一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案

摘要

我们介绍一种利用高通量测序对蛋白质的全面单点饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的关键在于使用正交引物对实现文库构建和测序的多重扩增。文中提供了以临床相关剂量的氨苄西林筛选TEM-1 β-内酰胺酶的代表性实验结果。

摘要

定点突变长期以来被用作研究蛋白质结构、功能和进化的手段。近年来，大规模并行测序技术的进步使得能够同时评估大量突变的功能或适应性效应。本文介绍了一种利用高通量测序技术实验性地测定目标蛋白中所有可能的单氨基酸突变效应的方案，并以含有263个氨基酸的抗生素抗性酶TEM-1 β-内酰胺酶为例进行说明。在该方法中，通过定点诱变PCR构建全蛋白饱和突变文库，对每个位点分别随机化为所有可能的氨基酸。随后将文库转化至细菌中，并筛选其赋予β-内酰胺类抗生素抗性的能力。每个突变的适应性效应则通过深度测序在筛选前后文库中的变化来确定。重要的是，本方案引入了最大化测序读长深度的方法，并通过将相邻位点分组（分组长度适应高通量测序读长）以及使用正交引物对每组进行条形码标记，实现了整个突变文库的同步筛选。本文以临床上相关剂量的氨苄西林为条件，提供了应用该方案评估TEM-1中所有单氨基酸突变适应性效应的代表性结果。该方法应可轻松扩展至其他已有高通量筛选体系的蛋白质。

引言

诱变技术长期以来被用于研究生物系统的特性及其进化过程，并用于产生具有增强或新功能的突变蛋白或生物体。早期的方法依赖于在生物体中产生随机突变的技术，而重组DNA技术的出现使研究人员能够以位点特异性的方式在DNA中引入特定的改变。 即定点突变^1,2目前的技术通常利用诱变性寡核苷酸进行聚合酶链式反应（PCR），可相对容易地构建和评估少量突变例如特定基因中的点突变^3,4然而，当目标接近于创建和评估所有可能的单一位点（或更高阶）突变时，难度要大得多。

尽管早期研究在评估基因中大量突变方面已取得诸多成果，但所用技术往往十分繁琐，例如需要借助无义突变抑制菌株独立地逐一评估每个突变^5-7，或由于Sanger测序的测序深度较低而在定量能力上受到限制⁸。这些研究中使用的技术目前已基本被基于高通量测序技术的方法所取代^9-12。这些在概念上较为简单的方法包括：构建包含大量突变的文库，对文库进行功能筛选或选择，随后对筛选前后的文库进行深度测序（即，测序读长远超>10⁶条）。通过这种方式，可同时且更定量地评估大量突变的表型或适合度效应，这些效应表现为各个突变体在群体中频率的变化。

我们此前介绍了一种用于评估蛋白质中所有可能的单氨基酸突变文库的简单方法（即，全蛋白饱和突变文库），适用于基因长度超过测序读长的情况^11,13首先，通过定点诱变PCR对每个氨基酸位点进行随机化。在此过程中，基因被划分为若干组，每组包含连续的位点，且总长度符合测序平台的读长要求。随后，将每组的诱变PCR产物混合，并对各组分别进行筛选和高通量测序。通过保持序列中突变位置与测序读长之间的对应关系，该方法具有最大化测序深度的优势：尽管可以直接在不划分组的情况下对文库进行短窗口测序（例如采用标准的鸟枪法测序策略时，所获得的大部分读长将是野生型序列，从而导致大部分测序通量被浪费例如， 对于一个500个氨基酸的蛋白质，若以其全长蛋白饱和突变文库在100个氨基酸（300 bp）的测序窗口下进行测序，则至少80%的读长将为野生型序列。

本文介绍了一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案，该方案采用上述方法（如图1所示）。重要的是，我们在文库克隆过程中引入了正交引物，用于为每个序列组添加条形码，从而可将多个序列组混合构建为一个文库，同时进行筛选或选择，并随后通过深度测序实现去多重化分析。由于各个序列组无需独立进行筛选，该策略显著降低了工作量，并确保每个突变所经历的选择压力保持一致。本研究以TEM-1 β-内酰胺酶为模型系统^14-16，该酶可使细菌对β-内酰胺类抗生素（例如，氨苄青霉素）产生高水平耐药性。文中描述了在E. coli中构建TEM-1全蛋白饱和突变文库，并在相当于临床剂量氨苄青霉素血清浓度（50 µg/ml）的选择压力下进行功能评估的详细实验流程^17,18。

