我们介绍一种利用高通量测序对蛋白质的全面单点饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的关键在于使用正交引物对实现文库构建和测序的多重扩增。文中提供了以临床相关剂量的氨苄西林筛选TEM-1 β-内酰胺酶的代表性实验结果。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
定点突变长期以来被用作研究蛋白质结构、功能和进化的手段。近年来，大规模并行测序技术的进步使得能够同时评估大量突变的功能或适应性效应。本文介绍了一种利用高通量测序技术实验性地测定目标蛋白中所有可能的单氨基酸突变效应的方案，并以含有263个氨基酸的抗生素抗性酶TEM-1 β-内酰胺酶为例进行说明。在该方法中，通过定点诱变PCR构建全蛋白饱和突变文库，对每个位点分别随机化为所有可能的氨基酸。随后将文库转化至细菌中，并筛选其赋予β-内酰胺类抗生素抗性的能力。每个突变的适应性效应则通过深度测序在筛选前后文库中的变化来确定。重要的是，本方案引入了最大化测序读长深度的方法，并通过将相邻位点分组（分组长度适应高通量测序读长）以及使用正交引物对每组进行条形码标记，实现了整个突变文库的同步筛选。本文以临床上相关剂量的氨苄西林为条件，提供了应用该方案评估TEM-1中所有单氨基酸突变适应性效应的代表性结果。该方法应可轻松扩展至其他已有高通量筛选体系的蛋白质。
引言
诱变技术长期以来被用于研究生物系统的特性及其进化过程，并用于产生具有增强或新功能的突变蛋白或生物体。早期的方法依赖于在生物体中产生随机突变的技术，而重组DNA技术的出现使研究人员能够以位点特异性的方式在DNA中引入特定的改变。 即定点突变1,2目前的技术通常利用诱变性寡核苷酸进行聚合酶链式反应（PCR），可相对容易地构建和评估少量突变例如特定基因中的点突变3,4然而，当目标接近于创建和评估所有可能的单一位点（或更高阶）突变时，难度要大得多。
尽管早期研究在评估基因中大量突变方面已取得诸多成果，但所用技术往往十分繁琐，例如需要借助无义突变抑制菌株独立地逐一评估每个突变5-7，或由于Sanger测序的测序深度较低而在定量能力上受到限制8。这些研究中使用的技术目前已基本被基于高通量测序技术的方法所取代9-12。这些在概念上较为简单的方法包括：构建包含大量突变的文库，对文库进行功能筛选或选择，随后对筛选前后的文库进行深度测序（即，测序读长远超>106条）。通过这种方式，可同时且更定量地评估大量突变的表型或适合度效应，这些效应表现为各个突变体在群体中频率的变化。
我们此前介绍了一种用于评估蛋白质中所有可能的单氨基酸突变文库的简单方法（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：协议的概述见图1。本协议中的多个步骤和试剂需要采取安全措施（以“注意”标示）。使用前请查阅材料安全数据表。除非另有说明，所有操作步骤均在室温下进行。
1. 准备培养基和培养板
- 将1 L纯化水、100 ml超级优化肉汤（SOB；表1）、1 L LB肉汤（LB；表2）和1 L LB琼脂（LB-agar；表3）分别准备并经高压灭菌。另单独准备三个各含1 L LB培养基的培养瓶，并进行灭菌。
注意：本实验方案中，“水”均指经高压灭菌的纯化水；SOB、LB和LB-agar均指经高压灭菌的溶液。 - 将0.12 g盐酸四环素溶解于10 ml 70%乙醇中，配制12 mg/ml的四环素（Tet）储备液。使用0.2 µm滤器过滤灭菌，并避光保存于4 °C。
- 将LB琼脂冷却至50 °C，加入1 ml四环素储备液（终浓度为12 µg/ml Tet）。倒入培养皿中，在室温下避光冷却。避光保存于4 °C。
2. 全基因饱和突变文库的构建
注意：引物、完成的 PCR 产物、限制性酶切产物和连接产物，以及纯化的 DNA 样品均可在 -20 °C 保存。
-
<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
包含正交引物位点的五种修饰型pBR322质粒（pBR322_OP1 - pBR322_OP5）的质粒图谱如图2A所示。为验证正交引物的特异性，分别使用每对正交引物进行PCR扩增，同时加入全部五种pBR322_OP1-5质粒，或加入除与引物对应质粒外的其余质粒。结果仅在包含匹配质粒时获得正确大小的扩增产物，而在缺失该匹配质粒时未获得任何大小的产物（图2B）。
本研究按照本文所述方案进行了一次代表性实验（图1）。经过处理（方案第4.2节）后，从筛选前条件中获得6.2 × 106条读数，从50 µg/ml氨苄青霉素筛选条件下获得6.3 × 106条读数。筛选前条件下每种氨基酸突变的计数呈现出典型的对数正态分布（图3A）13。在筛选前培养物的测序结果中，98.9.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文描述了一种利用高通量测序技术对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的一个重要特点是克隆过程中使用正交引物。简言之，通过诱变PCR对每个氨基酸位点进行随机化，并将多个位点组合成组，使每组的总序列长度适配高通量测序的读长限制。这些组别被克隆至含有成对正交引物结合位点的质粒载体中，混合后进行筛选，再利用正交引物进行去多重化处理，随后进行深度测序。由于突变被限制在测序读长范围内，该方法可最大化获取包含突变的有效测序读数，尤其适用于长度超过测序读长的基因。此外，该技术允许对整个突变文库进行同时或"单批次"筛选，从而减少工作量，并避免不同突变经受不同筛选强度的可能性。在实际操作中，该方案的关键步骤主要涉及实验组织管理：在克隆过程（方案步骤2.3）中，必须确保诱变PCR产物被正确分组并克隆至相应的正交引物位点载体中；在测序样本制备过程中（方案步骤4.1），必须正确使用正交引物，以及用于分离各个NNS子文库组并添加索引序列的引物。
本实验方案的三个主要步骤——文库构建、筛选和测序——可在多个方面进行修改。在文库构建过程中，可采用多种技术引入突变，例如通过易错PCR，.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益
致谢
R.R. 感谢美国国立卫生研究院（RO1EY018720-05）、罗伯特·A·韦尔奇基金会（I-1366）以及格林系统生物学中心的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨 | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| 酵母提取物 | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| 盐酸四环素 | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| 培养皿 | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| 寡核苷酸引物 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol 规模，标准脱盐 |
