本论文描述了一种管形成实验，通过在受控环境中利用内皮细胞的管形成能力，来定量评估特定化合物或条件对血管生成的影响。
本文内容
摘要
摘要
恶性肿瘤需要血液供应才能存活和扩散。这些肿瘤通过劫持血管生成过程，从患者的血液中获取所需的血液供应，而血管生成是指从已有血管形成新血管的过程。CXCR2（C-X-C基序趋化因子受体2）是一种跨膜G蛋白偶联分子，存在于多种细胞中，与血管生成密切相关1特异性阻断CXCR2受体可抑制血管生成，这一效应可通过多种检测方法进行评估，例如内皮细胞管形成实验。管形成实验适用于研究血管生成，因其能有效评估特定化合物或环境条件对血管生成可能产生的影响。该方法操作简便、快速 体外 一种可产生可量化数据且所需组分相对较少的检测方法。与 体内 检测方法，无需使用动物，且可在两天内完成。本方案描述了一种支持内皮细胞管形成检测的细胞外基质方法的变体，用于检测CXCR2受体。
引言
为了获取生存所必需的营养物质，恶性肿瘤需要进入患者的血液系统。为了实现这一目的，肿瘤细胞会释放化学信号，刺激新生血管向肿瘤生长，从而劫持了正常的生理过程——血管生成2。癌症转移（即 癌细胞扩散至其他器官）也是通过血管生成所形成的血管发生的。由于血管生成过程对多种癌症的发展至关重要，因此它成为抗癌治疗研究中一个极具吸引力的靶点3。
用于量化血管生成的一种方法是测量内皮祖细胞在细胞外基质上形成管状结构的能力。由于这些管状结构的形成是血管生成过程中的关键早期步骤，因此通过检测不同环境条件（例如，某种化合物的存在或缺失）对管形成能力的促进或抑制作用，有助于深入了解可靶向干预的特定环节。内皮细胞管形成实验是最广泛应用的4 体外方法之一，用于评估细胞形成管状结构的能力。该实验操作简便，所需组分较少且培养周期较短5。然而，或许最重要的是，此类实验所获得的数据具有可量化性。
使用管形成实验的一个示例是，比较血管内皮细胞在细胞外基质与生长因子减少型（GFR）细胞外基质上培养时管结构的形成情况。细胞外基质是一种类似于基底膜的物质，来源于肉瘤细胞，其主要成分为层粘连蛋白、IV型胶原、生长因子和蛋白聚糖。某些化合物在生长因子减少且肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）减少的环境中，对细胞形成管状结构的能力会产生不同的影响。HSPGs是细胞外基质的一种组分，在GFR细胞外基质中其含量显著降低。例如，若假设血管生成抑制剂（如阻断CXCR2受体的SB225002）在HSPGs含量丰富时抑制管形成的能力明显较弱，则通过比较细胞在普通细胞外基质与GFR细胞外基质中管形成活性的差异，对于探索通过调控HSPGs实现血管生成抑制的可能性具有重要意义。
常用于确定化合物对血管生成影响的其他检测方法是体内方法。典型的例子包括利用鸡胚进行的鸡绒毛尿囊膜（CAM）检测6，以及利用小鼠进行的体内Matrigel栓塞血管生成检测7。尽管体内方法可在三维环境中测量血管生成，且相较于体外管形成检测更能模拟人体情况，但其缺点是耗时显著更长，操作也更为复杂。CAM检测和细胞外基质栓塞检测均至少需要一周时间8，而相比之下，管形成检测可在一天内完成，且无需使用动物。
需要注意的是，本报告中使用的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在血管出芽和血管生长过程中发挥关键作用，且与肿瘤中的内皮细胞具有足够的相似性，因此可用于评估抗血管生成活性 体外 和 体内 实验9其他细胞，例如原代微血管内皮细胞，也可使用。
还需要注意的是，与正常细胞外基质相比，GFR细胞外基质不仅HSPG水平较低，而且许多其他组分的含量也有所降低。这些组分包括但不限于：EGF、IGF-1、PDGF和TGF-beta。研究这些化合物在血管生成中作用的相关实验人员可能会对使用GFR细胞外基质感兴趣。
方案
1. 细胞培养
- 在75 cm²培养瓶中加入10 ml完全生长培养基10，接种3×105个HUVEC细胞。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞融合度达到70–80%。
2. 小管形成实验
- 在冰上于 4 °C 过夜解冻生长因子减少型（GFR）细胞外基质或正常细胞外基质。
注：为简洁起见，下文中的“细胞外基质”将同时指代GFR和正常细胞外基质，其制备过程相同。 - 将96孔培养板置于冰上，使用预冷的枪头向每孔加入50 µl冷的细胞外基质。设置仅含普通细胞外基质的5孔，重复3次。另设置仅含GFR细胞外基质的5孔，重复3次。
