
  7. Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
  8. Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
  9. Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
  10. Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336(2013).
  11. Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
  12. Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
  15. Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
  16. Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
  17. Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
  18. Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
  19. Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
  20. Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
  21. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  22. Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

Fura 2AM Langendorff
评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca2+的敏感性
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。