一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

摘要

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。

摘要

研究单个细胞的异质性对许多生物学问题至关重要，但在技术上具有挑战性。因此，亟需一种简单且高通量的方法来开展单细胞培养实验。本文报道了一种基于微流控芯片的策略，可实现高效的单细胞分离（约77%），并展示了其在长期单细胞培养（长达7天）以及通过克隆形成实验进行细胞异质性分析方面的能力。该方法已在KT98小鼠神经干细胞以及A549和MDA-MB-435人癌细胞中得到验证。通过在微流控通道的顶部和底部使用不同尺寸的微孔阵列，实现了高单细胞分离效率和长期培养能力。其中，小型微孔阵列用于精确分离单个细胞，而大型微孔阵列则用于在微流控芯片内进行单细胞克隆培养。该微流控平台因其可在不降低分离效率的前提下灵活调节细胞培养空间以适应不同的培养策略，成为单细胞培养应用中一种极具吸引力的技术方案。

引言

目前，将单个细胞单独放置在培养空间中的方法通常采用有限稀释法或荧光激活细胞分选（FACS）。对于许多实验室而言，有限稀释法是一种便捷的方法，因为它仅需要移液器和组织培养板，而这些设备容易获得。在此方法中，细胞悬液被连续稀释至适当的细胞密度，然后使用手动移液器将其加入培养孔中。这些分隔的单细胞随后可用于细胞分析，例如遗传异质性筛选¹和克隆形成分析²。然而，该方法通量较低且劳动强度大，若无机械臂辅助则难以提高效率，因为有限稀释法的泊松分布特性限制了单细胞事件的最大概率仅为37%³。配备集成机械臂的FACS仪器可通过精确地逐次将一个单细胞放入培养孔中来克服泊松分布的限制⁴。然而，较高的机械剪切应力（从而导致细胞活力降低）⁵以及仪器购置和运行成本，限制了其在许多实验室中的应用。

为克服上述局限性，已开发出微尺度装置，可高效地将单个细胞装载到微孔中⁶。然而，由于需要将每个微孔的尺寸设计得接近单个细胞的大小，以最大化单细胞装载概率，因此微孔无法为已装载的细胞提供足够的增殖空间。在许多基于细胞的应用中（例如，克隆形成实验⁷）需要进行培养检测，因此也已采用尺寸更大的微孔（直径或边长为 90 - 650 µm）以支持长期细胞培养。然而，与极限稀释法类似，这些大微孔的单细胞装载效率仍然较低，仅为 10 - 30%^8,....

方案

注意：我们微流控器件制造所用的光掩模设计是通过计算机辅助设计（CAD）软件绘制的。随后，这些设计被用于通过商业服务来制作铬光掩模。PDMS 器件采用软光刻技术制备。¹¹

1. 通过光刻法制作母模

1. 在光刻工艺之前¹²，使用4英寸硅片作为基底，并将硅片置于常规烘箱中于120 °C下脱水10分钟。
2. 使用等离子清洗机，在100瓦功率下进行30秒的氧气等离子体处理，以清洁已脱水的硅片。
3. 分别将两块加热板预热至65 °C和95 °C，用于后续的烘烤过程。
4. 使用旋涂仪在清洁后的硅片上涂覆5 g负性光刻胶（PR）；以1,200 rpm（SU-8 50）旋涂30秒，形成微通道层。
5. 将涂有光刻胶的硅片置于预热至65 °C的加热板上保持12分钟，随后转移至另一块预热至95 °C的加热板上保持33分钟（适用于100 µm厚的图案），完成软烘过程。
6. 烘烤完成后，将涂有光刻胶的硅片放置在半自动掩模对准器的样品台上，并与分辨率为25,400 dpi的透明光掩模进行对准。
7. 将涂有光刻胶的硅片暴露于紫外光（365 nm）下，剂量为500 mJ/cm²，以在硅片上形成光刻胶图案。
8. 从对准器中取出硅片，并将其放置在加热板上于95 °C下后烘12分钟。
9. 将硅片浸入SU-....