方案

注意：协议的概述见图1。本协议中的多个步骤和试剂需要采取安全措施（以“注意”标示）。使用前请查阅材料安全数据表。除非另有说明，所有操作步骤均在室温下进行。

1. 准备培养基和培养板

1. 将1 L纯化水、100 ml超级优化肉汤（SOB；表1）、1 L LB肉汤（LB；表2）和1 L LB琼脂（LB-agar；表3）分别准备并经高压灭菌。另单独准备三个各含1 L LB培养基的培养瓶，并进行灭菌。
   注意：本实验方案中，“水”均指经高压灭菌的纯化水；SOB、LB和LB-agar均指经高压灭菌的溶液。
2. 将0.12 g盐酸四环素溶解于10 ml 70%乙醇中，配制12 mg/ml的四环素（Tet）储备液。使用0.2 µm滤器过滤灭菌，并避光保存于4 °C。
3. 将LB琼脂冷却至50 °C，加入1 ml四环素储备液（终浓度为12 µg/ml Tet）。倒入培养皿中，在室温下避光冷却。避光保存于4 °C。

2. 全基因饱和突变文库的构建

注意：引物、完成的 PCR 产物、限制性酶切产物和连接产物，以及纯化的 DNA 样品均可在 -20 °C 保存。

1. 设计定点诱变引物
   1. 为了将每个氨基酸位点突变为所有可能的氨基酸，针对每个氨基酸位点设计一对互补的诱变引物（正向/有义引物和反向/反义引物），并遵循以下原则：
      1. 将待突变氨基酸对应的密码子替换为NNS（其中N为四种核苷酸碱基的混合物，S为胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的混合物），并将该序列置于引物中央，两侧各约15个核苷酸。
      2. 确保引物的5'端和3'端以C或G结尾，且熔解温度（T_m）约为70 °C³。使用计算脚本NNS_PrimerDesign.m（见补充代码文件）根据上述原则设计NNS诱变引物。
   2. 从商业来源订购引物。为便于操作，建议以96孔板形式合成，并预先用水稀释至50 µM，其中一组板包含正向诱变引物，另一组板包含反向诱变引物。
   3. 在移液槽中加入水，使用多通道移液器将95 µl水转移至三个96孔板中的263个孔中。使用多通道移液器从含有正向诱变引物的96孔板中取出5 µl，加入含水孔的对应孔中，从而将引物稀释20倍至2.5 µM。
   4. 重复步骤2.1.3，稀释反向诱变引物。
2. 通过两步PCR定点诱变法合成每个氨基酸位点的NNS子文库
   1. 进行第一轮诱变PCR。针对每对诱变引物，以pBR322_AvrII质粒为模板，使用引物AatII_F或AvrII_R进行25 µl PCR反应（正向诱变引物与引物AvrII_R配对，反向诱变引物与引物AatII_F配对；共526个PCR反应）。AatII_F和AvrII_R序列见材料表。
      1. 将表4中的试剂加入15 ml锥形管中，配制PCR“主混合液”，转移至移液槽。使用多通道移液器将15 µl主混合液加入三个96孔PCR板中的263个孔中。使用多通道移液器将10 µl来自含有稀释后正向诱变引物的96孔板的溶液转移至PCR板的对应孔中。
      2. 用96孔板密封膜覆盖每个PCR板，以200 × g离心2分钟。
      3. 将PCR板转移至热循环仪，运行以下程序：98 °C预变性30秒；20个循环：98 °C变性10秒，55 °C退火20秒，72 °C延伸1分钟；72 °C最终延伸2分钟；4 °C保存。
      4. 重复步骤2.2.1.1–2.2.1.3，处理含有稀释后反向诱变引物的96孔板。
   2. 进行第二轮诱变PCR。针对每个氨基酸位点，使用引物AatII_F和AvrII_R，以混合并稀释后的第一轮诱变PCR产物为模板，进行25 µl PCR反应（共263个PCR反应）。
