研究了用于现场检测小分子的适体-金纳米粒子比色法的设计与开发。此外，验证了一种基于智能设备的比色应用程序（app），并建立了该检测方法的长期储存条件，以满足现场使用需求。
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本文内容
摘要
摘要
本文研究了一种用于现场检测小分子的适体-金纳米颗粒（AuNP）比色分析方法的设计与开发。基于金纳米颗粒的靶标选择性比色检测方法已在受控的概念验证实验室环境中得到开发。然而，这些方案尚未经历极限条件下的失效测试，以评估其在实验室以外实际应用中的可行性。本研究描述了一种通用的方法，用于设计、开发和优化针对小分子分析物的适体-AuNP比色检测体系，并将其应用于现场检测场景。该检测方法的优势在于，吸附的适体能够钝化纳米颗粒表面，从而有效减少甚至消除对非靶标分析物的假阳性响应。为了将该系统转化为实际应用，不仅需要明确适体-AuNP检测体系的保存期限，还需建立延长其长期储存能力的方法与操作流程。此外，比色读数的一个公认问题是，分析人员需准确识别通常较为细微的颜色变化，这带来了较大的判断负担。为减轻现场分析人员的责任，本研究设计了一套颜色分析流程，可在无需使用实验室级别设备的情况下完成颜色识别任务，并详细描述了该数据分析流程的建立与验证方法。然而，为了深入理解并优化吸附型适体检测体系的设计，还需进一步研究适体、靶标分子与AuNPs之间的相互作用。这些研究获得的知识有望用于定制化改造适体，以提升其功能性能。
引言
比色法是分析化学中使用最古老的技术之一。该技术基于生成有色化合物，对分析物进行定性或定量测定1。通常，比色分析使用在分析物存在时发生颜色变化的试剂，从而在可见光谱范围内产生可观察或可检测的颜色变化。比色法已被用于检测从原子、离子和小分子到脱氧核糖核酸（DNA）、肽和蛋白质等复杂生物大分子等多种目标物2-4。在过去的二十年中，纳米材料彻底改变了检测分析领域，尤其是基于颜色的分析方法5-6。将纳米材料独特的化学和物理性质与靶标选择性识别元件（如抗体、寡核苷酸适配体或肽适配体）相结合，推动了比色检测分析方法设计与开发的复兴7。
金属纳米颗粒具有明显的尺寸依赖性颜色变化特性，该特性已被应用于多种比色分析方法的设计中。金纳米颗粒（AuNPs）尤其受到关注，因为当分散的颗粒溶液发生聚集时，溶液会呈现出独特的由红到蓝的颜色转变8，这种聚集通常通过精确加入盐来诱导。通过调控颗粒从分散态（红色）向聚集态（蓝色）的转变，已开发出针对离子、小分子、肽、蛋白质及细胞等目标物的比色传感器2-4,9。这些传感器中的许多都采用适配体作为目标识别元件。
适配体是从包含1012-1015种不同序列的随机文库中筛选出的DNA或核糖核酸（RNA）分子10-11。筛....
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方案
1. 通过柠檬酸盐还原法合成金纳米颗粒（AuNP）及表征
- 在化学安全通风橱中，使用 5 ml 浓硝酸和 15 ml 浓盐酸清洗一个锥形瓶（500 ml）和一个大型搅拌子。
- 用酸洗液润湿锥形瓶的整个内表面，然后用无核酸酶水冲洗锥形瓶，并使其自然干燥。
- 加入 100 ml 的 1 mM 氯金酸（gold(III) chloride）溶液；用铝箔覆盖已酸洗过的锥形瓶口，在加热板上持续搅拌并加热至沸腾。
- 加入 10 ml 的 38.8 mM 柠檬酸钠溶液。溶液颜色将在数分钟内由无色/灰色变为深蓝色/黑色，最终变为深红色。停止加热后继续搅拌 10 分钟。
- 让金纳米颗粒（AuNP）悬浮液冷却至室温，并在持续搅拌下加入 110 µl 焦碳酸二乙酯（DEPC）。
- 用铝箔完全包裹整个锥形瓶，使 DEPC 处理过夜孵育。所有金纳米颗粒均应避光保存，存放于棕色储存容器中或用铝箔包裹。
- 对金纳米颗粒悬浮液进行高压灭菌，冷却至室温后，通过孔径为 0.22 µm 的醋酸纤维素膜过滤。将过滤并灭菌后的金纳米颗粒储备液避光保存于 4 °C。
注意：采用 DEPC 处理、高压灭菌及 4 °C 避光保存可显著延长适配体-金纳米颗粒（aptamer-AuNP）检测体系的保质期。按此方式保存，该检测体系可在两个多月内保持功能稳定。 - 通过测定 520 nm 处的紫外-可....
