设计和适体 - 金纳米粒子基于比色法的开发在这领域的应用

摘要

进行了检查适体，纳米金比色法检测小分子在得到了实地应用的设计与开发。此外，一个智能设备色度应用（应用程序）的验证，并建立了在该领域使用的测定法的长期贮存。

摘要

进行了检查适体 - 金纳米粒子（金纳米粒子）比色法检测小分子中的非现场应用的设计与开发。基于目标的选择性金纳米粒子的颜色检测已经发展证明了概念控制的实验室设置。然而，这些方案没有被施加到故障点，以确定其超出实验室设置实际使用。这部作品描述了一个通用的方法来设计，开发和故障排除为小分子分析物和使用试验中，该场设置的适体 - 金纳米粒子比色测定。该测定是有利的，因为吸附适体钝化纳米颗粒表面并提供减少和消除对非靶分析物的假阳性反应的手段。转换该系统的实际应用所需的限定不仅适体 - 金纳米粒子测定的保质期，但是建立延伸长期存储capabil方法和程序伊蒂埃斯。此外，与比色读出公认的问题之一是放置于分析师准确识别颜色往往微妙变化的负担。以减少在现场上分析的责任，颜色分析协议设计为无需进行实验室级装备该任务执行的颜色标识的职责。描述了用于创建和测试数据分析的协议的方法。然而，为了理解和影响吸附的适配体测定法的设计中，与适体，目标相关联的交互，以及金纳米粒子需要进一步研究。所获得的知识可能导致剪裁适体的改进的功能。

引言

比色法是在分析化学中使用的最古老的技术之一。对于这种技术，分析物的定性或定量测定由根据生产的有色化合物^1。通常情况下，颜色测定法使用体验中的分析物质的存在，这将导致在可见光光谱中观察到的或检测的颜色变化的色移的试剂。比色法已在检测的目标，从原子，离子和小分子到复杂的生物分子，如脱氧核糖核酸（DNA）的肽，和蛋白质^2-4这样被使用。在过去的二十年中，纳米材料已经彻底改变了检测分析的领域中，特别是与基于颜色测定^5-6。与靶选择性识别元件结合纳米材料的独特的化学和物理性质，例如抗体，寡核苷酸适体或肽适体，导致了再起我n中的设计和比色检测试验⁷的发展。

金属纳米颗粒具有一个证实大小相关的色彩变化特性，这已在许多比色测定法的设计被利用。金粒子（AuNPs）是特别感兴趣的，由于独特的红至蓝色移，当粒子的分散液被诱导聚合^8，典型地通过精确的加成盐。控制从分散（红色）过渡到聚集的（蓝色）状态的能力已经导致建立比色传感器，用于离子，小分子，肽，蛋白质和细胞靶^2-4,9的。许多这些传感器采用适体作为目标识别基序。

适体是由10 ¹² -10 ^15个不同^的序列^10-11的无规池选择的DNA或核糖核酸（RNA）分子。选择过程确定的目标重新认知元件在低纳摩尔政权结合亲和性，并通过指数富集（SELEX） ​​的配体的系统进化是最公知的过程^12-13。基于寡核苷酸适体用于感测应用的优点包括易于合成的，可控的化学修饰，和化学稳定性^14-15。

一种方法来创建一个比色测定结合纳米材料与识别元件，包括通过DNA适配子分子金纳米粒子表面的物理吸附这两个物种结合。通过目标核酸适体结合，适体经受能改变与金纳米粒子表面，从而导致与加成盐的可诱导的红至蓝颜色响应¹⁹中的适体的相互作用的结构变化^16-18。金纳米粒子的这一惊人的特性提供了一种可观察到的比色反应的机制，可用于脱基于适体的设备签署不同的分析物比色法。

