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方法文章

利用类风湿关节炎患者关节中分离的成纤维样滑膜细胞生成诱导性多能干细胞

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DOI：

10.3791/54072

⸱

2016年10月16日

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

本文内容

摘要

本文介绍一种利用无饲养层细胞的慢病毒系统，从患者来源的成纤维样滑膜细胞生成人诱导性多能干细胞的实验方案。

摘要

通过一组特定的重编程因子，成熟的体细胞可以被逆转为一种多能干细胞样的状态。许多研究已通过转导四种山中（Yamanaka）转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，从多种体细胞类型中成功生成了诱导性多能干细胞（iPSCs）。iPSCs的研究目前仍处于生物学和临床研究的前沿领域。特别是，患者特异性的iPSCs可作为研究疾病病理生物学的开创性工具，因为iPSCs可以从任何个体的组织中诱导获得。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，其特征是关节内软骨和骨结构的破坏。滑膜增生是导致RA出现这些结果的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是增生性滑膜中的主要组成细胞。关节内的FLSs会无限增殖，最终侵袭邻近的软骨和骨组织。目前，增生的滑膜只能通过外科手术方式切除。切除的滑膜被用作RA研究的材料，以反映关节的炎症状态。作为RA发病机制中的关键参与者，FLSs可被用作生成和研究RA患者iPSCs的材料。在本研究中，我们利用一名RA患者的FLSs生成了iPSCs。通过慢病毒系统，我们发现FLSs能够生成该RA患者特异性的iPSC。由FLSs生成的iPSCs未来可进一步作为研究RA病理生理学的工具。

引言

多能干细胞是多种临床和生物学领域的下一代技术平台。它们是一种极具前景的工具，可用于疾病建模、药物筛选以及再生医学治疗。人类胚胎干细胞（hESCs）曾主要用于研究和理解多能性细胞。然而，由于hESCs的获取需要破坏人类囊胚，因而涉及诸多伦理问题。2007年，山中伸弥博士及其团队逆转了细胞编程过程，成功利用人类成体体细胞培育出干细胞1,2。因此，与hESCs不同，诱导性多能干细胞（iPSCs）可由成熟的体细胞生成，从而避免了伦理障碍。

通常，诱导多能干细胞（iPSCs）是通过导入四个外源基因生成的：Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc。这些山中因子最初是利用慢病毒和逆转录病毒系统递送的。首批 iPSCs 是从小鼠体细胞中获得的3。随后，该技术被应用于人皮肤成纤维细胞1,2。后续研究成功地从多种来源获得了 iPSCs，例如尿液4、血液5,6、角质形成细胞7 以及其他多种细胞类型。然而，仍有一些体细胞尚未用于重编程，且仍需对疾病状态下特定组织来源的不同细胞类型的重编程能力进行筛选。

类风湿关节炎（RA）是一种可累及全身所有关节并导致其他器官发生自身免疫性病变的疾病。在发达国家，约有1%的成年人受此病影响。该病较为常见，且其发病率每年持续上升8。然而，RA在早期阶段难以识别，一旦发生骨质破坏，目前尚无治疗方法能够修复已造成的损伤。此外，药物疗效因患者而异，难以预测适合个体的药物。因此，亟需建立一种药物筛选方法，并需要一种能够反映RA病理状态的细胞材料。

成纤维样滑膜细胞（FLSs）是类风湿关节炎（RA）发病机制中的重要细胞参与者9,10滑膜衬里细胞（FLS）存在于关节囊与关节腔之间的滑膜内层，该结构也被称为滑膜组织。FLS通常在关节结构支持及为周围软骨提供营养方面发挥关键作用，对关节功能和维持至关重要。然而，在类风湿关节炎（RA）中，FLS表现出侵袭性表型。RA患者的FLS具有类似癌症的表型，可通过无限增殖最终破坏周围骨组织。10凭借这一独特特性，FLS 可作为一种极具前景的材料，用于反映类风湿关节炎的病理生物学特征。然而，这些细胞很少被大量制备，且在多次传代过程中细胞表型会发生改变。 体外 因此，使用类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA FLSs）作为反映患者病情的工具可能会比较复杂。

理论上，类风湿关节炎（RA）患者来源的诱导多能干细胞（RA-iPSCs）可成为药物筛选及进一步研究的理想工具。所获得的iPSCs具有自我更新能力，可在体外进行维持和扩增in vitro。由于具有多能性，这些细胞可分化为成熟的软骨细胞和成骨细胞谱系，从而为RA及其他骨骼相关疾病的特定研究提供细胞材料11。