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结果
本研究的主要目标是开发并考察基于适体的金纳米粒子比色法检测技术的稳定性和鲁棒性，以用于现场检测。正如先前发表的研究中所指出的，已探索了两种不同的方法来构建该检测体系7。这两种检测方法分别被称为游离适体检测法和吸附适体检测法。其中，吸附适体检测法在适用于现场检测方面更具优势（图1）。
图1. 吸附型适配体检测法的示意图。 将适配体与AuNPs混合并过夜孵育；将溶于甲醇中的分析物分子加入吸附型适配体检测体系中，随后立即加入氯化钠（NaCl），以在目标物存在时诱导AuNPs聚集。
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讨论
在过去十年中，基于纳米颗粒的比色检测技术已被开发用于检测小分子、DNA、蛋白质和细胞等目标物2-4。其中，结合DNA适配体与纳米颗粒的检测方法正受到越来越多关注。通常，这类比色检测是先将DNA适配体与待测分析物分子混合，然后再加入金纳米颗粒（AuNPs）中9-10。然而，这些检测方法目前主要局限于概念验证性研究，且多在受控的实验室条件下进行，所用对照有限。近年来，已有研究推动该技术向实际应用转化7。在本方法中，DNA适配体在加入待测分析物分子之前，即被预先吸附到AuNP表面（图1）。无论是哪一种基于适配体–金纳米颗粒的比色检测，其开发过程均需在制备和分析的各个阶段进行优化。因此，初涉该领域的研究人员必须充分了解优化和排除此类检测中各类技术细节的关键要点，以确保实验成功。
吸附型适配体-金纳米颗粒检测方法需要针对每一对适配体/靶标进行仔细优化。然而，按照本文所述步骤操作，可为这类比色检测的优化提供一致的实验方案。其中最关键的优化步骤之一是确定并调整盐浓度，以获得靶标组与检测空白组之间最.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分由美国空军科学研究办公室和国防研究与工程助理部长办公室（国防生物识别与法证办公室）资助。JES 的参与得到了美国国家研究委员会在空军研究实验室设立的研究员协会奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三氯化金水合物 | Sigma | 254169 | 纯度达99.999%至关重要，且溶液需每次新鲜配制 |
| 柠檬酸钠二水合物 | Sigma | W302600-1KG-K | 我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著，且溶液需每次新鲜配制 |
| Synergy | Bio-TEK | HT | 任何吸光度光谱仪均可使用，但酶标仪可实现多样品同步分析 |
| 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液，1 M，已灭菌 | Amresco | J848 | 任何已灭菌品牌均可使用 |
| Corning，250 ml 过滤系统，0.22 µm 醋酸纤维素膜 | Fisher | 430767 | 已发现其他膜材料会去除金纳米颗粒（AuNPs） |
| 紫外-可见分光光度计 | Varian | Cary 300 | 任何吸光度光谱仪均可使用 |
| 氯化镁六水合物 | Fluka | 63068 | ≥98%，任何品牌均可使用 |
| DNA | IDT | 定制 | DNA通过脱盐柱纯化，也可采用更高纯度的纯化技术 |
| 盐酸普鲁卡因 | ACROS | AC20731-1000 | 以甲醇配制1 mg/ml的储备液，纯度99% |
| 盐酸 | Fisher | A144S-500 | 36.5–38.0% w/w，其他品牌亦可使用 |
| 盐酸可卡因 | Lipomed | COC-156-HC-1LM | 我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著 |
| 硝酸 | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w，其他品牌亦可使用 |
| 氯化钠溶液，5 M，生物试剂级 | Sigma | S5150-1L | 使用固体自行配制的无菌溶液亦可使用 |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma | D5758-25 mL | ≥97%，任何品牌均可使用 |
| 甲基麻黄碱盐酸盐 | Lipomed | COC-205-HC-1LM | 我们从与可卡因检测物相同的厂家获得EME对照品 |
| 微量离心管，Axygen Scientific，非无菌，1.7 ml | VWR | 10011-722 | 我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著，且离心管需在实验室自行高压灭菌 |
| 无核酸酶水 | |||
| 甲醇 |
参考文献
- Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G.
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重印与许可
