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方法文章

利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

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DOI：

10.3791/54093

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2016年8月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。

摘要

基于人群和家系的遗传学研究通常能够鉴定出在统计学上与临床疾病或表型相关联的遗传变异。对于许多疾病和性状而言，大多数变异位于非编码区，因此可能通过影响基因表达的细微且相对难以预测的调控机制发挥作用。本文介绍一种用于优先筛选非编码变异并检测其功能的通用策略。该策略包括利用功能基因组学数据库进行计算优先排序，随后通过实验分析转录因子（TFs）对风险等位基因与非风险等位基因的差异结合能力。在对遗传变异进行电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）时，均使用合成的DNA寡核苷酸（oligo）来鉴定疾病或表型相关细胞核裂解液中的结合因子。在EMSA中，带有或不带有结合核因子（通常是转录因子）的寡核苷酸通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（使用TBE缓冲体系）进行分离分析。在DAPA中，寡核苷酸被固定于磁性柱上，特异性结合DNA序列的核因子被洗脱后，通过质谱分析，或经还原性SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析。这一通用方法可广泛应用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。

引言

基于测序和基因分型的研究，包括全基因组关联研究（GWAS）、候选位点研究以及深度测序研究，已鉴定出许多在统计学上与疾病、性状或表型相关的遗传变异。与早期预测相反，其中大多数变异（85–93%）位于非编码区，且不改变蛋白质的氨基酸序列1,2。解读这些非编码变异的功能，并确定将其与相关疾病、性状或表型联系起来的生物学机制，已被证明具有挑战性3-6。我们开发了一种通用策略，用于鉴定将遗传变异与一个重要中间表型——基因表达——联系起来的分子机制。该流程专门设计用于识别遗传变异对转录因子（TF）结合的调控作用。该策略结合了计算方法与分子生物学技术，旨在通过in silico方法预测候选变异的生物学效应，并通过实验手段对这些预测结果进行验证（图1）。

功能基因组学变异优先级排序示意图；EMSA、DAPA、qPCR、eQTL；差异结合研究。
图 1： 非编码遗传变异分析的策略性方法。 未包含在本论文相关详细方案中的步骤以灰色阴影表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

在许多情况下，首先扩展变异位点列表非常重要，需纳入所有与每个统计学相关变异位点处于高连锁不平衡（LD）状态的变异。LD 是衡量两个不同染色体位置上等位基因非随机关联程度的指标，可通过 r 值进行量化。2 统计量7. r2 是衡量两个变异位点间连锁不平衡程度的指标，其中 r2 = 1，表示两个变异位点之间完全连锁。处于高连锁不平衡（LD）的等位基因在不同祖先群体中倾向于在同一染色体上共分离。当前的基因分型芯片并未包含人类基因组中所有已知的遗传变异，而是利用人类基因组中的连锁不平衡结构，选择一部分已知变异作为特定LD区域中其他变异的代表（标签变异）。8因此，一个本身没有任何生物学效应的变异可能由于与致病变异（即具有明确生物学效应的变异）处于连锁不平衡（LD）状态，而被错误地关联到某种特定疾病。在操作上，建议采用1,000基因组计划的最新版本数据进行转换9 将变异位点调用文件（VCF）转换为与PLINK兼容的二进制文件10,11，一种用于全基因组关联分析的开源工具。随后，所有其他与LD r具有连锁不平衡的遗传变异2 >0.8，每个输入的遗传变异均可被识别为候选者。在此步骤中使用适当的参考群体至关重要。 例如，如果在欧洲血统受试者中发现某个变异，则应使用具有相似血统受试者的数据进行连锁不平衡扩展。