本研究中，我们演示了如何从手术切除的滑膜组织中分离并扩增滑膜成纤维样细胞（FLSs），以及如何利用含有山中因子的慢病毒从FLSs诱导生成类风湿关节炎诱导性多能干细胞（RA-iPSCs）。

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方案

伦理声明：本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC12TISI0861）。

1. 滑膜细胞的分离与扩增

  1. 滑膜细胞的分离
    1. 将两把手术剪和一把镊子进行灭菌处理。
    2. 将滑膜组织转移至一个100 mm培养皿中，并用5 ml含1%青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
    3. 切除黄色脂肪组织和骨残留物。将修整后的组织转移至6孔板的一个孔中，并加入5 ml含20%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
    4. 用剪刀将组织剪碎，直至碎片足够小，能够通过一次性移液管。
    5. 将含有组织的培养基转移至一个50 ml锥形管中。向6孔板中加入5 ml含20% FBS的DMEM，收集残留材料，然后转移至同一管中。
    6. 在冰上解冻胶原酶。加入胶原酶至终浓度为0.01%，用封口膜密封管口。在37 °C水浴中振荡孵育4小时。
    7. 孵育结束后，用含20% FBS的DMEM补足体积至50 ml，于室温下以300 × g离心10分钟。
    8. 小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入40 ml培养基重悬沉淀。
    9. 重复步骤1.1.10–1.1.11。
    10. 将沉淀重悬于25 ml含20% FBS的DMEM中，静置，待较大的组织团块沉降至管底。
    11. 将上清液转移至一个100 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下孵育14天。
  2. 滑膜细胞的维持与扩增
    1. 弃去培养皿中的旧培养基，用5 ml PBS洗涤细胞。
    2. 加入1 ml PBS/1 mM EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
    3. 轻轻敲击培养皿，将细胞转移至15 ml锥形管中。于室温下以250 × g离心2分钟。
    4. 小心移除上清液，避免扰动沉淀，用30 ml含20% FBS的DMEM重悬沉淀。
    5. 将细胞转移至3个100 mm培养皿中，确保无可见残留物。
    6. 每3天更换一次新鲜培养基。当细胞融合度达到80%时，使用1 ml PBS/1 mM EDTA进行传代。使用前维持培养至第3代。每次传代时将每皿细胞分至3个新培养皿中。
      注：达到第3代后，暂不使用的细胞可进行冻存。

2. 使用编码山中因子的慢病毒重编程滑膜成纤维细胞

  1. 转导（第0天）
    1. 在6孔板中每孔接种3 × 104个细胞，培养基为生长培养基（500 ml DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）。于37 °C、5% CO2条件下过夜培养细胞。
    2. 次日，从冰箱中取出一管含有4种Yamanaka因子（Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc）的慢病毒，置于4 °C解冻。注：慢病毒的制备方法见我们之前的研究11。
    3. 在病毒解冻的同时，更换为FLS生长培养基（含20%胎牛血清和抗生素的DMEM），并添加10 µg/ml六亚甲基溴化铵和50 µg/ml抗坏血酸。
    4. 更换培养基后，向每孔加入30 µl慢病毒，并轻柔混匀。为提高感染效率，将培养板在35 °C、680 × g条件下离心30分钟。
    5. 离心后，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下继续培养。
  2. 维持培养直至重编程现象可见
    1. 连续3天，每天更换一次含0.1 mM丁酸钠和50 µg/ml抗坏血酸的FLS生长培养基。
    2. 次日，更换为FLS生长培养基与iPSC培养基（1:1比例）的混合液，其中含0.1 mM丁酸钠和50 µg/ml抗坏血酸。
      注：iPSC培养基的组分见材料/设备列表。
  3. 细胞传代以促进克隆形成
    1. 准备经玻连蛋白包被的6孔板。
      1. 将60 µl玻连蛋白加入6 ml不含Ca2+和Mg2+的PBS中，每孔加入2 ml混合液，室温孵育至少1小时。注：玻连蛋白的工作浓度为5 µg/mL。
    2. 第5天（D5），用PBS洗涤细胞。
    3. 加入1 ml PBS/1 mM EDTA以解离细胞，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
    4. 收集细胞，并在室温下以250 × g离心2分钟。
    5. 按三种不同比例（1:3、1:6和1:9）进行传代，以获得不同的细胞密度。向细胞沉淀中加入900 µl培养基并重悬，分别向6孔板每孔加入300 µl、150 µl和100 µl细胞悬液，对应传代比例分别为1:3、1:6和1:9。
    6. 每天更换iPSC培养基，直至克隆出现，通常在第18天左右可见克隆。注：此阶段iPSC克隆与未重编程的FLS共存。
  4. 克隆挑取
    1. 通过向48孔板每孔加入500 µl玻连蛋白溶液，室温孵育至少1小时，制备玻连蛋白包被的48孔板。
    2. 将显微镜置于洁净台内，从培养箱中取出6孔板。
    3. 吸除48孔板中的玻连蛋白溶液，每孔加入500 µl含10 mM Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂的iPSC培养基。
    4. 使用10 µl移液枪头围绕克隆进行切割，将挑取的克隆转移至48孔板的一个孔中。
    5. 挑取多个克隆后，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
    6. 继续培养细胞直至克隆足够大以便传代。注：通常当克隆超出100倍放大倍数下显微镜视野范围时，我们进行传代。