结果

用于单细胞分离与培养的微流控平台包含一个微通道（高度为 200 µm），该通道内设有两组微孔阵列（图 2A）。这两组微孔阵列分别称为捕获孔（直径 25 µm，深度 27 µm）和培养孔（直径 285 µm，深度 300 µm），分别用于单细胞的分离与培养；从顶视图观察时，每个捕获孔位于对应培养孔的中心位置（图 2B）。该装置的操作流程示意图见图 1，所需设备（注射泵、组织培养孵育箱和显微镜）及耗材（注射器、移液器和管路）均为生物实验室常见配置。此外，该平台具有便携性和透明性，使得在细胞培养实验过程中，可使用常规显微镜对装置内的细胞进行便捷的观察与分析。

洗涤步骤后，捕获孔中细胞的捕获效率范围为 67.80 ± 11.38% 至 85.16 ± 1.91%（取决于细胞类型）（图 3A）。此外，三种细胞类型中大多数捕获孔仅.......

讨论

基于微孔的装置系统^6,14已被用于单细胞操作与分析，例如大规模单细胞捕获⁶以及单个造血干细胞增殖¹⁵。尽管微孔的尺寸、数量和形状可根据特定应用进行调整，但当微孔尺寸增大时，单细胞分离效率总会受到影响^9,15。

为克服这一局限性，Park 等 报道了一种带有三角形微孔的微流控芯片，该芯片具有较高的单细胞捕获率（58.34%），同时扩大了微孔尺寸，以允许细胞铺展和生长。然而，这些微孔（边长约50 µm）仅能支持细胞增殖达2天¹⁶。我们的双孔策略使得在大尺寸微孔中进行单细胞加载不再受限于极限稀释法和开放孔系统中所遇到的泊松分布概率问题³，如在尺寸足以支持细胞增殖至少7天的大微孔中实现了高单细胞分离效率（超过75%）所示（图4A）。由于该微流控平台能够通过简单的装置和操作流程高效地完成单细胞分离与克隆培养，我们预计其可成为多种应用中的有力工具，包括通过克隆形成实验筛选肿瘤干细胞¹⁷以及药.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AutoCAD 软件	Autodesk	AutoCAD LT 2011	部件号 057C1-74A111-1001
硅晶圆	Eltech 公司	SPE0039
普通烘箱	YEONG-SHIN 公司	ovp45
等离子清洗机	Nordson	AP-300	台式等离子处理系统
SU-8 50 负性光刻胶	MicroChem	Y131269
SU-8 100 负性光刻胶	MicroChem	Y131273
旋涂仪	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
加热板	YOTEC 公司	YS-300S
掩模对准器	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 显影液	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	丙二醇单甲醚醋酸酯
扫描激光轮廓仪	KEYENCE	VK-X 100
三氯硅烷	Gelest, Inc	SIT8174.0	十三氟-1,1,2,2-四氢辛基。危险品。对呼吸道具有腐蚀性，遇水剧烈反应。
干燥器	Bel-Art Products	F42020-0000	节省空间型真空干燥器，190 mm 白色底座
聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 套件	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core 打孔器	Ted Pella Inc.	15072	内径 0.75 mm
可移除胶带	3M 公司	Scotch Removable Tape 811
体视显微镜	Leica Microsystems	Leica E24
牛血清白蛋白 (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM 基础培养基	Gibco	12800-017
胎牛血清	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
抗生素	Biowest	L0014-100	谷氨酰胺-青霉素-链霉素
重组酶混合物	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) 细胞膜染料	BD Biosciences	354218	用作细胞示踪剂
注射泵	Harvard Apparatus	703007
塑料注射器 (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 号钝头针	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
聚四氟乙烯 (PTFE) 管	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	内径 0.51 mm；外径 0.82 mm