本文介绍一种利用无饲养层细胞的慢病毒系统，从患者来源的成纤维样滑膜细胞生成人诱导性多能干细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
通过一组特定的重编程因子，成熟的体细胞可以被逆转为一种多能干细胞样的状态。许多研究已通过转导四种山中（Yamanaka）转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，从多种体细胞类型中成功生成了诱导性多能干细胞（iPSCs）。iPSCs的研究目前仍处于生物学和临床研究的前沿领域。特别是，患者特异性的iPSCs可作为研究疾病病理生物学的开创性工具，因为iPSCs可以从任何个体的组织中诱导获得。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，其特征是关节内软骨和骨结构的破坏。滑膜增生是导致RA出现这些结果的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是增生性滑膜中的主要组成细胞。关节内的FLSs会无限增殖，最终侵袭邻近的软骨和骨组织。目前，增生的滑膜只能通过外科手术方式切除。切除的滑膜被用作RA研究的材料，以反映关节的炎症状态。作为RA发病机制中的关键参与者，FLSs可被用作生成和研究RA患者iPSCs的材料。在本研究中，我们利用一名RA患者的FLSs生成了iPSCs。通过慢病毒系统，我们发现FLSs能够生成该RA患者特异性的iPSC。由FLSs生成的iPSCs未来可进一步作为研究RA病理生理学的工具。
引言
多能干细胞是多种临床和生物学领域的下一代技术平台。它们是一种极具前景的工具，可用于疾病建模、药物筛选以及再生医学治疗。人类胚胎干细胞（hESCs）曾主要用于研究和理解多能性细胞。然而，由于hESCs的获取需要破坏人类囊胚，因而涉及诸多伦理问题。2007年，山中伸弥博士及其团队逆转了细胞编程过程，成功利用人类成体体细胞培育出干细胞1,2。因此，与hESCs不同，诱导性多能干细胞（iPSCs）可由成熟的体细胞生成，从而避免了伦理障碍。
通常，诱导多能干细胞（iPSCs）是通过导入四个外源基因生成的：Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc。这些山中因子最初是利用慢病毒和逆转录病毒系统递送的。首批 iPSCs 是从小鼠体细胞中获得的3。随后，该技术被应用于人皮肤成纤维细胞1,2。后续研究成功地从多种来源获得了 iPSCs，例如尿液4、血液5,6、角质形成细胞7 以及其他多种细胞类型。然而，仍有一些体细胞尚未用于重编程，且仍需对疾病状态下特定组织来源的不同细胞类型的重编程能力进行筛选。
类风湿关节炎（RA）是一种可累及全身所有关节并导致其他器官发生自身免疫性病变的疾病。在发达国家，约有1%的成年人受此病影响。该病较为常见，且其发病率每年持续上升8。然而，RA在早期阶段难以识....
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方案
伦理声明：本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC12TISI0861）。
1. 滑膜细胞的分离与扩增
- 滑膜细胞的分离
- 将两把手术剪和一把镊子进行灭菌处理。
- 将滑膜组织转移至一个100 mm培养皿中，并用5 ml含1%青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
- 切除黄色脂肪组织和骨残留物。将修整后的组织转移至6孔板的一个孔中，并加入5 ml含20%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 用剪刀将组织剪碎，直至碎片足够小，能够通过一次性移液管。
- 将含有组织的培养基转移至一个50 ml锥形管中。向6孔板中加入5 ml含20% FBS的DMEM，收集残留材料，然后转移至同一管中。
- 在冰上解冻胶原酶。加入胶原酶至终浓度为0.01%，用封口膜密封管口。在37 °C水浴中振荡孵育4小时。
- 孵育结束后，用含20% FBS的DMEM补足体积至50 ml，于室温下以300 × g离心10分钟。
- 小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入40 ml培养基重悬沉淀。
- 重复步骤1.1.10–1.1.11。
- 将沉淀重悬于25 ml含20% FBS的DMEM中，静置，待较大的组织团块沉降至管底。
- 将上清液转移至一个100 mm培养皿中，在37 °C、5% C....
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结果
本研究中，我们描述了一种利用慢病毒系统从滑膜成纤维样细胞（FLSs）生成诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。图1A展示了滑膜成纤维样细胞分离方案的简要流程。在手术切除滑膜组织后，使用手术剪将组织剪切成小块，随后加入胶原酶以从组织团块中分离细胞。细胞培养14天后进行后续处理。图1B展示了分离得到的FLSs的形态特征。细胞在使用前共传代3次。FLSs具有与普通成纤维细胞相似的特性。我们分离得到的FLSs表达纤维化标志物波形蛋白（Vimentin）和纤连蛋白（Fibronectin）。此外，分离自类风湿关节炎患者的FLSs对巨噬细胞样滑膜细胞标志物CD68呈低表达（图1C）。
分离FLS并用含有4种Yamanaka因子的慢病毒进行转导以诱导重编程。在以不同比例传代细胞后（第7天），开始出现小的克隆。如图2A所示，可见的克.......
