小鼠小肠淋巴细胞的分离与流式细胞术表征

摘要

由于人们日益认识到肠道淋巴细胞在多种肠道及全身性疾病中发挥着关键作用，对这些细胞进行定量表征的研究兴趣不断增长。在本方案中，我们描述了如何从小肠不同区室中分离单细胞群体，以用于后续的流式细胞术分析。

摘要

肠道是人体所有器官中免疫细胞数量最多的部位，持续暴露于微生物和饮食来源的外来抗原。随着对管腔内抗原在塑造免疫应答中的作用以及肠道内免疫细胞教育在多种系统性疾病中的关键意义的认识不断加深，人们对表征肠道免疫系统产生了日益浓厚的兴趣。然而，许多已发表的实验方案繁琐且耗时。本文介绍一种快速、可重复且无需繁琐Percoll梯度离心的简化方法，用于从小肠固有层、上皮内层和派尔集合淋巴结中分离淋巴细胞。尽管该方案主要针对小肠，但也适用于结肠的分析。此外，我们强调了根据具体科学问题可能需要进一步优化的若干方面。该方法可获得大量活的淋巴细胞，可用于后续的流式细胞术分析或其他表征手段。

引言

小肠的主要功能通常被认为是营养物质的消化与吸收¹。尽管这一代谢功能显然至关重要，但小肠在保护宿主免受肠腔内持续存在的环境抗原侵袭方面也具有同等重要的作用²。肠道通过仅由单层细胞构成的上皮层，将外部环境（例如，管腔内的抗原）与宿主的内部环境分隔开来。因此，小肠免疫系统面临一项艰巨的任务：必须精确调控其反应阈值，允许来自食物和共生微生物的外来抗原在几乎不引发免疫反应或仅引发轻微免疫反应的情况下进入黏膜，同时对入侵的病原体及其他"有害"抗原产生强有力的免疫应答。对这些抗原产生过度或不适当的免疫反应可导致病理性疾病（例如，炎症性肠病、1型糖尿病、多发性硬化症），必须加以避免^3-6。

总体而言，胃肠道被认为是人体最大的免疫器官，含有超过70%的抗体分泌细胞⁷。小肠免疫系统由三个主要区室组成——固有层（LP）、上皮内层和派尔集合淋巴结（PPs），每个区室均含有特征性的淋巴细胞群体²。固有层淋巴细胞（LPLs）主要为TCRαβ⁺ T细胞，约含20%的B细胞；上皮内淋巴细胞（IELs）中B细胞极少，TCRγδ⁺ T细胞数量多于TCRαβ⁺ T细胞；而派尔集合淋巴结（PPs）作为嵌于小肠壁内的次级淋巴器官，约含有80%的B细胞。尽管这些解剖区域各自具有略微不同的功能和发育基础，但它们协同作用，共同保护宿主免受病原体侵害。

此外，人们日益认识到微生物群是肠道免疫系统发育的关键决定因素，并越来越重视特定微生物与特定细胞谱系发生之间的对应关系^8,9。而且，鉴于肠道免疫系统的“教育”过程会影响解剖学上远端部位的免疫应答（例如，关节炎、多发性硬化症、肺炎），现已明确肠道免疫系统的发育与比以往所认识到的更多的疾病过程相关^10-12。因此，对肠道免疫系统进行定量评估的兴趣已超越宿主-病原体相互作用的范畴，扩展至宿主-共生微生物相互作用以及多种全身性疾病的发病机制研究。

鉴于目前分离肠道淋巴细胞的方法存在较大差异，一种在保证产量、细胞活力和实验重复性的同时兼顾所需时间的优化方法变得愈发重要。涉及Percoll梯度离心的方案耗时且劳动强度大，可能更容易引入人为误差，从而导致细胞得率和活力不稳定¹³。本文提供了一种优化的实验方案，用于从小肠全部三个免疫区室中分离和鉴定淋巴细胞。此外，考虑到人们对微生物诱导黏膜免疫系统变化的兴趣日益增加，本方案还包括可用于实现小鼠间微生物水平传播的步骤，以评估这些变化对肠道免疫系统的定量影响。