使用上金纳米粒子表面的非共价键，物理吸附的DNA核酸适体设计的彩色测定有被微弱的传感器平台的耻辱由于与稳健性，对未受控实验室环境以外的倾向，以及可用于实际应用的信息缺乏问题设置。然而，基于适体的金纳米粒子比色法是因为操作和观察到的色彩响应的简单的兴趣。这项工作的目的是提供一种用于设计，开发，操作，减少表面的相关的假阳性反应，和长期存储用可卡因为代表分析物DNA的金纳米粒子基于比色测定法提供的协议。此外，我们提出了本吸附适配体测定方法（ 图1）为是有利的，由于使用的简单和易用性，导致比这些适体-金纳米粒子屁股常规方法更少的步骤AYS。对于这个测定法中，适体首先​​被加入到纳米金，这被允许吸附到表面的时间较长。一个附加的优点，以这种方法是响应于与金纳米粒子表面的相互作用的非目标分析物分子的减少。然而，在假阳性反应的减少是在测定灵敏度为代价的。因此，表面保护和辅助分析物之间的平衡是必要保持适当的检测功能。此外，通过对色彩分析的一个重大缺陷是​​指除与仪器是结果往往是主观的和分析师对分析师公开的解释，试图区分颜色的细微差别时尤为如此。反之，有许多与使得基于实验室可用的仪器在实验室外，如电源的可用性，实用性与便携性， 等。在此工作的问题，一个色分析协议是为MOR开发Ë便携性并消除一些通常与基础色法^20-21解释相关的猜测。相比于以前的方法，这一努力争取到这些分析推到他们的实验室之外设置的应用程序的限制。

方案

1.通过金纳米粒子柠檬酸还原（金纳米粒子）与表征合成

1. 清洁的Erlenmeyer烧瓶（500ml）中和大型搅拌棒用5毫升浓硝酸和15毫升浓缩的化学安全罩盐酸。
   1. 湿用酸洗涤烧瓶的整个表面，冲洗用不含核酸酶的水的烧瓶中，并允许烧瓶干燥。
2. 加入100毫升1mM的金（III），氯化;使用铝箔的片材，以覆盖酸清洗Erlenmeyer烧瓶和加热连续搅拌的顶部的热板上直到沸腾。
3. 加入10 mL 38.8毫米柠檬酸钠。颜色由透明/灰在几分钟内改变，深蓝色/黑色，最后暗红色。继续加热搅拌关闭10分钟。
4. 允许金纳米粒子悬浮液冷却至室温，并连续搅拌添加110微升酸二乙酯（DEPC）的。
5. 覆盖整个烧瓶铝箔和允许DEPC处理孵育过夜。存储所有纳米金在黑暗中，在琥珀储存容器或用铝箔覆盖。
6. 高压灭菌的金纳米粒子悬浮液，冷却至室温，并通过0.22μm孔径的醋酸纤维素膜过滤。存储过滤，高压灭菌金纳米粒子库存在黑暗中在4℃下溶液。
   注：治疗用DEPC，通过高压灭菌，并储存在4℃下将改善适体 - 金纳米粒子测定的保质期。存储以这种方式将允许用于测定保持功能为2个月以上。
7. 通过在520nm处获得紫外-可见吸收计算金纳米粒子浓度，并通过计算浓度（c）使用的消光系数（ɛ）2.4×10 ⁸升摩尔^{-1 -1}与Beer定律。测定浓度为10nM的与尺寸为15nm的通过动态光散射来确定。
   注：浓度会有所不同FROM批次到批次。稀释金纳米粒子股用核酸酶游离水作为必要保持所期望的10nM的金纳米粒子的悬浮液。

2. DNA的适体，缓冲液，溶液，和检测制剂

1. 购买或合成以下可卡因结合使用标准亚磷酰胺化学²²适配子序列：
   MN4 ^19：5'-GAC GGC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3'
   MN6 ^19：5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3'
2. 净化使用标准脱盐²³的适体。在任100μM的或1mM的储备溶液重建在不含核酸酶的水的寡核苷酸。分装和储存在-20°C几个月。
3. 购买或制备无菌的1M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH为7.4的股，100毫氯化镁（MgCl ₂的），和1M氯化钠（NaCl）。
4. 制备50ml的缓冲液中在无核酸酶水无线的20mM HEPES，2mM的MgCl ₂的，pH为7.4的第浓度，并储存于室温下个月。
5. 孵育股票金纳米粒子溶液（10纳米）3-4小时，在室温下将DNA和从光保护。根据需要变化，以提供足够的样本为要执行的测试（2.5-7.5毫升）金纳米粒子的体积。
   1. 这里，使用90，120，150，和180的DNA分子/金纳米粒子的装载密度在这项工作。变化的体积，并相应的DNA的浓度。调该DNA的覆盖，以减少非目标分析物的意想不到的金纳米粒子表面的相关色反应。
      注：增加DNA覆盖率将降低检测的灵敏度。装载密度从知道的金纳米粒子的库存的浓度，并计算存在于期望在实验中使用的体积金纳米粒子的总数来计算。如果实际的覆盖密度所需，协议存在以获得这些值^7。该DNA覆盖通过使用50kDa的米确定olecular重量截止旋转柱的金纳米粒子结合的DNA从游离DNA中分离出来。在金纳米粒子太大，通过离心柱，而游离DNA很容易通过。下一步骤是量化使用吸光度测量或单链DNA的荧光染料收集的游离DNA。
6. 加20毫米的HEPES，2mM的MgCl ₂的，pH为7.4的缓冲等体积的，并放置在4℃下将样品在黑暗中过夜。适体-金纳米粒子测定在10mM的HEPES，1mM的MgCl ₂的，pH为7.4（测定缓冲液）。