连锁不平衡扩展通常会产生数十个候选变异位点，其中可能仅有少数变异参与疾病机制。通常情况下，对这些变异位点逐一进行实验验证是不可行的。因此，利用数千个公开可用的功能基因组数据集作为筛选手段，以优先排序这些变异位点，具有重要意义。例如，ENCODE联盟12已开展了数千次ChIP-seq实验，描述了转录因子（TFs）和共调节因子的结合情况，以及多种背景下的组蛋白修饰状态，同时还包括来自DNase-seq13、ATAC-seq14和FAIRE-seq15等技术的染色质可及性数据。诸如UCSC基因组浏览器16、Roadmap表观基因组计划17、Blueprint表观基因组计划18、Cistrome数据库19和ReMap数据库20等数据库和网络服务器，提供了这些及其他实验技术在多种细胞类型和条件下所产生的数据的免费访问。当候选变异数量过多而无法全部进行实验验证时，可利用这些数据优先筛选出位于相关细胞和组织类型中潜在调控区域内的变异位点。此外，若某一变异位于特定蛋白的ChIP-seq信号峰区域内，这些数据还可为可能受影响的特定转录因子（TFs）或共调节因子的结合提供潜在线索。

接下来，通过实验筛选上述获得的优先变异位点，利用电泳迁移率变动分析（EMSA）21,22 验证预测的基因型依赖性蛋白质结合。EMSA通过非还原性TBE凝胶检测寡核苷酸迁移率的变化。将荧光标记的寡核苷酸与核裂解液孵育，核因子的结合会减缓寡核苷酸在凝胶中的迁移。因此，结合了更多核因子的寡核苷酸在扫描后会呈现出更强的荧光信号。值得注意的是，EMSA无需对结合能力可能发生变化的具体蛋白质进行预测。

一旦鉴定出位于预测调控区域且能够差异性结合核因子的变异，即可采用计算方法预测其可能影响的特定转录因子（TF）。我们倾向于使用 CIS-BP23,24、RegulomeDB25、UniProbe26 和 JASPAR27 进行预测。在确定候选转录因子后，可利用针对这些转录因子的抗体通过 EMSA-超迁移实验（EMSA-supershift）和 DAPA-Western 实验进行特异性验证。EMSA-超迁移实验是在核裂解液与寡核苷酸反应体系中加入转录因子特异性抗体。EMSA-超迁移实验的阳性结果表现为EMSA条带进一步上移或条带消失（详见参考文献28的综述）。在互补的DAPA实验中，将含有目标变异及其上下游各20个碱基的5'-生物素标记寡核苷酸双链与相应细胞类型的核裂解液共同孵育，以捕获特异性结合该寡核苷酸的核因子。利用链霉亲和素磁珠在磁力柱中固定寡核苷酸双链-核因子复合物，随后通过洗脱直接收集结合的核因子29,48。然后可通过Western blotting使用针对目标蛋白的特异性抗体检测结合情况，从而验证预测结果。在缺乏明确预测结果或预测过多的情况下，可将DAPA实验中变异序列pull-down所得的洗脱物送至蛋白质组学核心平台，通过质谱分析鉴定候选转录因子，之后再利用上述方法进行验证。