- 将96孔板在37 °C孵育30分钟。
- 用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 HUVECs 一次，加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。将培养皿置于 37 °C 培养 1–5 分钟，每隔 1 分钟观察细胞，直至大多数细胞变圆。轻敲培养瓶一次，使细胞脱落。
- 加入5 ml基础培养基（即， 无添加的内皮细胞生长培养基例如，加入含1%胎牛血清（FBS）的培养基。用移液器吹打收集培养瓶中的细胞，转移至15 ml离心管中。在200 × g条件下离心5分钟，弃上清液。
- 用2 ml基础培养基重悬细胞，使用血细胞计数板计数，并将细胞浓度调整至2-3 × 105 cells/ml
- 在基础培养基中配制以下浓度的CXCR2抑制剂SB225002，每种100 µl：11 µM、5.6 µM、1.1 µM、0.56 µM和0 µM（对照）。
- 将300 µl HUVEC悬液移液至5个微量离心管中。向各管分别加入33 µl不同浓度的抑制剂（11 µM、5.6 µM、1.1 µM、0.56 µM和0 µM），每管对应一种浓度，随后涡旋混匀。
- 用移液器吸取每种细胞悬液各 50 µl（1-1.5 × 10⁶ 细胞/ml）4 将细胞接种至含细胞外基质的各个孔中。每种细胞悬液设三个复孔，于37 °C、5% CO₂条件下孵育4–16小时。2.
- 4–16 小时后，使用倒置显微镜相机对每个孔中形成的管状结构拍摄 4 张图片11 （原始放大倍数 × 100）
3. 小管破坏实验
- 按照管形成实验（步骤 2.1 至 2.3）相同的规格准备细胞外基质和培养板。
- 按照管形成实验步骤 2.4–2.4.2 所述方法制备 HUVEC 悬液，并将 50 µl 悬液分装至含有细胞外基质的 96 孔板中，每孔 50 µl。
注意：应接种足够数量的孔，确保每种药物处理组包含 3 个复孔。 - 将细胞在细胞外基质上于 37 °C、5% CO2 条件下培养 4 小时 ，在开始药物处理前拍摄图像。
- 按照管形成实验步骤 2.5 所述方法配制 CXCR2 抑制剂 SB225002 的 2 倍浓度溶液，并向含有 HUVECs 的 96 孔板每孔加入 50 µl 各浓度药物溶液。每种浓度设三个复孔。
- 将培养板继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–12 小时。使用倒置显微镜相机对每孔中形成的管状结构拍摄 4 张图像（原始放大倍数 ×100）11。
4. 数据量化
- 使用显微镜相机软件，在四张随机显微图像中测量管状结构的总长度，以评估图像中捕获的成管情况。
- 在显微镜相机软件中打开图像，点击“注释与测量”。在“长度”部分选择“直线”工具。点击图像，沿管状结构的长度绘制一条直线，然后右键单击。
注意：软件将自动计算该直线的像素长度，并将数据保存至文件。 - 重复使用“直线”工具，对图像中所有管状结构逐一进行操作。点击图像，沿每条管状结构的长度绘制直线，然后右键单击。
注意：软件将记录每条直线的长度，并在屏幕上显示数据。 - 完成图像中所有管状结构的测量后，点击“导出”，然后选择“长度导出至电子表格”。
注意：长度数据将被导出至电子表格中。 - 从电子表格中汇总所有管状结构的长度，得到总管长度。计算并记录管状结构的平均长度。
注意：建议进行四次重复实验，并计算均值与标准差。
5. 从细胞外基质培养物中回收细胞
- 以更大规模进行培养并开展管状结构形成实验（参见第2节），因为96孔板无法获得足够的细胞数量。对于12孔板，每孔使用500 µl细胞外基质和500 µl HUVEC细胞悬液（1.5×105个细胞）。
- 将细胞孵育4–16小时 以形成管状结构。随后吸除细胞培养基，用1 ml冰冷的不含钙和镁的1×PBS缓冲液冲洗细胞。
- 向培养孔中加入1 ml冰上预冷的含2.5 mM EDTA的PBS缓冲液，置于冰上10分钟。
- 使用剪去尖端的1,000 µl移液枪头将细胞与细胞外基质的混合物从培养皿中剥离，并转移至预冷的15 ml离心管中；再用4 ml冰上预冷的含2.5 mM EDTA的PBS缓冲液冲洗培养孔，一并收集至同一离心管中。
- 将离心管置于冰上1–4小时，并间歇轻柔颠倒混匀数次，直至细胞外基质完全溶解。
- 在0 °C条件下，以1,620 × g离心10分钟。
- 将细胞沉淀用1 ml冰冷PBS重悬，转移至冰上的1 ml离心管中。
