我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。
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方法文章
利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基于人群和家系的遗传学研究通常能够鉴定出在统计学上与临床疾病或表型相关联的遗传变异。对于许多疾病和性状而言，大多数变异位于非编码区，因此可能通过影响基因表达的细微且相对难以预测的调控机制发挥作用。本文介绍一种用于优先筛选非编码变异并检测其功能的通用策略。该策略包括利用功能基因组学数据库进行计算优先排序，随后通过实验分析转录因子（TFs）对风险等位基因与非风险等位基因的差异结合能力。在对遗传变异进行电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）时，均使用合成的DNA寡核苷酸（oligo）来鉴定疾病或表型相关细胞核裂解液中的结合因子。在EMSA中，带有或不带有结合核因子（通常是转录因子）的寡核苷酸通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（使用TBE缓冲体系）进行分离分析。在DAPA中，寡核苷酸被固定于磁性柱上，特异性结合DNA序列的核因子被洗脱后，通过质谱分析，或经还原性SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析。这一通用方法可广泛应用于研究与任何疾病、性状或表型相关的非编码遗传变异的功能。
引言
基于测序和基因分型的研究，包括全基因组关联研究（GWAS）、候选位点研究以及深度测序研究，已鉴定出许多在统计学上与疾病、性状或表型相关的遗传变异。与早期预测相反，其中大多数变异（85–93%）位于非编码区，且不改变蛋白质的氨基酸序列1,2。解读这些非编码变异的功能，并确定将其与相关疾病、性状或表型联系起来的生物学机制，已被证明具有挑战性3-6。我们开发了一种通用策略，用于鉴定将遗传变异与一个重要中间表型——基因表达——联系起来的分子机制。该流程专门设计用于识别遗传变异对转录因子（TF）结合的调控作用。该策略结合了计算方法与分子生物学技术，旨在通过in silico方法预测候选变异的生物学效应，并通过实验手段对这些预测结果进行验证（图1）。
图 1： 非编码遗传变异分析的策略性方法。 未包含在本论文相关详细方案中的步骤以灰色阴影表示。
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方案
1. 溶液与试剂的配制
- 订购用于 EMSA 和 DAPA 的定制 DNA 寡核苷酸探针。
- 为减少非特异性蛋白结合，设计短寡核苷酸（长度在 35-45 个碱基对 (bp) 之间）30，并将感兴趣的变异位点直接置于其两侧各 17 bp 内源性基因组序列的中心位置。对于 EMSA 寡核苷酸，添加 5' 荧光基团。对于 DAPA 寡核苷酸，添加 5' 生物素标签。
- 订购正义链及其反向互补链。或者，订购双链（预退火）寡核苷酸。命名寡核苷酸时，命名法应基于已确立的参考基因组。
注：“风险”与“非风险”的指定可能因疾病和项目而异，而“参考”与“非参考”则具有更普遍的适用性。 - 寡核苷酸到货后，短暂离心使内容物沉淀，并用无核酸酶水重悬至终浓度为 100 µM。将重悬后的储存液于 -20 °C 保存。用铝箔包裹带有荧光基团标签的寡核苷酸以避光。
| 姓名 | 序列 |
| rs76562819_REF_FOR |
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结果
本节提供了进行 EMSA 或 DAPA 实验时预期结果的代表性示例，并描述了裂解液质量对实验结果变异性的影响。例如，已有研究表明，蛋白质样品经历多次冻融循环可能导致其变性。为了探究 EMSA 分析在这些“冻融循环”条件下的可重复性，将两种在单个遗传变异位点上不同的 35 bp 寡核苷酸探针，分别与同一批次的核裂解液共同孵育，该核裂解液按指定次数进行反复冻融。图 2 表明，将此特定的 B 淋巴细胞核提取物冻融多达 5 次，似乎并未影响蛋白质的完整性；然而，不同样本中核蛋白的稳定性存在差异，因此应针对所使用的每一种细胞系单独进行测试。此外，不同批次制备的核裂解液之间也可能存在差异。这种差异可能源于裂解前细胞所处的细胞周期阶段、细胞传代次数或其他因素，因此，为确保实验结果的真实性，应使用不同批次的裂解液重复 EMSA 实验结果。
此外，优化EMSA的信噪比也非常重要。其中，寡核苷酸浓度是一个关键变量。通过滴定不同量的寡核苷酸.......