3. 免疫荧光染色

  1. 细胞准备
    1. 将一个无菌的 18 mm 盖玻片放入 12 孔板中。
    2. 加入 1 ml PBS 以冷却并冲洗盖玻片。
    3. 更换为 1 ml 浓度为 10 µg/ml 的玻璃粘连蛋白（vitronectin）溶液。
    4. 在室温下孵育至少 1 小时。
    5. 弃去玻璃粘连蛋白溶液，将诱导多能干细胞（iPSCs）接种至经玻璃粘连蛋白包被的 12 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天，每天更换培养基。
  2. 细胞染色
    1. 弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。
    2. 用 0.4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 30 分钟。
    3. 用 0.1% Triton X-100 在室温下对细胞进行通透处理 5 分钟。
    4. 移除通透液，加入含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 在室温下封闭 30 分钟。
    5. 根据表 1将一抗抗体用含 2% BSA 的 PBS 稀释，并在室温下与细胞孵育 2 小时。
    6. 加入二抗抗体（按 1:200 稀释），在室温下避光孵育 1 小时。
    7. 用终浓度为 1 µl/mL 的 DAPI 处理细胞 10 分钟。
    8. 将盖玻片置于载玻片上，加入抗荧光淬灭剂，在室温下避光孵育 24 小时。
    9. 使用荧光显微镜检测表达情况。

4. 实时聚合酶链式反应（RT-PCR）

  1. 采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从细胞沉淀中提取 mRNA11。
  2. 以 2 µg 总 mRNA 为模板，通过逆转录扩增 cDNA11。
  3. 使用 2 µl cDNA 模板混合 PCR 所需组分11。
  4. 进行 RT-PCR 并通过凝胶电泳验证结果11。

5. 碱性磷酸酶（AP）染色

  1. 在染色前，将iPSCs在37 °C、5% CO2条件下培养5-7天。
  2. 吸除培养基，并用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞1分钟。
  3. 弃去固定液，用1X漂洗缓冲液冲洗细胞。
  4. 配制碱性磷酸酶（AP）染色试剂。按以下比例混合试剂：Fast Red Violet : Naphthol AS-BI 磷酸盐溶液 : 水 = 2:1:1。
  5. 将细胞与染色液在室温下避光孵育15分钟。
  6. 弃去染色液，用漂洗缓冲液冲洗细胞。
  7. 用PBS覆盖细胞以防止干燥，并使用明场显微镜检测表达情况。

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结果

本研究中，我们描述了一种利用慢病毒系统从滑膜成纤维样细胞（FLSs）生成诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。图1A展示了滑膜成纤维样细胞分离方案的简要流程。在手术切除滑膜组织后，使用手术剪将组织剪切成小块，随后加入胶原酶以从组织团块中分离细胞。细胞培养14天后进行后续处理。图1B展示了分离获得的FLSs的形态特征。细胞在使用前共传代3次。FLSs具有与普通成纤维细胞相似的特性。我们分离得到的FLSs表达纤维化标志物波形蛋白（Vimentin）和纤连蛋白（Fibronectin）。此外，分离自类风湿关节炎患者的FLSs对巨噬细胞样滑膜细胞标志物CD68呈低表达（图1C）。

FLSs 经收获后，用含有4种山中因子的慢病毒进行转导以诱导重编程。在以不同比例传代细胞后（第7天），开始出现小的克隆。可见的克隆如图所示 图2A...