在本文的其余部分，提供了遗传变异的 EMSA 和 DAPA 分析的详细实验方案。

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方案

1. 溶液与试剂的配制

  1. 订购用于 EMSA 和 DAPA 的定制 DNA 寡核苷酸探针。
    1. 为减少非特异性蛋白结合，设计短寡核苷酸（长度在 35-45 个碱基对 (bp) 之间）30，并将感兴趣的变异位点直接置于其两侧各 17 bp 内源性基因组序列的中心位置。对于 EMSA 寡核苷酸，添加 5' 荧光基团。对于 DAPA 寡核苷酸，添加 5' 生物素标签。
    2. 订购正义链及其反向互补链。或者，订购双链（预退火）寡核苷酸。命名寡核苷酸时，命名法应基于已确立的参考基因组。
      注：“风险”与“非风险”的指定可能因疾病和项目而异，而“参考”与“非参考”则具有更普遍的适用性。
    3. 寡核苷酸到货后，短暂离心使内容物沉淀，并用无核酸酶水重悬至终浓度为 100 µM。将重悬后的储存液于 -20 °C 保存。用铝箔包裹带有荧光基团标签的寡核苷酸以避光。
姓名序列
rs76562819_REF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAGAGTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAAC群体与家系遗传学研究通常能识别出与临床疾病或表型存在统计学关联的遗传变异。对于许多疾病和性状而言，大多数变异位于非编码区，因此很可能通过影响调控基因表达的、微妙且相对难以预测的机制发挥作用。本文描述了一种优先筛选非编码变异并检测其功能的通用策略方法。该方法包括利用功能基因组数据库进行计算优先排序，随后对风险等位基因与非风险等位基因的转录因子（TF）差异结合进行实验分析。对于遗传变异的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA），均使用合成的DNA寡核苷酸来鉴定疾病或表型相关细胞的核裂解物中的因子。在EMSA中，结合或未结合核因子（通常是转录因子）的寡核苷酸通过三硼酸-EDTA（TBE）聚丙烯酰胺凝胶的非变性电泳进行分析。在DAPA中，寡核苷酸结合到磁柱上，特异性结合该DNA序列的核因子被洗脱，并通过质谱分析或经还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后进行蛋白质印迹分析来鉴定。这一通用方法可广泛应用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。CTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAG群体与家系遗传学研究通常能识别出与临床疾病或表型存在统计学关联的遗传变异。对于许多疾病和性状而言，大多数变异位于非编码区，因此其作用机制可能在于影响调控基因表达的、微妙且相对难以预测的机制。本文描述了一种优先筛选非编码变异并检测其功能的通用策略方法。该方法包括利用功能基因组数据库进行计算机优先排序，随后通过实验分析转录因子（TFs）对风险等位基因与非风险等位基因的差异结合。无论是采用电泳迁移率变动分析（EMSA）还是DNA亲和沉淀分析（DAPA）来研究遗传变异，均使用合成的DNA寡核苷酸来鉴定疾病或表型相关细胞的核裂解物中的因子。对于EMSA，结合或未结合核因子（常为转录因子）的寡核苷酸通过非变性三硼酸-EDTA（TBE）聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。对于DAPA，寡核苷酸结合于磁柱上，特异性结合该DNA序列的核因子被洗脱，并通过质谱分析或经还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后进行蛋白质印迹分析。这一通用方法可广泛应用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAAC群体与家系遗传学研究通常能识别出与临床疾病或表型存在统计学关联的遗传变异。对于许多疾病和性状而言，大多数变异位于非编码区，因此很可能通过影响控制基因表达的、微妙且相对难以预测的机制发挥作用。本文描述了一种优先筛选非编码变异并检测其功能的通用策略方法。该方法包括利用功能基因组数据库进行计算机优先排序，随后对风险等位基因与非风险等位基因的转录因子（TF）差异结合进行实验分析。无论是采用电泳迁移率变动分析（EMSA）还是DNA亲和沉淀分析（DAPA）来研究遗传变异，都使用合成的DNA寡核苷酸来鉴定疾病或表型相关细胞的核裂解物中的因子。对于EMSA，通过在三硼酸-EDTA（TBE）聚丙烯酰胺凝胶上进行非变性电泳来分析结合或未结合核因子（通常是转录因子）的寡核苷酸。对于DAPA，将寡核苷酸结合到磁柱上，特异性结合该DNA序列的核因子被洗脱下来，并通过质谱分析，或在还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后进行蛋白质印迹分析。这一通用方法可广泛应用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。CTCTCTCATTAAGGCATTAC

表1：用于检测单核苷酸多态性差异结合性的EMSA/DAPA寡核苷酸设计示例。“REF”代表参考等位基因，“NONREF”代表非参考等位基因。“FOR”代表正向链，“REV”代表其互补链。单核苷酸多态性以红色显示。

  1. 在去离子水中制备终浓度为 10 mM HEPES (pH 7.9)、10 mM KCl 和 0.1 mM EDTA 的胞质提取 (CE) 缓冲液。
  2. 在去离子水中制备终浓度为 20 mM HEPES (pH 7.9)、0.4 M NaCl 和 1 mM EDTA 的核提取 (NE) 缓冲液。
  3. 在去离子水中制备终浓度为 10 mM Tris (pH 7.5-8.0)、50 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的退火缓冲液。