      1. 在移液槽中加入水，使用多通道移液器将198 µl水转移至三个96孔板中的263个孔中。
      2. 使用多通道移液器，先将1 µl来自含有正向诱变引物PCR产物的96孔PCR板的溶液转移至含水板的对应孔中，再将1 µl来自反向诱变引物PCR产物的溶液转移至同一孔中，实现每个氨基酸位点诱变PCR产物的混合与100倍稀释。
      3. 将表5中的试剂加入15 ml锥形管中，配制PCR“主混合液”，转移至移液槽。使用多通道移液器将24 µl主混合液加入三个96孔PCR板中的263个孔中。使用多通道移液器将1 µl来自含有混合并稀释后的第一轮诱变PCR产物的96孔板的溶液转移至PCR板的对应孔中。
      4. 用96孔板密封膜覆盖每个PCR板，以约200 × g离心2分钟。将PCR板转移至热循环仪，运行与步骤2.2.1.3相同的程序。
   3. 通过凝胶电泳分析第二轮诱变PCR的结果。确保所有产物大小正确，且无污染条带。
      1. 在移液槽中加入2 ml 2×上样缓冲液，使用多通道移液器将6 µl缓冲液转移至三个96孔板中的263个孔中。使用多通道移液器将6 µl来自含有第二轮诱变PCR产物的96孔PCR板的溶液转移至含染料板的对应孔中。
      2. 制备含0.2 µg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶（注意：CAUTION）。
      3. 在每行的第一和最后一个泳道中加入DNA分子量标记。然后使用多通道移液器将步骤2.2.3.1中的10 µl样品上样。
      4. 以100 V电压电泳40分钟，并在紫外透射仪上成像。
      5. 重复步骤2.2.3.2–2.2.3.4，直至所有样品完成分析。
   4. 使用双链DNA定量试剂准确测定每个NNS子文库PCR产物的浓度。
      1. 将约15 ml EB缓冲液转移至移液槽。使用多通道移液器将49 µl缓冲液转移至三个96孔黑色侧壁透明底检测板中的263个孔中。
      2. 使用多通道移液器将1 µl第二步PCR产物（步骤2.2.2）转移至96孔检测板的对应孔中。
      3. 用300 µl EB缓冲液将λ噬菌体DNA稀释至2 ng/µl，然后进行10次两倍稀释（共11个浓度点），制备DNA浓度标准曲线。将50 µl各稀释液转移至上一步中一个未加样品的96孔检测板的一行的前11列；第12列加入50 µl EB缓冲液（试剂空白）。
      4. 将75 µl定量试剂（见材料表）加入15 ml锥形管，再加入15 ml EB缓冲液，颠倒混匀后转移至移液槽。避光保存。
      5. 使用多通道移液器将50 µl配制好的双链DNA定量试剂加入检测板的每个孔中。通过反复吸打混匀。在室温避光孵育5分钟。
      6. 使用微孔板读数仪，采用标准荧光素波长（激发波长485 nm，发射波长520 nm，积分时间0.1秒）测定每个样品的荧光值。
      7. 从所有样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值。根据λ噬菌体样品的荧光值绘制标准曲线，并利用该曲线和各样品的荧光值计算其浓度。
3. 将NNS子文库克隆至筛选载体
   1. 将每个NNS子文库PCR产物100 ng混合为五个NNS子文库组。按照生产商说明，使用DNA纯化试剂盒纯化样品，然后使用双链DNA定量试剂测定浓度。