方案

所有研究均在哈佛医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的严格审查和指导下进行，该委员会符合美国实验动物科学协会（AALAS）制定的兽医标准。

1. 通过共同饲养进行细菌的水平传播（可选） 

1. 为尽量减少外源性污染（特别是使用无菌小鼠时），在组装无菌一次性笼盒时应采用无菌操作技术，并使用经过高压灭菌的饲料和饮水。
2. 使用耳标或耳缘打孔对携带不同微生物群的6周龄C57BL/6小鼠进行个体标记，并将它们共同饲养于同一笼中。由于小鼠具有食粪行为，会摄取笼底的粪便颗粒，因此微生物可在小鼠之间自然发生水平传播。
3. 将小鼠共同饲养至少1周，以确保在分析前有足够时间完成微生物的传播及免疫系统的改变。

2. 小肠上皮内层和固有层单细胞悬液的制备

1. 溶液的配制
   1. 制备提取液（每根小肠）：30 ml RPMI + 93 µl 5% (w/v) 二硫苏糖醇 (DTT) + 60 µl 0.5 M EDTA + 500 µ1 升胎牛血清（FBS）。使用前立即加入 DTT。
   2. 准备消化液（每小肠一份）：25 ml RPMI + 12.5 mg dispase + 37.5 mg collagenase II + 300 µl FBS。使用前立即加入dispase和collagenase。
   3. 所有在 37 °C 进行的孵育步骤 °C，将溶液预热至37 °C.
2. 以 CO₂ 安乐死小鼠₂ 窒息后行颈椎脱位
3. 将小鼠背侧朝下放置，用70%乙醇喷洒腹部。使用剪刀沿腹侧正中线从耻骨联合至剑突依次剪开皮肤和腹膜筋膜，进行剖腹手术，从而暴露腹腔。
4. 使用剪刀横断幽门括约肌，将小肠与胃分离。轻柔地从小肠系膜中分离小肠，去除肠系膜脂肪。
   1. 为完全移除小肠，在回盲交界处进行第二次切割。将分离的小肠置于冷（即., 4 °C) 含 10% FBS 的 RPMI，以最大化细胞存活率。
5. 使用弯头镊子轻轻去除大块脂肪组织。在去除脂肪时需小心，避免撕裂肠组织本身。
6. 使用连接在注射器上的18 G饲喂针，以15–20 ml冷的PBS轻轻冲洗肠道，以去除肠内容物。
7. 使用剪刀切除派尔集合淋巴结（PPs），并将其置于含5%胎牛血清（FBS）的冷RPMI培养基中。PPs位于小肠对系膜侧，呈多叶状白色团块。根据小鼠品系的不同，每只小鼠通常有8至12个PPs。
8. 将小肠切成3至4英寸长的节段。
9. 用润湿的RPMI将每段小肠在纸巾上滚动，以去除残留脂肪，同时使用钝头解剖刀将脂肪从组织上分离。
10. 用弯头镊子插入肠段并夹住组织远端，将组织翻转；然后用一把直头镊子从弯头镊子上轻轻取下组织段（从近端开始），使组织内翻。
11. 将组织片段放入含有30 ml提取液和一枚搅拌子的烧杯中。盖紧杯盖，在37℃下以500 rpm搅拌15分钟。 °C；搅拌应充分但不产生湍流。
12. 孵育后，使用钢质滤网将组织碎片与含有上皮层的上清液分离，上清液应呈浑浊状。此上清液含有肠上皮内淋巴细胞，可根据需要进一步分析；如需分析，可继续进行步骤2.18至2.23的样品过滤操作。
13. 用手轻轻搅动组织碎片以去除残留的提取液。
14. 将组织置于干燥的纸巾上，并反复翻转数次，以促进去除未被提取液释放的残留黏液。
15. 将组织碎片放入含有 600 μl 的 1.5 ml 离心管中 µ消化液的量。
16. 用剪刀将组织剪碎，直至组织碎片不再粘附在剪刀上且溶液呈现均一状态。此步骤对于确保组织完全酶解至关重要。
17. 将切碎的小肠加入含有 25 ml 消化液的容器中，37℃、500 rpm 搅拌 30 分钟 °C. 消化进行至一半时（即用移液管上下吹打（15 分钟时），以帮助打碎组织中的大块团块。
18. 将消化后的组织（或若处理IELs则取自步骤2.12的上皮层）通过100 μm细胞滤器过滤 µ将细胞滤筛中的液体过滤至50 ml离心管中，用20 ml含10% FBS的RPMI冲洗滤筛。
19. 在 4 ℃ 下以 500 × g 离心 10 分钟 °C.
20. 小心倾倒上清液，并将沉淀物重悬于 1 ml 含 10% FBS 的 RPMI 培养基中。
21. 将重悬的细胞通过40 μm细胞滤网过滤 µ将细胞滤过筛置于50 ml离心管中，用20 ml含10% FBS的RPMI冲洗滤过筛。
22. 在 4 ℃ 条件下，以 500 × g 离心力离心 10 分钟 °C.
23. 小心倾去上清液，将沉淀重悬于 1 ml 含 2% FBS 的 RPMI 中。