- 再次在0 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 将细胞沉淀于-80 °C保存。
结果
在显微镜图像中，明显的健康内皮管腔形成可与受抑制的管腔形成形成鲜明对比。健康的管腔形成表现为有序的毛细血管样结构网络（图1）。相比之下，受抑制的管腔形成则表现为分散的细胞（图2）。管腔形成实验数据通过测量毛细血管管的总管长度进行量化（表1）。除总管长度外，还可测量平均管长度、管的总数或分支点总数。结构化的管腔形成所产生的净管长度大于分散且受抑制的管生长。在图3中，通过人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在GFR细胞外基质上使用CXCR2抑制剂SB225002的实验条件下绘制的剂量反应曲线，可计算出IC50值。
图1. 内皮 t在细胞外基质及生长因子减少型（GFR）细胞外基质上的成管形成 两张图像显示了在细胞外基质上成功形成的管状结构A）以及GFR细胞外基质（B）。相互连接的管状网络清晰表明，这些 HUVECs 中的管状结构生长状态良好。比例尺 = 10 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2. CXCR2 抑制剂 SB225002（5.6 µM）在细胞外基质和生长因子减少型（GFR）细胞外基质上抑制管状结构形成。 两幅图像显示了在细胞外基质（A）和 GFR 细胞外基质（B）上，CXCR2 抑制剂 SB225002（5.6 µM）抑制了管状结构的形成。本图像中可见孤立的 HUVEC 细胞团块，表明这些细胞无法形成相互连接所需的管状结构。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 在生长因子减少型（GFR）细胞外基质上的趋化因子受体CXCR2抑制剂剂量反应曲线。 X轴显示管状结构长度，Y轴显示CXCR2抑制剂的浓度。该剂量反应曲线表明，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在GFR细胞外基质上对CXCR2抑制剂的反应呈剂量依赖性。IC50（半最大抑制浓度）通过软件13计算得出，可与其他细胞外基质条件下的剂量反应曲线进行比较。IC50是指将细胞反应降低50%所需的抑制剂浓度。误差线表示标准差。
| 生长因子减少型（GFR）细胞外基质 及抑制剂 （每组4个重复） | 管状结构总长度平均值（像素） （1像素=0.34 µm） | 标准差 | P 值 |
| GFR细胞外基质对照组 | 2447 | 168.174 | |
| GFR细胞外基质 + 0.56 µM SB225002 | 1422.5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR细胞外基质 + 1.1 µM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2.14 x 10-5 |
| GFR细胞外基质 + 5.6 µM SB225002 | 519.25 | 129.6368 | 4.19 x 10-6 |
| GFR细胞外基质 + 11 µM SB225002 | 393.75 | 212.6857 | 1.21 x 10-5 |
表1. 在不同条件下测定生长因子还原型（GFR）细胞外基质上的总管状结构长度。 该表格部分展示了在含有不同浓度CXCR2抑制剂的GFR细胞外基质上培养的样本中记录的总管状结构长度数据。结果表明，CXCR2抑制剂确实能够抑制管状结构的形成。表格中还包括相关数值，如四个重复样本的平均值、标准差以及P值。测量单位为像素，用于表示导出的数据。可通过统计软件13计算IC50。（1像素 = 0.34 µm）
讨论
进行该实验时，除非另有说明，必须始终将细胞外基质置于冰上或4 °C环境中。如果细胞外基质温度超过4 °C，将会发生聚合，导致实验失败。此外，出于上述原因，任何与细胞外基质接触的物品（例如移液器吸头、培养板）都必须预先冷却。每个孔中接种的细胞数量也至关重要：细胞过少将无法在对照样本中形成预期的网状结构，而细胞过多则会形成大的细胞簇或单层细胞，导致实验无效。该实验成功与否的另一个重要因素是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的传代次数。传代次数应始终低于十代，否则可能无法形成稳定的管状结构。此外，应确保所使用的细胞培养基未过期，否则细胞将失去活性。作为替代方案，可将培养基及其组分分装后于-20 °C保存，以在过期后的一段时间内维持其有效性。当然，仍建议在培养基有效期内使用。
