Method Article

利用电泳迁移分析（EMSA）和筛选功能的非编码基因变异DNA的亲和沉淀试验（DAPA）

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一个战略计划和方案，用于识别影响转录因子 （TF） DNA 结合的非编码遗传变异。为基因型依赖性 TF DNA 结合的电泳迁移率变化测定 （EMSA） 和 DNA 亲和沉淀测定 （DAPA） 分析提供了详细的实验方案。

Abstract

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基于群体和家系的遗传研究通常会导致鉴定出与临床疾病或表型在统计学上相关的遗传变异。对于许多疾病和性状，大多数变异是非编码的，因此可能通过影响微妙的、相对难以预测的控制基因表达的机制来发挥作用。在这里，我们描述了一种一般的战略方法，用于确定非编码变体的优先级，并筛选它们的功能。这种方法涉及使用功能基因组数据库进行计算优先级排序，然后对转录因子 （TFs） 与风险和非风险等位基因的差异结合进行实验分析。对于遗传变异的电泳迁移率变化测定 （EMSA） 和 DNA 亲和沉淀测定 （DAPA） 分析，使用合成 DNA 寡核苷酸 （oligo） 来鉴定疾病或表型相关细胞的核裂解物中的因子。对于 EMSA，通过在三硼酸盐-EDTA （TBE） 聚丙烯酰胺凝胶上进行非变性电泳分析具有或不具有结合核因子 （通常是 TFs） 的寡核苷酸。对于 DAPA，寡核苷酸与磁柱结合，特异性结合 DNA 序列的核因子通过质谱法或还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 洗脱和分析，然后进行蛋白质印迹分析。这种通用方法可广泛用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。

Introduction

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测序和基因分型的基础研究，包括全基因组关联分析（GWAS），候选人基因研究和深测序研究，已经确定了在统计学上与疾病，性状或表型相关的许多基因变异。相反早期预测，大多数这些变体（85-93％）的分布在非编码区，并且不改变蛋白质1,2的氨基酸序列。解释这些非编码变体的功能和确定它们连接到相关的疾病的生物学机制，特征，或表型已被证明具有挑战性3-6。我们已开发，以确定链接变体的重要中间体的表型的分子机制的一般策略 - 基因表达。这条管线是专门设计来确定的TF由遗传变异体结合的调制。这一策略结合的目的是预测的计算方法和分子生物学技术在硅片的候选变体的生物学效应，并验证这些预测凭经验（ 图1）。

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图1: 对于不包含在这个手稿以灰色阴影相关的详细协议的非编码基因变异步骤的分析战略方针

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Protocol

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1.解决方案和试剂的制备

  1. 为了统一EMSA和DAPA使用定制的DNA寡核苷酸探针。
    1. 为了减少非特异性蛋白结合，设计短的寡核苷酸30，以及直接将感兴趣的变体在其17碱基对的内源性基因组序列侧接的中央（长度35-45碱基对（bp）之间）。对于EMSA寡核苷酸，加上5'荧光。对于DAPA寡核苷酸，加上5'生物素标记。
    2. 同时订购有义链及其反向互补链。另外，为了双工（退火前）寡核苷酸。当命名的寡核苷酸，立足于建立的参考基因组的术语。
      注:"风险"和"非风险"指定可以是疾病和具体项目，而"参考"和"非参考"更普遍相关。
    3. 一旦寡核苷酸的到来，简要地在不含核酸酶的水含量和重悬降速至100μ的终浓度，M。储存于-20℃的悬浮股票。用铝箔包裹保护标记与光荧光团的寡核苷酸。
名称 序列
rs76562819_REF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG 一个 G....