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讨论
在诱导多能干细胞（iPSCs）被发现之前，科学家主要利用胚胎干细胞（ESCs）通过分化来研究干细胞生物学及其他细胞谱系。然而，ESCs来源于囊胚的内细胞团，而囊胚属于早期胚胎。为了分离ESCs，不可避免地需要破坏囊胚，这引发了难以克服的伦理问题。此外，尽管ESCs具有干性特征和多能性，但它们无法从特定个体中获取，因此有时并不适合作为个性化分析和疾病筛选的理想工具。
2007年，Takahashi 等由人成纤维细胞生成的诱导多能干细胞2理论上，与胚胎干细胞（ESCs）不同，诱导多能干细胞（iPSCs）可由任何成体体细胞产生。凭借这一优势，iPSCs 被认为是自体细胞移植的理想工具。此外，基于表观遗传记忆的概念，iPSCs 被视为模拟致病条件的理想细胞材料。 即 疾病建模。已有许多研究利用多种类型的细胞（如血细胞、尿液细胞等）开展。然而，仍有许多细胞类型（如滑膜成纤维样细胞，FLSs）尚未进行重编程研究。
关节炎类疾病是主要的免疫系统疾病，可导致永久性残疾。类风湿关节炎（R.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由韩国疾病预防控制中心资助的研究项目（HI13D2188）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | TPP | 93100 | |
| 6 孔板 | TPP | 92006 | |
| 50 ml 离心管 | SPL | 50050 | |
| 15 ml 离心管 | SPL | 50015 | |
| 10 ml 一次性移液管 | Falcon | 7551 | |
| 5 ml 一次性移液管 | Falcon | 7543 | |
| 12 孔板 | TPP | 92012 | |
| FLS 分离材料 | |||
| 手术剪 | |||
| 手术镊 | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P4333 | |
| 胎牛血清（FBS） | Life Technologies | 16000-044 | |
| 胶原酶 | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| 封口膜（Parafilm） | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC 生成材料 | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100×） | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 聚凝胺（Polybrene） | Chemicon | TR-1003-G | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | P4333 | |
| 胎牛血清（FBS） | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 慢病毒（Lentivirus） | |||
| DMEM/F12，含 HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC 培养基成分（500 ml） |
| 碳酸氢钠 | Life Technologies | 25080-094 | iPSC 培养基成分（浓度：543 μg/ml） |
| 亚硒酸钠 | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC 培养基成分 （浓度：14 ng/mL） |
| 人转铁蛋白 | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC 培养基成分（浓度：10.7 μg/ml） |
| 碱性成纤维细胞生长因子 2（bFGF2） | Peprotech | 100-18B | iPSC 培养基成分 （浓度：100 ng/ml） |
| 人胰岛素 | Life Technologies | 12585-014 | iPSC 培养基成分（浓度：20 μg/ml） |
| 人 TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC 培养基成分（浓度：2 ng/ml） |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC 培养基成分 （浓度：64 μg/ml） |
| 聚凝胺（Polybrene） | Chemicon | TR-1003 | |
| 丁酸钠 | Sigma Aldrich | B5887 | |
| 纤连蛋白（Vitronectin） | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK 抑制剂 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| 质量控制材料 | |||
| 18 mm 盖玻片 | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| 吐温 X-100（Triton X-100） | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Vector Lab | SP-5050 | |
| 抗 SSEA4 抗体 | Millipore | MAB4304 | |
| 抗 Oct4 抗体 | Santa Cruz | SC9081 | |
| 抗 TRA-1-60 抗体 | Millipore | MAB4360 | |
| 抗 Sox2 抗体 | Biolegend | 630801 | |
| 抗 TRA-1-81 抗体 | Millipore | MAB4381 | |
| 抗 Klf4 抗体 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体 | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）抗体 | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| 载玻片（涂层） | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 氯仿 | Sigma Aldrich | 366919 | |
| 异丙醇 | Millipore | 109634 | |
| 乙醇 | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1622 | |
| i-Taq DNA 聚合酶 | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10× TBE 缓冲液 | Life Technologies | 15581-044 | |
| 上样染料（loading star） | Dyne Bio | A750 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA 梯度标记物 | Enzynomics | DM003 | |
| 碱性磷酸酶 | Millipore | SCR004 |
参考文献
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131....
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