      注：每组包含沿TEM-1序列分布的大约53个连续氨基酸位点（NNS子文库组1–5分别对应位点26–78、79–132、133–183、184–236和237–290；编号依据Ambler et al.¹⁹）。
   2. 为每个NNS子文库组构建克隆载体。
      1. 根据表6配制五个100 µl PCR反应，使用引物AvrII_F和AatII_OP1_R–AatII_OP5_R，以及质粒pBR322_OP1–5作为模板（AatII_OP1_R与pBR322_OP1配对，依此类推）。
      2. 将PCR反应管转移至热循环仪，运行以下程序：98 °C预变性30秒；25个循环：98 °C变性10秒，55 °C退火20秒，72 °C延伸1.5分钟；72 °C最终延伸2分钟；4 °C保存。AatII_R和AvrII_F序列见材料表。
      3. 制备含0.2 µg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶（注意：CAUTION）。
      4. 向每个PCR样品中加入20 µl 6×上样缓冲液。在凝胶第一泳道加入DNA分子量标记；将每个样品全部体积上样，样品间至少跳过一个泳道。
      5. 以100 V电压电泳50分钟。
      6. 使用长波长紫外灯观察凝胶（注意：CAUTION），切下含有约3,500 bp PCR产物的凝胶条带，转移至不同的微量离心管中。凝胶条带可在-20 °C保存。
      7. 按照生产商说明，使用凝胶回收试剂盒纯化样品，并使用双链DNA定量试剂测定浓度。
   3. 对NNS子文库组（步骤2.3.1）和克隆载体（步骤2.3.2）分别设置AatII和AvrII限制性内切酶消化反应，具体见表7。37 °C孵育1小时。按照生产商说明，使用DNA纯化试剂盒纯化样品，并使用双链DNA定量试剂测定浓度。
   4. 根据表8，将每个经限制性酶切的NNS子文库组与其对应的经酶切的克隆载体（如NNS子文库组1与pBR322_OP1）进行连接反应。室温孵育1小时。按照生产商说明，使用DNA纯化试剂盒纯化连接产物，用20 µl水洗脱DNA。
   5. 通过电穿孔将全部纯化的连接产物转化至高效文库级E. coli细胞。
      1. 解冻电转化感受态E. coli细胞，随后将细胞和纯化的连接产物置于冰上。
      2. 将10 µl解冻的细胞加入每个纯化的连接反应体系中，转移至电穿孔比色皿，以1.8 kV进行电穿孔。
      3. 用1 ml SOB培养基重悬细胞，37 °C孵育1小时。
      4. 将10 µl复苏培养物重悬于990 µl LB培养基中，取100 µl涂布于含12 µg/ml四环素的LB琼脂平板。37 °C过夜（约16小时）培养。
      5. 对每个复苏培养物，准备一个含50 ml LB培养基和50 µl四环素储备液的250 ml培养瓶，将剩余约1 ml复苏培养物转移至培养瓶中。37 °C剧烈振荡（约200 rpm）过夜（约16小时）培养。
   6. 计数每个平板上的菌落数。成功转化子数量按以下公式计算：，其中为菌落数，为复苏培养物体积（1,000 µl），为涂板的复苏培养物体积（1 µl）。
      注：为确保所有突变的完全覆盖，作为经验法则，成功转化子数量应至少为预期突变数的100倍。每个NNS子文库约含53个位点，因此预期突变数为53位点 × 32密码子/位点 ≈ 1.7 × 10³；为达到文库大小≥100倍（≥1.7 × 10⁵），每个平板上应至少有170个菌落。
   7. 按照生产商说明，使用质粒提取试剂盒从培养物中提取质粒DNA，并使用双链DNA定量试剂测定浓度。将每种质粒各100 ng混合，即得最终的全蛋白饱和突变文库。

