小鼠瓣膜性心脏病全面表型特征的超声心动图方法与方案

摘要

本方案详细描述了用于小鼠心脏及心脏瓣膜功能全面表型分析的超声心动图方法。

摘要

本文及配套视频旨在概述在啮齿类动物中成像心脏瓣膜功能所采用的方法与策略，详细描述了合适的麻醉方法、超声心动图成像切面、图像采集时的成像平面与探头方向、数据分析方法，以及新兴技术在评估心脏和瓣膜功能方面的局限性。尤为重要的是，我们还指出了心脏及心脏瓣膜成像领域中若干值得未来深入研究的方向，这些方向有望被用于揭示临床前动物模型中瓣膜疾病发病机制的深层信息。我们提出，采用系统化的方法评估小鼠的心脏和心脏瓣膜功能，可获得更可靠且可重复的数据，并有助于发现基因修饰和/或生理应激小鼠中以往被低估的表型特征。

引言

衰老与心血管系统钙化程度的进行性增加相关¹。血流动力学显著的主动脉瓣狭窄影响超过65岁人群的3%²，即使为中度主动脉瓣狭窄（峰值流速为3-4 m/s）的患者，其5年无事件生存率也低于40%³。目前尚无有效治疗手段可延缓主动脉瓣钙化的进展，外科主动脉瓣置换术仍是晚期主动脉瓣狭窄唯一可用的治疗方法⁴。

旨在深入理解主动脉瓣钙化发生与进展机制的研究，是推动主动脉瓣狭窄药物治疗及非手术干预方法发展的关键第一步。^5,6基因改造小鼠在揭示多种疾病发生机制方面发挥了重要作用，如今正成为深入研究主动脉瓣狭窄生物学机制的前沿工具。^6,7,8与其他心血管疾病（如动脉粥样硬化和心力衰竭）不同，后者在评估血管和心室功能方面已有大体上成熟的标准操作流程，而本病则存在一些独特的挑战 体内 小鼠心脏瓣膜功能的表型分析。尽管近期的综述已对用于评估啮齿类动物瓣膜功能的多种成像和侵入性方法的优缺点进行了详....

方案

1. 准备材料和设备（表1和图1）

1. 打开超声设备。输入动物编号、日期和时间（用于序列成像实验）以及其他相关信息。
2. 使用高频超声探头，对体重小于约 20 g 的小鼠采用 40 MHz 探头，对体重大于约 20 g 的小鼠采用 30 MHz 探头。
3. 将平台连接至心电图（ECG）监测仪，以实现特定成像模式下的心电门控。
   注意：至关重要的是，此步骤还可实时计算心率（HR），心率可作为评估麻醉深度是否合适的多个指标之一。
4. 将平台预热至 37 °C。
   注意：所有市售超声设备均配备控制面板，提供 B 模式、M 模式和多普勒超声心动图的图像采集控制及研究管理控制功能。设备内置心脏测量工具，可自动测量和计算常用的心脏功能与瓣膜功能超声心动图参数。

2. 准备小鼠以进行成像及麻醉诱导

1. 用一只手轻轻抓住小鼠的尾巴，另一只手牢固地捏住其颈部背侧皮肤以固定动物。
2. 将小鼠的鼻部引导进入鼻罩，开始以1%异氟烷浓度输送麻醉气体。确保动物在接触气体后3–5秒内进入镇静状态。
3. 迅速而准确地将动物仰卧放置于成像平台，确保其前肢和后肢分别接触平台上的ECG传感器。
4. 使用胶带轻轻固定四肢，在鼻罩装置上轻贴胶带以稳定头部，并用胶带固定尾巴。前肢和后肢应平贴于传感器表面，以确保生理成像系统能够稳定、清晰地采集ECG....

结果

本文包含了动物心脏超声成像中常规获取的图像示例。文中提供了超声探头在动物胸部放置位置的示意图，以帮助读者清楚理解为获得所述图像时探头的具体位置。同时还附有超声实验室配置的照片，以强调正确设备的重要性，特别是所用超声探头以及麻醉方法。正常与异常瓣膜、左右心室及主动脉根部的二维/B模式、M模式、彩色多普勒和频谱多普勒图像均已正确标注。尽管应变率成像并不常规开展，本文也提供了一个示例。

二尖瓣反流的特征是在收缩期通过瓣膜出现高速、通常为非层流的血流速度（呈马赛克样着色）（图5）。当多普勒血流图像显示血流从左心室经二尖瓣至左心房呈现此类马赛克样信号，并且该信号出现在心电图QRS波群之后时，即可明确诊断为二尖瓣反流。若此类情况在不存在主动脉瓣反流和/或左心室功能障碍的前提下发生，则可诊断为孤立性二尖瓣脱垂。如果存在明显的左心室扩张（由实验性诱导的心力衰竭或麻醉过深所致），则应归类为缺血性二尖瓣反流（或继发于心脏功能障碍的反流）。.......

讨论

麻醉诱导

正确诱导和维持麻醉对于准确评估小鼠心脏瓣膜和心脏功能的变化至关重要。由于异氟烷诱导麻醉的速度较快，且在深度麻醉后该麻醉剂的清除时间相对较长，因此我们不使用独立的麻醉舱进行诱导。相反，如上文详细所述，动物被直接引导至麻醉罩，从而可在相对较低的麻醉剂浓度下实现快速且可控的麻醉诱导。

大多数小鼠品系在异氟烷浓度低于1.5%时仍能保持充分的镇静状态。然而，应密切监测异氟烷对心脏功能的累积效应，且可能需要随时间推移略微降低麻醉剂浓度。反之，也可能需要略微增加麻醉剂浓度。需仔细观察动物是否出现任何活动（提示麻醉深度不足）以及心率（HR）是否升高或降低；这有助于及时主动地调节麻醉深度。

与人类不同，异氟烷会导致小鼠心率（HR）下降。尽管在麻醉剂过量使用初期左心室功能可能得以维持，但心率降低几乎普遍继发左心室扩张，这是由于心肌收缩力受到抑制所致。因此，射血分数下降，瓣膜跨瓣（主动脉瓣和二尖瓣）峰值血流速度降低，主动脉瓣提前关闭，组织多普勒速度也下降。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高分辨率超声成像系统	VisualSonics, Fujifilm	Vevo 2100
异氟烷扩散器（可输送1%至1.5%异氟烷，混合1 L/min的100% O2	VisualSonics, Fujifilm	N/A
适用于小型或大型小鼠的换能器（550D 或 400）	MicroScan, VisualSonics, Fujifilm	MS 550D, MS 400
动物承载平台	VisualSonics, Fujifilm	11503
高级生理监测单元	VisualSonics, Fujifilm	N/A
异氟烷	Terrell	NDC 66794-019-10
连接至异氟烷扩散器和100% O2的鼻罩及管路	本单位自行定制加工	--
脱毛剃刀	Andis Super AGR+ vet pack clipper	AD65340
超声耦合凝胶	Parker Laboratories	REF 01-08
电极导电凝胶	Parker Laboratories	REF 15-25
粘性胶带	Fisher Laboratories	1590120B
纸巾