3.盐滴定法测定设置

1. 确定以诱导由盐滴定与测定空白测定颜色响应所需的初始盐浓度。加入20μl甲醇（空白），以适体 - 金纳米粒子测定的180微升等分试样的在96孔板中。随的库存NaCl溶液（1 M或2M）体积滴定样品，并确定当点（ 图2 注：该测定可以通过保持甲醇空白（或溶解分析物）与适体 - 金纳米粒子测定中相同的比率来缩放到较小体积。
   1. 这里，确定以引起用肉眼观察丝毫颜色变化所需的氯化钠量。该分析的起始浓度为75毫和130毫用于MN4和MN6，分别在60 DNA分子/金纳米粒子覆盖密度。
      注：对于定量测定的初始盐浓度，滴定曲线的中点作为一个很好的起点。另外，使用的浓度将取决于适体，DNA的覆盖密度，从白天到一天的性能，以及批与批。
2. 优化测定法的反应，在室温下加入20微升在甲醇稀释至适体 - 金纳米粒子测定的180微升等分试样的分析物分子的在96孔板中。立即加入在先前步骤中以引发该测定颜色响应中确定的NaCl浓度。
   没有TE：利用多道移液器同时执行多个实验。
3. 获得最大的颜色变化可以通过提高或降低NaCl浓度，并比较目标响应于空白响应。使用NaCl浓度，提供最大的反应差异。
4. 观察或测量以下的NaCl除了测定反应150秒。分析用分光计在650nm和530nm处的吸光度，或获取测定响应（参见照片分析协议第4节）的数码相机照片。
   注：在获得对这项工作的测量用酶标仪。
5. 积的结果作为在650纳米和530纳米（E ₆₅₀ / E _530），为分析物浓度的函数得到的吸光度的比率。正常化测定响应于该空白信号作为在此工作已完成。

4.照片和数字图像色彩分析协议分析

1. PreparË试验样品描述（第3.2-3.3）。放置96孔板上的透射。
   注：标准实验室透射通常是太亮，以获得可用的数字图像进行这种分析。这些透照导致规则间隔的“暗线”出现在数字图象中，由于光源的强度。从发光二极管（LED）基于光盒制作透射和一块不透明的塑料效果很好。
2. 获得在氯化钠添加后150秒时的96孔板的照片，导入图像转换成图像分析软件，并计算平均红色，绿色和蓝色（RGB）值，使用增量平均技术，如公式1 ^24：
   （1）
3. 转换的RGB值，从标准RGB（sRGB的）色空间的色度 ​​图（CIExyY）色空间，使用以下公式^24：
   （2）
   （3）
   （4）
4. 转换的指数RGB值，使用式（2）在方程3中指定的矩阵的线性RGB值被用来计算在X，Y和CIE颜色空间²⁴中的Z值。
5. 计算使用等式4表示选择用于分析²⁴中的区域中的像素的平均颜色的x和y色度值。
6. 执行在每次分析井并绘制色度值以产生校准曲线（ 图4）。通过分析同一孔的不同区域的颜色获得的标准误差。

5.冷冻适配子的金纳米粒子含量为长期储存

1. 如第2.4和2.5的描述准备适体 - 金纳米粒子测定组分。使含有1微克/毫升的海藻糖和1μg/ ml的蔗糖在不含核酸酶的水，使冷冻剂溶液分开的溶液。
   注意：高浓度的海藻糖和蔗糖的用于制备测定冻结时减少稀释因子。热火在电热板上的糖溶液中的水的烧杯中使用前彻底溶解糖。
2. 使包含19.2毫克/毫升海藻糖和在200微升1.5毫升微量离心管的终体积4.8毫克/毫升蔗糖与60 MN4-DNA /金纳米粒子测定的溶液。最后制冷剂的溶液浓度将DNA覆盖率有所不同。
   注：样品被冻结不得超过300微升。较大的体积可能无法正确​​冻结。
3. 闪光灯使用-146℃的冰箱或液氮冷冻的样品。冷冻保存，直到使用样本。存储可在-80℃或-20℃一次冻结闪烁完成。
4. 对于这项工作，在离开样品中的-146℃的冷冻夜，然后转移到-20℃的冷冻长期储存。
   注：闪存冷冻可能导致适体 - 金纳米颗粒聚集。通过监测吸光分布和比较，以解冻样品测试冷冻过程的完整性。如果观察到凝集，提高的冷冻剂溶液的量来弥补这个问题。
5. 解冻样品在室温下，只使用足够的样本所必需的实验。获得解冻的样品的吸收光谱，并比较未冻结的冷冻剂溶液处理的样品的基线光谱。测量吸光度从400nm到700nm的。
6. 执行滴定盐（3.1节），测试分析（3.2节），并绘制结果（第3.3和3.4），如前所述。

