轴突导向分子调控神经元的迁移和生长锥的靶向导航。本文介绍了一种评估导向分子吸引或排斥神经元能力的强有力方法——条带实验。在本方案中，我们通过展示FLRT2排斥培养的海马神经元的能力，演示了条带实验的操作过程。
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摘要
摘要
轴突在生长过程中，其顶端会形成一种高度活跃的结构，称为生长锥。生长锥通过接触细胞外环境中的信号分子来引导轴突的生长方向。Netrin、slit、semaphorin 和 ephrin 是已知的导向分子，它们在与轴突表面的受体及共受体结合后，可吸引或排斥轴突。这些被激活的受体在生长锥内启动多种信号分子，从而改变神经元的结构与运动行为。本文详细描述了一种条带实验（stripe assay）的操作流程，用于评估某种导向分子对神经元的吸引或排斥能力。该方法中，将来自 E15.5 小鼠的海马神经元解离后，培养在经层粘连蛋白包被并制备成交替条带的培养皿上，条带分别为纤维连接蛋白与富含亮氨酸的跨膜蛋白-2（FLRT2）的胞外域融合蛋白，以及对照用的免疫球蛋白 G（IgG）片段可结晶区（Fc）蛋白。培养 24 小时后，轴突和细胞体均显著避开 FLRT2 包被的条带区域。通过 tau1 免疫染色显示，约 90% 的神经元分布在 Fc 包被的条带上，而分布在 FLRT2-Fc 包被条带上的神经元仅约 10%。该结果表明，FLRT2 对这些神经元具有强烈的排斥作用。这一高效的方法不仅适用于原代培养的神经元，还可广泛应用于其他多种细胞类型，例如神经母细胞。
引言
轴突导向是新形成的神经元在神经系统发育过程中将轴突引导至其靶标的生物学过程1,2。发育中的轴突在其顶端携带一种高度可移动的结构，称为生长锥。生长锥能够感知细胞外信号，从而引导轴突的行进路径。导向分子（如slit、semaphorin和ephrins）可根据其与轴突上相应受体及共受体的相互作用，对轴突产生吸引或排斥效应1,3,4。这些被激活的受体将信号传递至生长锥，进而影响其细胞骨架的组织状态，调控轴突和生长锥的运动。
已开发出多种方法用于评估引诱剂和驱避剂分子的作用。可将化学引诱剂和驱避剂以浓度梯度形式加入生长/培养基中（例如，Dunn小室或µ载片）5,6，通过微量移液器在高度集中的区域点样（例如，转向实验）7 或通过浴式给药实现均匀浓度（例如，生长锥塌陷实验）8,9.
其他方法包括条带实验或微接触印刷（µCP），其中将化学趋化剂或排斥剂作为底物涂覆在培养板表面10-12。条带实验最初由Bonhoeffer及其同事于1987年开发，用于分析鸡视网膜-顶盖系统中的拓扑映射13。原始方法需要使用真空系统，通过条状和网状基质将蛋白质涂覆到聚碳酸酯核孔膜上。在后续改进版本中，重组蛋白通过窄缝硅基质直接以条带模式印刷在培养板表面14,15。近年来，多个研究团队已成功将该条带实验应用于轴突导向分子活性的分析16-21。
本文介绍了用于检测轴突导向分子对离体海马神经元吸引或排斥作用的条带实验的详细方案。值得注意的是，该方法可在设备简单的实验室环境中应用。在本实验中，利用带有90 µm狭缝的硅胶膜，在塑料培养皿上生成交替排列的荧光标记底物与对照蛋白条带，并以层粘连蛋白进行包被。在我们的实验示例中，将来自E15.5小鼠的离体海马神经元培养在重组纤连蛋白与富含亮氨酸的跨膜蛋白-2（FLRT2）的胞外域（FLRT2）和对照Fc蛋白交替形成的条带上21。培养24小时后，神经元的轴突和胞体均显著避开FLRT2条带区域。使用抗Tau1抗体染色显示，约90%的神经元分布于Fc蛋白包被的区域，而仅有约10%位于FLRT2-Fc区域，表明FLRT2对海马神经元具有强烈的排斥作用21。
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方案
涉及动物受试者的实验程序已获得滨松医科大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 基质的制备
- 将4-8个硅胶基质在微波炉或电热板上煮沸5分钟，然后在层流条件下干燥1小时（条纹面朝上）。
注意：以下操作均应在层流条件下进行。 - 使用压缩空气吹扫，或用透明胶带粘除基质条纹面上的任何灰尘。保持条纹面清洁，以确保其能牢固地贴附于培养皿表面。
- 将基质小心地放置于6 cm塑料培养皿上，用手指轻压固定（每个培养皿放置一个基质，条纹面朝下）。避免基质与培养皿之间产生气泡。在培养皿底部标记条纹的位置。
- 若基质未能成功贴附，请从步骤1.2重新开始。
2. 神经元培养的条带生成与层粘连蛋白包被
- 通过将Fc标签蛋白（10–50 µg/ml）与荧光染料标记的抗人Fc抗体（1:3比例，30–150 µg/ml）在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，制备荧光标记的重组蛋白（用于注射时每份25 µl [步骤2.2]，用于放置法时每份100 µl [步骤2.2.1]）。然后在室温下孵育30分钟。