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讨论

在诱导多能干细胞（iPSCs）被发现之前，科学家主要利用胚胎干细胞（ESCs）通过分化来研究干细胞生物学及其他细胞谱系。然而，ESCs来源于囊胚的内细胞团，而囊胚属于早期胚胎。为了分离ESCs，不可避免地需要破坏囊胚，这引发了难以克服的伦理问题。此外，尽管ESCs具有干性特征和多能性，但它们无法从特定个体中获取，因此有时并不适合作为个性化分析和疾病筛选的理想工具。

2007年，Takahashi 等由人成纤维细胞生成的诱导多能干细胞2理论上，与胚胎干细胞（ESCs）不同，诱导多能干细胞（iPSCs）可由任何成体体细胞产生。凭借这一优势，iPSCs 被认为是自体细胞移植的理想工具。此外，基于表观遗传记忆的概念，iPSCs 被视为模拟致病条件的理想细胞材料。 即 疾病建模。已有许多研究利用多种类型的细胞（如血细胞、尿液细胞等）开展。然而，仍有许多细胞类型（如滑膜成纤维样细胞，FLSs）尚未进行重编程研究。

关节炎类疾病是主要的免疫系统疾病，可导致永久性残疾。类风湿关节炎（R...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由韩国疾病预防控制中心资助的研究项目（HI13D2188）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿TPP93100
6 孔板TPP92006
50 ml 离心管SPL50050
15 ml 离心管SPL50015
10 ml 一次性移液管Falcon7551
5 ml 一次性移液管Falcon7543
12 孔板TPP92012
FLS 分离材料
手术剪
手术镊
DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
青霉素-链霉素Sigma AldrichP4333
胎牛血清（FBS）Life Technologies16000-044
胶原酶Sigma AldrichC6885-100MG
封口膜（Parafilm）Sigma Aldrich54956
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
iPSC 生成材料
DMEMLife Technologies11885
MEM 非必需氨基酸溶液（100×）Life Technologies11140-050
β-巯基乙醇Sigma AldrichM3148
聚凝胺（Polybrene）ChemiconTR-1003-G
青霉素-链霉素Life TechnologiesP4333
胎牛血清（FBS）Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
慢病毒（Lentivirus）
DMEM/F12，含 HEPESLife Technologies11330-057iPSC 培养基成分（500 ml）
碳酸氢钠Life Technologies25080-094iPSC 培养基成分（浓度：543 μg/ml）
亚硒酸钠Sigma AldrichS5261iPSC 培养基成分 （浓度：14 ng/mL）
人转铁蛋白Sigma AldrichT3705iPSC 培养基成分（浓度：10.7 μg/ml）
碱性成纤维细胞生长因子 2（bFGF2）Peprotech100-18BiPSC 培养基成分 （浓度：100 ng/ml）
人胰岛素Life Technologies12585-014iPSC 培养基成分（浓度：20 μg/ml）
人 TGFβ1Peprotech100-21iPSC 培养基成分（浓度：2 ng/ml）
抗坏血酸Sigma AldrichA8960iPSC 培养基成分 （浓度：64 μg/ml）
聚凝胺（Polybrene）ChemiconTR-1003
丁酸钠Sigma AldrichB5887
纤连蛋白（Vitronectin）Life TechnologiesA14700
ROCK 抑制剂Sigma AldrichY0503
质量控制材料
18 mm 盖玻片SuperiorHSU-0111580
4% 多聚甲醛（PFA）Tech & InnovationBPP-9004
吐温 X-100（Triton X-100）BIOSESANG9002-93-1
牛血清白蛋白（BSA）Vector LabSP-5050
抗 SSEA4 抗体MilliporeMAB4304
抗 Oct4 抗体Santa CruzSC9081
抗 TRA-1-60 抗体MilliporeMAB4360
抗 Sox2 抗体Biolegend630801
抗 TRA-1-81 抗体MilliporeMAB4381
抗 Klf4 抗体Abcamab151733
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体Molecular ProbeA11029
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）抗体Molecular ProbeA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36934
载玻片（涂层）Hyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
氯仿Sigma Aldrich366919
异丙醇Millipore109634
乙醇Duksan64-17-5
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒Thermo ScientificK1622
i-Taq DNA 聚合酶iNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10× TBE 缓冲液Life Technologies15581-044
上样染料（loading star）Dyne BioA750
琼脂糖Sigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) DNA 梯度标记物EnzynomicsDM003
碱性磷酸酶MilliporeSCR004

参考文献

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