| pBR322_AvrII | 可按要求提供 | 在 TEM-1 基因下游插入 AvrII 限制性酶切位点的 pBR322 质粒 | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | 可按要求提供 | 五种经修饰的 pBR322 质粒，每种均包含一对正交引物结合位点 | |
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0491L | 包含 5x PCR 缓冲液和 PCR 添加剂（GC 增强剂） |
| 15 ml 锥形管 | Corning | 430025 | |
| 多通道移液器（Eppendorf ResearchPlus） | Eppendorf | ||
| 96 孔 PCR 板 | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 孔板密封膜 | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96 孔热循环仪 | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x 凝胶上样染料 | New England Biolabs | B7024S | |
| 琼脂糖 | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| 溴化乙锭 | Bio-Rad | 161-0433 | |
| 紫外透射仪（FOTO/Analyst ImageTech） | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB 缓冲液 | Qiagen | 19086 | |
| 96 孔黑色侧壁透明底检测板 | Corning | 3651 | |
| λ 噬菌体 DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA 试剂 | Invitrogen | P7581 | 双链 DNA 定量试剂，用于实验步骤 2.2.4 |
| Victor 3 V 微孔板读数仪 | PerkinElmer | ||
| DNA 纯化试剂盒 | Zymo Research | D4003 | |
| 微量离心管 | Corning | 3621 | |
| 长波长紫外灯 | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| 琼脂糖凝胶 DNA 提取缓冲液 | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 电转感受态大肠杆菌 | Avidity | EVB100 | |
| 电穿孔仪（E. coli Pulser） | Bio-Rad | 1652102 | |
| 电穿孔比色皿 | Bio-Rad | 165-2089 | |
| 分光光度计（Ultrospec 3100 pro） | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml 锥形管 | Corning | 430828 | |
| 质粒纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 排 PCR 管条 | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 | 双链 DNA 定量试剂 |
| Qubit 检测管 | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit 荧光计 | Invitrogen | Q32866 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环） | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq 桌面测序仪 | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | 也可使用 Illumina HiSeq 平台进行测序 |
| FLASh 软件 | 约翰·霍普金斯大学 - 开源 | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | 用于合并下一代测序数据中成对末端读段的软件 |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC | ||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG | ||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG | ||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC | ||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC | ||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC | ||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC | ||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG | ||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC | ||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC | ||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC | ||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC | ||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC | ||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG | ||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC | ||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC | ||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG | ||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
参考文献
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