3. 抗生素抗性TEM-1全蛋白饱和突变文库的筛选

1. 预选择培养物的制备。
   1. 将步骤 2.3.7 中的质粒用纯水稀释至 0.5 ng/µl，并转移 20 µl 至微量离心管中。按照步骤 2.3.5 中所述进行转化、复苏、涂板和过夜培养，但将 1 µl SOB 复苏培养物转移至 999 µl LB 培养基中。
   2. 计数菌落数量。为确保覆盖所有突变，菌落数应 ≥100，表明成功转化的细胞数 ≥10⁶（100 × 263 个位点 × 32 个密码子/位点 ≈ 10⁶）。
   3. 测定 50 ml 过夜培养物的浓度。
      1. 取 1 ml LB 培养基加入分光光度计比色皿中，作为空白对照。使用分光光度计测定 OD600。
      2. 将过夜培养物用 LB 培养基 10 倍稀释（取 100 µl 加入 900 µl LB 中），测定 OD600。减去空白对照的 OD600 值后乘以 10，得到过夜培养物的 OD600 值。
   4. 将步骤 1.1 中的三个培养瓶在 37 °C 预热约 30 分钟。将过夜培养物稀释至 OD600 = 0.1，并取 1 ml 加入其中一个培养瓶中（终浓度 OD600 = 0.001）。此即“预选择培养物”。
   5. 将“预选择培养物”在 37 °C 下剧烈振荡（200 rpm）培养。参照步骤 3.1.3 的方法定期监测 OD600（无需 10 倍稀释），直至 OD600 达到 0.1（约 2.5 小时）。
   6. 将 100 ml 预选择培养物转移至两个 50 ml 圆锥形离心管中，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 6 分钟。弃去大部分上清液，并将沉淀合并至一个 15 ml 圆锥形离心管中。重复离心一次，彻底弃去上清液。将沉淀在 -20 °C 保存。
2. 氨苄青霉素抗性筛选。
   1. 在预选择培养物培养期间，将 0.5 g 氨苄青霉素钠溶于 10 ml 纯水中，配制成 50 mg/ml 的氨苄青霉素（Amp）母液。使用 0.2 µm 滤器过滤除菌，并在 4 °C 保存。
   2. 向另外两个培养瓶中加入四环素（Tet），使其终浓度为 12 µg/ml，并加入适量预选择培养物，使终浓度 OD600 = 0.001。向其中一个培养瓶中加入 1 ml 氨苄青霉素溶液，使其终浓度为 50 µg/ml —— 此即“筛选培养物”。
   3. 将培养物在 37 °C 下剧烈振荡（200 rpm）培养。监测未添加氨苄青霉素的培养物的生长情况，直至其 OD600 达到 0.1（约 2.5 小时）。此时同时测定筛选培养物的 OD600。
   4. 用 0.1 除以筛选培养物的 OD600 值，再乘以 100 ml。将所得体积（约 400 ml）转移至 50 ml 圆锥形离心管中，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 6 分钟。弃去大部分上清液，并将沉淀合并至一个 15 ml 圆锥形离心管中。重复离心一次，彻底弃去上清液。
   5. 根据试剂盒说明书，从预选择培养物（步骤 3.1.6）和筛选培养物（步骤 3.2.4）的细胞沉淀中提取质粒 DNA，并使用双链 DNA 定量试剂测定其浓度。