结果

这项工作的主要目标是开发和研究基于金纳米粒子比色分析在现场使用的稳定性和适体的稳健性。如在先前的出版物强调，用于创建该测定两种不同的策略进行了调查^7。该测定法被称为自由适配体测定和吸附适配体测定。的吸附适配体测定是一个fieldable检测测定（ 图1）的目的更吸引人。

图 1. 的吸附适配体测定的示意图的适体与金纳米粒子混合并孵育过夜溶解在甲醇中分析物分子加入到该吸收适配体测定，随后立即通过加入氯化钠（NaCl）来诱导金纳米粒子聚集中加入目标时。EF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。 ...

讨论

在过去十年中，基于纳米颗粒的比色测 ​​定法已被用于检测的目标开发包括小分子，DNA，蛋白质和细胞^2-4。使用DNA适体纳米粒子实验已获得的利益。通常，这些比色测 ​​定法是通过将DNA的适体与分析物分子，随后加入到纳米金^9-10进行。但是，这些测定法已经用于证明的概念展示具有受控的实验室设置，以有限的，所选择的控制。最新进展过渡这项技术进入该领域已经进行了^7。在这种方法中，将DNA适配子被吸附至金纳米粒子表面进行测试之前，加入分析物分子（ 图1）。任一适体 - 金纳米颗粒根据比色测定法的发展，需要在制造/分析过程的各个阶段的优化。因此，这些新的光盘ipline必须注意到提炼和解决这些试验获得成功相关的细微差别。

吸附的适配子的金纳米粒子实验要求每个适配子/目标对细致的优化。但是，具体操作如下解释在这里提供了一个一致的协议来执行这些比色法的优化。盐浓度导致在目标和测定空白之间的最大可观测或可测量的颜色变化的确定和调整是更关键的优化步骤（ 图2和

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三氯化金水合物	西格马	254169	99.999%的纯度非常重要，每次都保持新鲜
柠檬酸钠二水合物	西格马	W302600-1KG-K	我们发现制造商对AuNP检测结果影响很大，每次溶液都是新鲜的
协同	生物-TEK	半夜	任何吸收光谱仪都可以使用，但板读器可进行多样品分析
4-（2-羟基乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸（HEPES）缓冲液，1 M已绝育	阿姆雷斯科	J848	任何消毒过的品牌都可以
康宁，250毫升过滤器系统，0.22 µM纤维素醋酸酯	渔夫	430767	其他膜已被发现能去除AuNPs。
紫外分光光度计	瓦里安	凯里 300	任何吸收光谱仪都可以
六水合氯化镁	弗卢卡	63068	≥98%的品牌都能用
脱氧核糖核酸	IDT	习惯	DNA通过脱盐柱进行纯化，可以使用更高纯化技术
盐酸普鲁卡因	亚克罗斯	AC20731-1000	已制备99%为1 mg/ml的甲醇库存
盐酸	渔夫	A144S-500	36.5-38.0%的电量，其他品牌也能用
盐酸可卡因	利波梅德	COC-156-HC-1LM	我们发现制造商对AuNP检测结果影响很大
硝酸	渔夫	A509-SK212	65%的比例，其他品牌也能用
氯化钠溶液，5 M生物试剂级	西格马	S5150-1L	无菌固体溶液可行
二乙基焦碳酸酯	西格马	D5758-25毫升	≥97%的品牌都能用
双烯亚基酯盐酸盐	利波梅德	COC-205-HC-1LM	我们从同一制造商获得了EME对照组，目标可卡因
微离心机管，Axygen Scientific，非无菌，1.7 毫升	VWR	10011-722	我们发现制造商对AuNP检测结果影响很大，管子是内部高压灭菌处理的
无核酸酶水
甲醇