2. 从培养细胞制备核裂解物

注：本实验方案使用B淋巴细胞母细胞系进行了优化，但已在其他多种无关的贴壁/悬浮细胞系中测试，具有普适性。

  1. 使用含 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清及 1x 抗生素-抗真菌剂（含 100 单位/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 250 ng/ml 两性霉素 B）的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基培养 B 淋巴母细胞。
    1. 以 200,000–500,000 个活细胞/ml 的密度接种，将培养瓶置于 37 °C、5% 二氧化碳条件下，直立放置，瓶盖留有通气孔或略微松开。
      注：当 B 淋巴母细胞密度超过 1,000,000 个细胞/ml 时，其生长速度会减慢。可通过多次吹打使细胞团分散，并将细胞密度恢复至 200,000–500,000 个细胞/ml，以维持快速生长速率。
  2. 用 10 ml 冰预冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤培养细胞两次，于 4 °C、300 × g 离心 5 分钟，吸弃 PBS。
  3. 使用血细胞计数板计数细胞，并按每 107 个细胞使用 1 ml 冰预冷 PBS 的量重悬细胞沉淀。
    注：例如，若裂解 2 × 107 个细胞，则用 2 ml PBS 重悬。
  4. 将细胞悬液分装至 1.5 ml 微量离心管中，使每管含有 107 个细胞于 PBS 中。于 4 °C、3,300 × g 离心 2 分钟，吸弃 PBS。
  5. 使用前，向 CE 缓冲液工作液中加入 1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)、1x 磷酸酶抑制剂和 1x 蛋白酶抑制剂。用 400 µl CE 缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育 15 分钟。
  6. 加入 25 µl 10% Nonidet P-40，通过吹打混匀。于 4 °C 以最高转速离心 3 分钟。倾倒并弃去上清液。
  7. 使用前，向 NE 缓冲液工作液中加入 1 mM DTT、1x 磷酸酶抑制剂和 1x 蛋白酶抑制剂 。用 30 µl NE 缓冲液重悬细胞沉淀，并通过涡旋混匀。
  8. 于 4 °C 在管式旋转仪上或冰上孵育 10 分钟。于 4 °C、3,300 × g 离心 2 分钟。
  9. 收集澄清的上清液（核裂解物），分装后于 -80 °C 保存，以避免多次冻融可能导致蛋白质降解。留取 10 µl 等分试样，用于通过二喹啉甲酸 (BCA) 法31 测定蛋白质浓度。

3. 电泳迁移率变动分析 (EMSA)

  1. 制备寡核苷酸工作液与 EMSA 凝胶。
    1. 若订购的寡核苷酸为双链形式，解冻 100 µM 储存液，用退火缓冲液按 1:2,000 稀释，获得 50 nM 工作液。
    2. 若订购的寡核苷酸为单链形式，解冻 100 µM 储存液，用退火缓冲液按 1:10 稀释，获得 100 nM 工作液。将 100 µl 的 100 nM 互补链溶液在微量离心管中混合。
      1. 置于 95 °C 加热块中 5 分钟。关闭加热块，让寡核苷酸在使用前缓慢冷却至室温至少一小时。
    3. 预运行 EMSA 凝胶。
      1. 从预制 6% TBE 凝胶上取下梳子，用去离子水冲洗数次以去除孔中的缓冲液。通过将 50 mL 的 10x TBE 加入 950 ml 去离子水中，制备 1 L 的 0.5x TBE 缓冲液。
      2. 组装凝胶电泳装置，并向内槽注入 0.5x TBE 缓冲液以检查是否泄漏。若无缓冲液漏入外槽，则向外槽注入约三分之二体积的缓冲液。
      3. 以 100 V 电压预运行凝胶 60 分钟。
      4. 用 200 µl 的 0.5x TBE 缓冲液冲洗每个上样孔。
  2. 制备结合缓冲液主混合液。
    1. 用去离子水制备 10x 结合缓冲液，其终浓度为 100 mM Tris、500 mM KCl、10 mM DTT；pH 7.5。
    2. 在微量离心管中，配制一个包含所有反应共有试剂的主混合液（10 µl 10x 结合缓冲液、10 µl DTT/聚山梨酯、5 µl Poly d(I-C) 和 2.5 µl 鲑鱼精 DNA；表 2）。额外配制 10% 的量以补偿移液造成的体积损失。
试剂终浓度反应 #1反应 #2反应 #3反应 #4
超纯水至 20 µl 体积13.5 µl11.98 µl13.5µl11.98 µl
10x 结合缓冲液1x2 μl2 μl2 μl2 µl
DTT/TW-201x2 μl2 μl2 μl2 μl
鲑鱼精子 DNA500 ng/μl0.5 μl0.5 μl0.5 μl0.5 μl
1μg/μl Poly d(I-C)1 μg1 μl1 μl1 μl1 μl
核提取物 (5.26 ug/µl)8 μg-1.52 μl-1.52 μl
NE 缓冲液1.52 μl-1.52 μl-
参考等位基因寡核苷酸50 fmol1 μl1 μl--
非参考等位基因寡核苷酸50 fmol--1 μl1 μl