- 使用22号注射器，将上一步（2.1）制备的25 µl重组蛋白通过基质侧面的小孔注入（见图1A、1C和1E中的箭头所示）。
- 或者，将100 µl重组蛋白加入基质顶部的狭缝中，并从小孔（见图1A、1C和1E中的箭头所示）吸出约一半溶液，使重组蛋白保留在条带区域。
- 将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育30分钟。
- 向顶部狭缝中加入300 µl PBS（见图1B），并从基质侧面的小孔（见图1A、1C和1E中的箭头所示）吸出液体，以去除未结合的重组蛋白。不要完全吸干PBS，以免蛋白干燥。重复此步骤两次（共三次）。
- 小心取出基质，并立即加入约100 µl对照蛋白（10–50 µg/ml；Fc），覆盖整个条带区域，形成交替包被。然后将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤培养皿表面三次后，在PBS中加入约100 µl浓度为20 µg/ml的层粘连蛋白进行包被。
注意：层粘连蛋白应在冰上解冻，以防止凝固。 - 将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育1小时。
- 用PBS洗涤培养皿表面三次，加入培养基。将包被好的培养皿连同培养基一起置于37 °C、5% CO2的培养箱中，待用。
3. 从E15.5小鼠胚胎中培养海马神经元
- 通过颈椎脱臼法处死母鼠，并分离三只 E15.5 胚胎。
- 用剪刀沿头部正中矢状面剪开皮肤和颅骨，用小勺取出脑组织。将脑组织小心转移至含有 3 ml Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的 60 mm 培养皿中。
- 使用解剖刀切取包含皮层、海马和纹状体的半球组织（图 2A）。随后，仔细剥离脑膜，分离出海马区域，并将分离的海马组织转移至一个含有 2 ml HBSS 溶液并置于冰上的 15 ml 离心管中（图 2B-C）。从 3 个胚胎中共收集 6 个海马组织，足以用于 8 个培养皿的神经元培养。
- 将 HBSS 溶液替换为胰蛋白酶/EDTA 溶液（2 ml），并将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。
注意：无需离心，直接吸除 HBSS，且不得通过倾斜离心管倾倒去除 HBSS 溶液。 - 加入 500 µl 胎牛血清（FBS）以中和胰蛋白酶活性。
- 以 100 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，并用 2 ml 培养基洗涤沉淀。重复此步骤一次。
- 使用带有大孔的 1,000-µl 枪头（剪切枪头）在培养基中上下吹打海马组织 10 次，以解离组织。
- 更换为常规（未剪切）的 1,000-µl 枪头，继续上下吹打解离后的组织，以获得单细胞悬液。
- 将细胞悬液通过 80–100 µm 孔径的细胞筛网过滤，以分离单个细胞。
- 将过滤后的单细胞悬液以 150 × g 离心 5 分钟。
- 通过抽吸去除上清液，并将沉淀（神经元）重悬于 2 ml 培养基中。
- 使用血细胞计数板结合台盼蓝染色计数细胞，以确定细胞密度和活力。随后，将 10,000 个神经元接种于每组条带区域，每份接种体积为 150 µl 培养基。悬液应小心加入，确保完全覆盖整个条带区域。
4. 使用抗Tau1抗体通过免疫荧光染色可视化细胞体和轴突
- 培养24小时后，吸除培养基，注意不要扰动贴壁细胞，用预热的4%多聚甲醛（PFA）/4%蔗糖/PBS在室温下固定神经元 15分钟。
- 用 PBS 清洗平板表面 3 次。如有需要，可使用防水笔在条带区域周围画圈，以减少所需抗体的用量。
- 用 0.3% Triton X-100/PBS 对神经元进行透化处理，持续 5 分钟。
- 将神经元与含3%驴血清和0.1% Triton X-100的封闭液在室温下孵育30分钟，随后在4 °C下用含1%驴血清、0.1% Triton X-100的PBS稀释的Tau1抗体（1:200）孵育过夜。
- 用 PBS 清洗平板表面 3 次。在含 1% 牛血清白蛋白（BSA）/0.1% Triton X-100 的 PBS 中，加入荧光染料标记的抗小鼠 IgG 抗体，与神经元在室温下孵育 30 分钟。
- 用 PBS 清洗平板表面 3 次。使用 50 µl 抗荧 quench 溶液，将 18 mm × 18 mm 盖玻片覆盖在条带区域。避免产生气泡，以免干扰成像。
- 使用合适的系统，通过荧光显微镜获取荧光图像， 例如，10倍物镜，GFP和RFP滤光片组，1,000毫秒曝光时间（图3).