3. 从小肠派尔集合淋巴结制备单细胞悬液

1. 将切除的派尔集合淋巴结（PPs）转移至含有25 ml消化液和搅拌子的杯子中。盖紧盖子，在37 °C下以500 rpm转速旋转10分钟。
2. 将消化后的派尔集合淋巴结通过40 µm细胞滤筛过滤至50 ml离心管中。若仍有团块残留，可用1 ml注射器推杆的平端将其压过滤筛。
3. 用含10%胎牛血清（FBS）的10 ml RPMI冲洗滤筛。
4. 在4 °C下以500 × g离心10分钟，收集过滤后的溶液。
5. 小心弃去上清液，将沉淀物重悬于1 ml含2% FBS的RPMI中。

4. 流式细胞术表面染色

1. 分装适量体积的细胞（例如., 200 µ将 LPLs 的 l 加入 96 孔圆底板中。
2. 在 4 ℃ 下以 500 × g 离心 5 分钟 °C. 通过倒置培养板弃去上清液。
3. 将细胞重悬于 90 µ含 2% FBS 和 1:100 稀释度抗 CD16/32（Fc 封闭）的 RPMI 溶液，4 ℃孵育 10 分钟 °C.
4. 加入10 µl PBS。在 4℃ 下以 500 × g 离心 5 分钟 °C. 通过倒置培养板弃去上清液。
5. 将细胞重悬于 250 µl PBS。在 4℃ 下以 500 x g 离心 5 分钟 °C. 将培养板倒置，弃去上清液。
6. （可选）如需要，可按照试剂生产商的说明书用活细胞染料对细胞进行染色。
7. 将细胞重悬于 100 µl 1% 甲醛用于固定细胞，孵育 1 小时 在4℃避光条件下 °C.
8. 加入200 µl PBS。在 4℃ 下以 500 × g 离心 5 分钟 °C. 将培养板倒置，弃去上清液。
9. 将细胞重悬于 250 µl PBS。在 4℃ 下以 500 × g 离心 5 分钟 °C. 将培养板倒置，弃去上清液。
10. 将细胞重悬于 200 µl PBS。使用流式细胞仪分析细胞。