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Results

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在这一节中，关于裂解液的质量，其特征在于执行EMSA或dapA和变异当提供所期待的代表性结果。例如，已经提出，冻融蛋白样品多次可能导致变性。为了探索在这些"冻融"循环的上下文EMSA分析的再现性，二35沸点寡聚在同一遗传变异体不同，用核裂解物的单一批次解冻并重新冷冻用于指定量孵育。次图2表明，冷冻和解冻这个特定B淋巴细胞核提取物达5倍，对蛋白质的完整性似乎没有影响;然而，核蛋白质的稳定性通过样品而不同，并且因此，应在使用每个单独的细胞系测试。它也可能有不同批次prepar变异核裂解ations。是否该变化是由于之前的裂解，细胞传代次数，或其他因素，细胞周期的阶段，它使用裂解物的不同批次，以确保真正的结果是很重要的，以复制EMSA结果。

此外，以优化信噪比的EMSA是重要的。在这方面的一个重要的变量是寡聚浓度。寡（5-300飞摩尔）的量进行滴定，以评估不同量寡聚物如何影响该信号（ 图3）。

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Discussion

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虽然在测序和基因分型技术的进步大大提高了我们的能力，以找出与疾病相关的基因变异，我们了解这些变异影响的作用机制能力滞后。该问题的一个重要原因是，许多疾病相关变体位于在正对编码的基因组的区域，这有可能影响控制基因表达更难对预测的机制。在这里，我们提出了一种基于EMSA和DAPA技术，有价值的分子工具，用于识别基因型依赖TF绑定可能导致许多非编码变异体的功能活动的协议。虽然这两种技术已经在过去广泛使用，它们最近才适于结合的TF的基因变异分析。超越转录因子，EMSA也可用于分析遗传变异体上的RNA结合蛋白，只有轻微的调整，协议36的效果。

ove_content">本文中所呈现的协议是简单和容易执行;尽管如此，某些部分需要之前的实验首先附加考虑，重要的是通过执行严格的统计分析，以产生用于考虑变体的初始列表中这一步骤的错误。可以破坏所有下游的分析，因为很多变体可能差异绑定核裂解而不会造成疾病的风险。此外，在相关的细胞类型进行使用功能的基因组数据是至关重要的，因为不相关的细胞类型可以导致假阳性TF的产生约束力预测。目前，最广泛使用的功能基因组资源包括ENCODE 12和流程图表.......

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Disclosures

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作者什么都没有透露。

Acknowledgements

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我们感谢 Erin Zoller、Jessica Bene 和 Lindsey Hays 在协议开发中提供的意见和指导。MTW 部分得到了 NIH R21 HG008186和辛辛那提儿童医院研究基金会的受托人奖资助。ZHP 部分由 T32 GM063483-13 提供支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
定制 DNA 寡核苷酸集成 DNA 技术http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
钾Fisher ScientificBP366-500KCl，用于 CE 缓冲液
HEPES （1 M）FisherScientific15630-080用于 CE 和 NE 缓冲液
EDTA （0.5M），pH 值 8.0Life TechnologiesR1021用于 CE、NE 和退火缓冲液
氯化钠Fisher ScientificBP358-1NaCl，用于 NE 缓冲液
Tris-HCl （1M），pH 8.0InvitrogenBP1756-100用于退火缓冲液
磷酸盐缓冲盐水 （1x）Fisher ScientificMT21040CMPBS，用于细胞洗涤
DL-二硫苏糖醇溶液 （1 M）Sigma646563还原剂
蛋白酶抑制剂CocktailThermo Scientific87786防止 TFs
磷酸酶抑制剂混合物的分解代谢 Thermo Scientific78420防止 TF 去磷酸化
Nonidet P-40 替代IBI ScientificIB01140NP-40，用于细胞核提取
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23225用于测量蛋白浓度
Odyssey EMSA 缓冲液试剂盒Licor829-07910包含所有必要的 EMSA 缓冲液
TBE 凝胶，6%，12 孔用于 EMSAInvitrogenEC6265BOX
（10x）EMSAThermo ScientificB52
Miltenyi Biotec130-092-318包含所有必要的 DAPA 缓冲液
Licor Odyssey CLxLicor推荐用于 DAPA/EMSA
抗生素-抗真菌剂Gibco的扫描仪 15240-062含有 10,000 单位/ml 的青霉素，10,000 µg/ml 链霉素和 25 µ克/毫升 Fungizone®抗真菌性
胎牛血清Gibco26140-079FBS，用于培养基
RPMI 1640 培养基Gibco22400-071含有 L-谷氨酰胺和 25 mM HEPES
氯化TBE 缓冲液的 用于 FactorFinder 起始套件的

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

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Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

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