与其他实验方法一样，内皮细胞成管实验也存在一些缺点。一个主要问题是，由于存在不同类型的内皮细胞和支持基质，实验结果会因所使用的细胞类型和基质的不同而产生显著差异。所使用的内皮细胞（如 HUVECs、HAECs 或 HMVECs）均为原代细胞，获取成本较高，且与永生化细胞相比具有更大的变异性。原代细胞可用于传代的次数有限，因此不适用于长期的血管生成实验14。为了获得可靠的数据，应始终在实验中使用相同类型的细胞和基质。与其他体外（in vitro）实验一样，成管实验的结果需要在体内（in vivo）进行验证，因为在二维组织培养的受控且人工的条件下获得的结果，未必能反映在活体生物复杂的生物系统中的真实情况。还需要注意的是，该类实验仅可用于检测内皮细胞的成管能力，不应被用于检测其他非内皮来源的成管细胞。
该检测是一种相对简单且快速的定量化合物促血管生成潜力的方法。它还可作为进一步实验的平台，因为单独使用时，无法提供关于该化合物影响血管形成过程的具体机制的信息。然而，使用不同的细胞外基质是一种较少见但可进一步构建研究问题框架的示例。研究该化合物特定生化机制的方法包括使用靶向血管生成通路组分的特异性抑制剂。另一种方法可能是从内皮细胞中提取RNA，并利用实时定量PCR（Real Time PCR）12分析基因表达的变化，这些变化可能引起检测中观察到的生长行为。该方法的未来应用包括转染HUVECs以构建针对血管生成通路特定步骤的基因敲低检测。该方法也有潜力应用于研究淋巴管生成通路。通过改变细胞外基质的组分，可进一步阐明基质与支持癌症中血管生成的细胞过程之间的相互作用。在这些特定条件下从内皮细胞中提取RNA和蛋白质，可提供与成像数据相对应的额外可量化数据。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由密歇根州底特律市韦恩州立大学医学研究与教育基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EGM-2 完全生长培养基（EGM-2 子弹头试剂盒 CC-3162） | Fisher | NC9525043 | HUVEC 完全生长培养基：由 EGM-2 基础培养基混合 BBE（牛脑提取物）、hEGF（人表皮生长因子）、氢化可的松、GA-1000（庆大霉素、两性霉素-B）、2% FBS（胎牛血清）、VEGF（血管内皮生长因子）、hFGF-β（人成纤维细胞生长因子 β）、R3-IGF-1（长 R 胰岛素样生长因子-1）、抗坏血酸和肝素组成。分装培养基及其组分，于 -20 °C 保存，使用前在 37 °C 复温。 |
| MATRIGEL 基质 10 mL 生长因子减少型（GFR）；10 mL；无 LDEV | Fisher | CB-40230 | 生长因子减少型（GFR）细胞外基质，于 -20 °C 保存，使用前在 4 °C 复温。 |
| MATRIGEL 基质 10 mL；10 mL；无 LDEV | Fisher | CB-40234 | 细胞外基质，于 -20 °C 保存，使用前在 4 °C 复温。 |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 抑制剂，于 -20 °C 保存，使用前在室温复温。 |
| 原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | ScienCell Research Laboratories | 8000 | 按照参考文献 10 进行培养。 |
| 含酚红的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | 于 4 °C 保存，使用前在 37 °C 复温。 |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | 倒置研究用显微镜。 | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 位 | Nikon | 倒置研究用显微镜软件 | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | 科学二维绘图与统计分析软件，用于计算 IC50。 |
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