表2：EMSA反应体系设置示例。该表示例说明了用于验证转录因子与特定单核苷酸多态性之间存在基因型依赖性结合这一假设的EMSA实验。

  1. 向每个微量离心管中加入无核酸酶水，使加入所有试剂后的终体积为 20 µl。
  2. 向每个微量离心管中加入适量（5.5 µl）预混液。
  3. 向相应的微量离心管中加入 8 µg 核裂解物。设置不含核提取物的寡核苷酸管作为阴性对照（例如表 2，反应 #1 和反应 #3）。
    注：每个反应所需的最佳裂解物用量需通过滴定实验确定。通常，滴定 2-10 µg 的裂解物范围即可。
  4. 向相应的微量离心管中加入 50 fmol 寡核苷酸。轻弹混匀，短暂离心使内容物沉至管底。室温孵育 20 分钟。
    注：若尝试进行超迁移分析，应在加入寡核苷酸前，将裂解物混合物与抗体在室温下孵育 20 分钟。建议使用 1 µg 的 ChIP 级抗体以获得最佳效果。
  5. 向每个微量离心管中加入 2 µl 10x Orange Loading Dye。上下吹打混匀。
  6. 将样品上样至预电泳的 6% TBE 凝胶：上下吹打混匀样品，然后将每个样品分别注入独立的加样孔。在 80 V 电压下电泳，直至橙色染料迁移至凝胶长度的 2/3 至 3/4 处。此过程大约需要 60-75 分钟。
  7. 用凝胶刀撬开塑料胶盒取出凝胶，并将其置于装有 0.5% TBE 缓冲液的容器中以防干燥。
  8. 将凝胶置于红外及化学发光成像系统的扫描台表面，注意清除任何可能干扰成像的气泡或污染物。
  9. 使用扫描系统软件，点击“采集”选项卡，然后选择“绘制新区域”，在扫描台表面凝胶所在位置周围绘制一个选框。
  10. 在“采集”选项卡的“通道”部分，选择与寡核苷酸上荧光团标记波长相对应的通道。在“扫描仪”部分，点击“预览”进行低质量预览扫描。通过拖动预览图像周围的蓝色选框至待成像的凝胶区域来调整扫描区域。
    注：例如，如果使用标记有 700 nm 荧光团的寡核苷酸，请确保在扫描前选中“700 nm”通道。
  11. 在“扫描控制”部分，选择“84 µM”分辨率选项和“中等”质量选项。将焦距偏移设置为凝胶厚度的一半。注：例如，1 mm 厚的凝胶应使用 0.5 mm 的焦距偏移。
  12. 在“扫描仪”部分，点击“开始”以启动扫描。
    注：扫描过程中，通常可根据扫描系统制造商的说明手动调整亮度、对比度和色彩方案。
  13. 扫描完成后，选择“图像”选项卡，在“创建”部分点击“旋转或翻转”以校正方向。通过点击主菜单中的“导出”，然后选择“单图像视图”来保存图像文件。