结果

对小肠淋巴细胞单细胞悬液进行流式细胞术分析时，应获得一群具有与脾细胞相似的前向散射和侧向散射特征的离散细胞群（图 1A 和 1B）。若在分离初期未将组织保持在 4 °C，淋巴细胞可能开始死亡，导致淋巴细胞群体的前向散射信号降低，且更难与其他上皮细胞和死细胞分离（图 1C）。此外，若小肠组织未彻底清除肠系膜脂肪，则几乎会导致淋巴细胞完全丢失（图 1D）。这些现象说明，操作迅速（即，避免组织升温）以及注重细节（即，彻底去除微量肠系膜脂肪）对于保证样本质量至关重要。通常情况下，我们可获得约 80% 活性的小肠固有层淋巴细胞（LPLs）（图 1E）。

图2A 展示了微生物群的组成如何显著影响特定细胞群体的数量。正如我们先前所证实的，无菌（GF）小鼠完全缺乏任...

讨论

我们介绍一种用于分离和流式细胞术表征小肠淋巴细胞的方案，包括固有层淋巴细胞（LPLs）、上皮内淋巴细胞（IELs）以及派尔集合淋巴结（PPs）中的淋巴细胞。对于希望评估微生物群变化如何影响小肠免疫系统的研究者，我们详细描述了在携带不同微生物群的小鼠之间进行微生物水平传播的简便步骤。尽管本方案重点针对小肠，但该方法同样适用于大肠淋巴细胞的分析，唯一的区别在于大肠中不存在可被肉眼识别的派尔集合淋巴结（尽管存在结肠斑块，但通常无法通过肉眼观察到）。

从小肠组织中获得最佳淋巴细胞分离效果涉及多个关键步骤。仔细去除脂肪组织对于确保淋巴细胞的存活率和获得最大产量至关重要。此外，二硫苏糖醇（DTT）是一种在上皮细胞提取过程中起关键作用的黏液溶解剂。鉴于其性质不稳定，建议将5%的溶液分装成单次使用剂量，于≤-20 °C保存，并避免对未用完的部分进行再次冷冻。尽管在提取液中使用乙二胺四乙酸（EDTA）有助于去除上皮细胞¹⁵，但在消化过程中，EDTA的存在——以及过量的胎牛血清（FBS）或黏液——可能会抑制胶原酶的活性。已有研究表明，所用胶原酶的浓度会差异性地影响细胞表面标志物的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌手套	Kimberly-Clark	555092
无菌小鼠笼	Innovive	MS2-AD	包含笼盖、笼底和Alpha-Dri垫料
金属饲料盒	Innovive	M-FEED
饮水瓶	Innovive	M-WB-300
卡片架	Innovive	CRD-HLD-H
可高压灭菌的啮齿类动物饲料（NIH-31M）	Zeigler	4131207530
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875-119
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA（pH 8.0）	Ambion	AM9262
胎牛血清（FBS）	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	方案中的浓度基于1.878 U/mg的酶活性
胶原酶II型	Invitrogen	17101-015	方案中的浓度基于245 U/mg的酶活性
解剖剪刀	Roboz	RS-5882
饲喂针头（18 G，2" 长）	Roboz	FN-7905
10 ml 注射器	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
一次性手术刀（15号刀片）	Miltex	4-415
弯头镊子	Roboz	RS-5211
直头镊子	Roboz	RS-5132
多功能杯，120 ml	VWR	89009-662
搅拌子	VWR	58949-062
多孔位搅拌板，9孔位	VWR	12621-048
不锈钢锥形滤网，3英寸	RSVP
1.5 ml 离心管	Eppendorf	0030 125.150
100 μm 细胞滤网	Falcon	08-771-19
40 μm 细胞滤网	Falcon	08-771-1
50 ml 锥形离心管	Falcon	352098
1 ml 注射器	BD	309659
96孔圆底培养板	Corning	3799
抗小鼠CD16/32（Fc阻断剂）	Biolegend	101320
（可选）可固定的活率染料 eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% 中性缓冲福尔马林	Thermo Scientific	5725