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讨论
尽管测序和基因分型技术的进步极大地提高了我们识别与疾病相关遗传变异的能力，但我们对这些变异所影响的功能机制的理解仍显滞后。造成这一问题的主要原因是，许多与疾病相关的变异位于基因组的非编码区，可能影响基因表达调控中较难预测的机制。本文介绍了一种基于EMSA和DAPA技术的实验方案，这两种分子工具可用于鉴定依赖基因型的转录因子（TF）结合事件，有助于阐明大量非编码变异的功能。尽管这两种技术此前已被广泛使用，但直到最近才被应用于转录因子结合的遗传变异分析。此外，只需对实验方案进行少量调整，EMSA还可用于分析遗传变异对RNA结合蛋白的影响36。
本文所展示的实验方案简单且易于操作；然而，在实验前仍需对某些部分进行额外考虑。首先，应通过严格的统计分析，初步生成一个待筛选的变异位点列表。此步骤中的任何错误都可能导致后续所有分析出现偏差，因为许多变异位点可能对核裂解液表现出不同的结合能力，但并不影响疾病风险。此外，使用与研究相关的细胞类型所获得的功能基因组学数据至关重要，因为使用无关的细胞类型可能导致转录因子（TF）结合位点预测出现假阳性结果。目前最广泛使用的功能基因组学.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Erin Zoller、Jessica Bene和Lindsey Hays在实验方案开发过程中提供的意见和指导。MTW的部分资助来自美国国立卫生研究院（NIH）R21 HG008186项目以及辛辛那提儿童医院研究基金会的受托人奖助金。ZHP的部分资助来自T32 GM063483-13项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制DNA寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl，用于毛细管电泳缓冲液 |
| HEPES（1 M） | Fisher Scientific | 15630-080 | 用于毛细管电泳和核提取缓冲液 |
| EDTA（0.5 M），pH 8.0 | Life Technologies | R1021 | 用于毛细管电泳、核提取和退火缓冲液 |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-1 | NaCl，用于核提取缓冲液 |
| Tris-HCl（1 M），pH 8.0 | Invitrogen | BP1756-100 | 用于退火缓冲液 |
| 磷酸盐缓冲盐水（1×） | Fisher Scientific | MT21040CM | PBS，用于细胞洗涤 |
| DL-二硫苏糖醇溶液（1 M） | Sigma | 646563 | 还原剂 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 87786 | 防止转录因子降解 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78420 | 防止转录因子去磷酸化 |
| Nonidet P-40替代物 | IBI Scientific | IB01140 | NP-40，用于核提取 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| Odyssey EMSA缓冲液试剂盒 | Licor | 829-07910 | 包含所有必需的EMSA缓冲液 |
| TBE凝胶，6%，12孔 | Invitrogen | EC6265BOX | 用于EMSA |
| TBE缓冲液（10×） | Thermo Scientific | B52 | 用于EMSA |
| FactorFinder起始试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-318 | 包含所有必需的DAPA缓冲液 |
| Licor Odyssey CLx | Licor | 推荐用于DAPA/EMSA的扫描仪 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | 含有10,000单位/毫升青霉素、10,000 µg/mL链霉素和25 µg/mL Fungizone®抗真菌剂 |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140-079 | FBS，用于培养基 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 22400-071 | 含有L-谷氨酰胺和25 mM HEPES |
参考文献
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Maurano, M. T., et al.
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重印与许可