4. DNA 亲和纯化实验 (DAPA)

  1. 制备 5 µM 寡核苷酸工作液。
    1. 若订购的寡核苷酸为双链形式，解冻 100 µM 储存液，用退火缓冲液按 1:20 稀释，获得 5 µM 工作液。
    2. 若订购的寡核苷酸为单链形式，解冻 100 µM 储存液，用退火缓冲液按 1:10 稀释，获得 10 µM 工作液。将 10 µl 的 10 µM 互补链相互混合。置于 95 °C 加热块中 5 分钟。关闭加热块，让寡核苷酸在使用前缓慢冷却至室温。
  2. 开始前，将结合缓冲液、低严谨性洗涤缓冲液、高严谨性洗涤缓冲液和洗脱缓冲液预热至室温。
    注：可在结合缓冲液、低严谨性洗涤缓冲液和高严谨性洗涤缓冲液中加入终浓度为 50 ng/mL 的 Poly d(I-C)，以减少蛋白质与寡核苷酸潜在的非特异性结合。
  3. 为每个变异体准备结合混合物。
    1. 将 1 体积的核裂解物与 2 体积的结合缓冲液混合。
      注：由于转录因子丰度不同，所需裂解物的量需通过实验确定。在大多数情况下，每柱使用 100-250 µg 核裂解物是足够的。
    2. 加入 1x 磷酸酶抑制剂、 1x 蛋白酶抑制剂和 1x 结合增强剂（可选），轻轻弹动试管数次混匀。
      注：100x 结合增强剂由 750 mM MgCl2 和 300 mM ZnCl2 组成。若转录因子与 DNA 的结合依赖于辅因子或还原剂，则添加结合增强剂。若此信息未知，也建议添加结合增强剂。
    3. 向各结合混合物中加入 10 µl 的 5 µM 生物素化捕获 DNA（50 pmol）。室温孵育 20 分钟。
      注：孵育时间和温度可能因转录因子而异，最佳值需通过实验确定。
  4. 加入 100 µl 链霉亲和素微珠。室温孵育 10 分钟。
  5. 对于每个待测的寡核苷酸探针，将一个结合柱置于磁力分离器中。在每个结合柱正下方放置一个微量离心管，并加入 100 µl 结合缓冲液冲洗柱子。
  6. 将各结合混合物的内容物分别移入不同的柱子中，待液体完全流经柱子进入微量离心管后再进行下一步。确保在柱子上标记用于结合混合物的变异体寡核苷酸。标记流穿样品，并更换新的微量离心管以收集低严谨性洗涤液。
  7. 向柱子中加入 100 µl 低严谨性洗涤缓冲液；等待柱储液槽排空。重复洗涤 4 次。标记低严谨性洗涤样品，并更换新的微量离心管以收集高严谨性洗涤液。
  8. 向柱子中加入 100 µl 高严谨性洗涤缓冲液；等待柱储液槽排空。重复洗涤 4 次。标记高严谨性洗涤样品，并更换新的微量离心管以收集预洗脱液。
  9. 向柱子中加入 30 µl 非变性洗脱缓冲液，静置 5 分钟。标记预洗脱样品，并更换新的微量离心管以收集洗脱液。
    注：此步骤不洗脱结合蛋白；其目的是洗去柱中残留的高严谨性缓冲液，并用洗脱缓冲液替换，以最大化洗脱效率。
  10. 额外加入 50 µl 非变性洗脱缓冲液以洗脱结合的转录因子。若需更高产量但浓度较低的洗脱液，可额外再加入 50 µl 非变性洗脱缓冲液并收集流穿液。
    注：通过质谱分析洗脱样品以确定结合转录因子的身份32。随后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法验证蛋白质组学结果33。若无质谱设备，可使用标准技术的银染法代替蛋白质印迹法，以确定显示基因型依赖性结合的蛋白质大小。利用此信息，从引言详述的计算方法预测的转录因子列表中缩小范围。

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结果

本节提供了进行 EMSA 或 DAPA 实验时预期结果的代表性示例，并描述了裂解液质量对实验结果变异性的影响。例如，已有研究表明，蛋白质样品经历多次冻融循环可能导致其变性。为了探究 EMSA 分析在这些“冻融循环”条件下的可重复性，将两种在单个遗传变异位点上不同的 35 bp 寡核苷酸探针，分别与同一批次的核裂解液共同孵育，该核裂解液按指定次数进行反复冻融。图 2 表明，将此特定的 B 淋巴细胞核提取物冻融多达 5 次，似乎并未影响蛋白质的完整性；然而，不同样本中核蛋白的稳定性存在差异，因此应针对所使用的每一种细胞系单独进行测试。此外，不同批次制备的核裂解液之间也可能存在差异。这种差异可能源于裂解前细胞所处的细胞周期阶段、细胞传代次数或其他因素，因此，为确保实验结果的真实性，应使用不同批次的裂解液重复 EMSA 实验结果。