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结果
将E15.5小鼠的海马神经元解离后接种，并在荧光标记的对照Fc（图3A-C）或FLRT2-Fc（图3D-F）与非标记对照Fc交替排列的条带表面培养24小时。在两种情况下，神经元均发生聚集并以束状形式延伸其轴突。在对照Fc/Fc条带表面，神经元均匀分布在荧光标记与非标记的条带上，其轴突朝随机方向延伸（图3A-C）。相比之下，在FLRT2-Fc/Fc条带表面培养时，轴突避免在FLRT2-Fc区域生长，因此延伸的轴突主要位于对照Fc区域（图3D-F）。值得注意的是，神经元胞体和轴突均被FLRT2-Fc排斥，导致轴突沿条带平行方向延伸。图3D''-F''显示轴突沿对照Fc与FLRT2-Fc之间的边界生长，但未延伸至FLRT2-Fc区域内部。
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讨论
本实验方案描述了一种条带实验，该实验使用重组蛋白以及来自E15.5小鼠海马体的离体神经元。该实验能够高效地观察神经元对以条带模式排列的特定重组蛋白所产生的排斥性、趋近性或中性反应。本方案的主要优势在于生成条带的方法简便，即直接将蛋白打印到塑料培养皿表面，而传统方法则需要特殊基质、真空系统以及核孔膜20,21。制备蛋白条带时，可通过基质上的小孔注入标记的重组蛋白，或在基质顶部的狭缝中加入较大样本（约100 µl），随后通过小孔小心吸除多余的缓冲液和未结合的蛋白。
该方法的另一个优势在于，单次实验中可同时观察大量神经元，并能对多个生长锥进行同步分析21。相比之下，传统的转向实验仅能观察单个神经元和单个生长锥。神经元可感知排斥性分子FLRT2，并迁离FLRT2-Fc条带区域21。可在神经元中表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）等报告分子，以在地毯样背景颜色中清晰识别神经元，从而实现实时观察，无需进行免疫染色。除Fc标签外，也可使用FLAG、Myc和His等其他标签，并通过相应的荧光标记抗标签抗体进行识别（步骤...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本促进科学振兴会科学研究费补助金（编号：23700412、25122707 和 26670090，授予 S.Y.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 离心管 | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗人 IgG 抗体 | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 抗体 | Thermo Scientific | A-21203 | 稀释比例 1/500 |
| Anti-Tau1 抗体 | Chemicon | MAB3420 | 稀释比例 1/200 |
| 抗荧光淬灭剂 | Thermo Scientific | P7481 | 可使用其他封片介质 |
| B27 添加剂 | Thermo Scientific | 17504-044 | 稀释比例 1/50 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | 01-2030-2 | |
| 100 µm 细胞滤网 | BD Falcon | 352360 | |
| 离心机 | Kubota | 2410 | |
| 盖玻片 18 mm × 18 mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO 防水笔 | DAKO | S2002 | 可使用其他防水笔 |
| 一次性手术刀 | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | E600 | |
| 5 号镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | 稀释比例 1/100 |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | 805N | 22 号针头，50 µL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| 人 IgG Fc 片段 | Jackson | 009-000-008 | |
| 层粘连蛋白 | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| 正常驴血清 | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Scientific | 15070-063 | 稀释比例 1/100 |
| 塑料培养皿，60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 硅胶模具 | 可从 Martin Bastmeyer 教授处获取并购买（bastmeyer@kit.edu） | ||
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 枪头，1000 µL | Watson | 125-1000S | |
| 透明胶带 | Tesa | 57315 | 可使用其他透明胶带 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 台盼蓝，0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| 培养基 | Neurobasal 培养基添加 B27、GlutaMAX 和青霉素-链霉素。 |
参考文献
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