此外，优化EMSA的信噪比也非常重要。其中，寡核苷酸浓度是一个关键变量。通过滴定不同量的寡核苷酸...

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讨论

尽管测序和基因分型技术的进步极大地提高了我们识别与疾病相关遗传变异的能力，但我们对这些变异所影响的功能机制的理解仍显滞后。造成这一问题的主要原因是，许多与疾病相关的变异位于基因组的非编码区，可能影响基因表达调控中较难预测的机制。本文介绍了一种基于EMSA和DAPA技术的实验方案，这两种分子工具可用于鉴定依赖基因型的转录因子（TF）结合事件，有助于阐明大量非编码变异的功能。尽管这两种技术此前已被广泛使用，但直到最近才被应用于转录因子结合的遗传变异分析。此外，只需对实验方案进行少量调整，EMSA还可用于分析遗传变异对RNA结合蛋白的影响36。

本文所展示的实验方案简单且易于操作；然而，在实验前仍需对某些部分进行额外考虑。首先，应通过严格的统计分析，初步生成一个待筛选的变异位点列表。此步骤中的任何错误都可能导致后续所有分析出现偏差，因为许多变异位点可能对核裂解液表现出不同的结合能力，但并不影响疾病风险。此外，使用与研究相关的细胞类型所获得的功能基因组学数据至关重要，因为使用无关的细胞类型可能导致转录因子（TF）结合位点预测出现假阳性结果。目前最广泛使用的功能基因组学...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Erin Zoller、Jessica Bene和Lindsey Hays在实验方案开发过程中提供的意见和指导。MTW的部分资助来自美国国立卫生研究院（NIH）R21 HG008186项目以及辛辛那提儿童医院研究基金会的受托人奖助金。ZHP的部分资助来自T32 GM063483-13项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
定制DNA寡核苷酸Integrated DNA Technologieshttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
氯化钾Fisher ScientificBP366-500KCl，用于毛细管电泳缓冲液
HEPES（1 M）Fisher Scientific15630-080用于毛细管电泳和核提取缓冲液
EDTA（0.5 M），pH 8.0Life TechnologiesR1021用于毛细管电泳、核提取和退火缓冲液
氯化钠Fisher ScientificBP358-1NaCl，用于核提取缓冲液
Tris-HCl（1 M），pH 8.0InvitrogenBP1756-100用于退火缓冲液
磷酸盐缓冲盐水（1×）Fisher ScientificMT21040CMPBS，用于细胞洗涤
DL-二硫苏糖醇溶液（1 M）Sigma646563还原剂
蛋白酶抑制剂混合物Thermo Scientific87786防止转录因子降解
磷酸酶抑制剂混合物 Thermo Scientific78420防止转录因子去磷酸化
Nonidet P-40替代物IBI ScientificIB01140NP-40，用于核提取
BCA蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23225用于测定蛋白浓度
Odyssey EMSA缓冲液试剂盒Licor829-07910包含所有必需的EMSA缓冲液
TBE凝胶，6%，12孔InvitrogenEC6265BOX用于EMSA
TBE缓冲液（10×）Thermo ScientificB52用于EMSA
FactorFinder起始试剂盒Miltenyi Biotec130-092-318包含所有必需的DAPA缓冲液
Licor Odyssey CLxLicor推荐用于DAPA/EMSA的扫描仪
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062含有10,000单位/毫升青霉素、10,000 µg/mL链霉素和25 µg/mL Fungizone®抗真菌剂
胎牛血清Gibco26140-079FBS，用于培养基
RPMI 1640培养基Gibco22400-071含有L-谷氨酰胺和25 mM HEPES

参考文献

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