4. 高通量测序确定突变的适合度效应

1. 高通量测序样品的制备
   1. 使用正交引物制备 25 µl PCR 以对 NNS 子文库组进行解复用
      1. 按照说明制备PCR反应主混合液 表9；将23 µl转移至十个PCR管中。
      2. 向1-5号PCR管中各加入1 µl来自预筛选培养物的0.5 ng/µl纯化质粒DNA，向6-10号管中各加入1 µl来自筛选培养物的相应DNA。
      3. 将50 µl浓度为50 µM的正向正交引物OP1_F - OP5_F与相应的反向正向正交引物OP1_R - OP5_R混合。按相同顺序，取1 µl分别加入PCR管1 - 5和6 - 10中。参见 材料表 用于OP1_F - OP5_F和OP1_R - OP5_R序列。
      4. 将PCR管转移至热循环仪。运行以下程序：98 °C预变性30秒；20个循环：98 °C变性10秒，55 °C退火20秒，72 °C延伸1.5分钟；72 °C终延伸2分钟；4 °C保存。
   2. 准备25 µl的PCR反应以分离每个NNS亚文库组
      1. 将步骤 4.1.1.4 中的 10 个 PCR 产物分别取 1 µl 转移至新的 PCR 管中，加入 99 µl 水，进行 100 倍稀释。混匀后，用移液器吸出 99 µl 弃去。
      2. 将50 µl浓度为50 µM的正向引物Group1_F至Group5_F与相应的反向引物Group1_R至Group5_R混合。按相同顺序，将1 µl混合物分别加入PCR管1–5和6–10中。参见 材料表 用于Group1_F - Group5_F和Group1_R - Group5_R序列。
      3. 根据以下步骤配制PCR反应主混合液 表9，将23 µl转移至每个PCR管中。将PCR管转移至热循环仪；运行与方案步骤2.2.1.3相同的程序。
   3. 进行终体积为 25 µl 的 PCR 以添加索引序列
      1. 将步骤4.1.2.3中得到的10个PCR产物各取1 µl分别转移至新的PCR管中，加入99 µl水，进行100倍稀释。混匀后，用移液器吸出99 µl弃去。
      2. 根据以下步骤配制PCR反应主混合液 表9，将23 µl转移至每个PCR管中。
      3. 对于来自NNS子文库第1-5组的试管，分别向每管加入0.5 µl的正向引物501_F至505_F。对于来自预筛选和筛选培养物的模板试管，分别向每管加入0.5 µl的反向引物701_R和702_R。参见 材料表 用于501_F - 505_F以及701_R和702_R序列。
      4. 将PCR管转移至热循环仪，并运行步骤2.2.1.3中的程序。
   4. 混合并纯化样品
      1. 使用dsDNA定量试剂，按照制造商说明书测定浓度。将每种PCR产物各100 ng混合至同一微量离心管中。
      2. 制备含0.2 µg/ml溴化乙锭（注意）的2%琼脂糖凝胶。
      3. 向混合的PCR产物样品中加入6倍上样缓冲液。在凝胶的第一泳道加入DNA分子量标记；将样品全部体积上样。
      4. 以100 V电压电泳50分钟。使用长波长紫外灯（注意：有潜在危害）观察凝胶，切取含有约360 bp PCR产物的胶条，转移至微量离心管中。胶条可于-20 °C保存。
      5. 按照制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒纯化样品，并用双链DNA定量试剂测定浓度。此即高通量测序的最终样品。
   5. 在高通量测序平台上进行测序（参见 材料表 用于本实验方案的平台）。   
      1. 以 nM 为单位计算样品浓度 ，其中 是样品的浓度，单位为 ng/µl  为样本DNA的序列长度（约360 bp）。用EB缓冲液将样本稀释至4 nM。
      2. 按照制造商说明使样本变性，并用杂交缓冲液稀释至9 pM。
      3. 将600 µl样品加入试剂盒中。按照制造商说明书及屏幕提示进行测序。
2. 测序数据分析
   1. 下载 FLASh（短读长快速调整）²⁰，与测序获得的 fastq.gz 文件一起放入文件夹中。
   2. 使用 FLASh 将对应于每对索引（针对富集前和富集后文库的每个 NNS 子文库组的正向和反向读段）的成对末端测序 fastq.gz 文件进行合并。
      1. 打开命令提示符，将目录更改为方案步骤 4.2.1 中的文件夹。使用命令 flash 合并每一对读段 其中 mates1.fastq.gz 和 mates2.fastq.gz 分别为包含正向和反向测序读段的文件。
   3. 连接每对测序读段后，将 out.extendedFrags.fastq 输出文件分别放入预筛选或筛选培养物对应的结果文件夹中。根据其对应的 NNS 子文库组重命名 out.extendedFrags.fastq 输出文件（即., 1.fastq, 2.fastq 等）。
   4. 运行每个文件夹中的计算脚本 NNS_DataAnalyzer.m（见补充代码文件），以计算每个 NNS 子文库组中每种单氨基酸突变及野生型的计数。
   5. 计算适合度效应 每种突变  在每个位置 选择中获得的计数值之比的以10为底的对数）与富集前（）条件下，相对于野生型：
         .

结果

包含正交引物位点的五种修饰型pBR322质粒（pBR322_OP1 - pBR322_OP5）的质粒图谱如图2A所示。为验证正交引物的特异性，分别使用每对正交引物进行PCR扩增，同时加入全部五种pBR322_OP1-5质粒，或加入除与引物对应质粒外的其余质粒。结果仅在包含匹配质粒时获得正确大小的扩增产物，而在缺失该匹配质粒时未获得任何大小的产物（图2B）。

本研究按照本文所述方案进行了一次代表性实验（图1）。经过处理（方案第4.2节）后，从筛选前条件中获得6.2 × 10⁶条读数，从50 µg/ml氨苄青霉素筛选条件下获得6.3 × 10⁶条读数。筛选前条件下每种氨基酸突变的计数呈现出典型的对数正态分布（图3A）¹³。在筛选前培养物的测序结果中，98.9...

讨论

本文描述了一种利用高通量测序技术对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的一个重要特点是克隆过程中使用正交引物。简言之，通过诱变PCR对每个氨基酸位点进行随机化，并将多个位点组合成组，使每组的总序列长度适配高通量测序的读长限制。这些组别被克隆至含有成对正交引物结合位点的质粒载体中，混合后进行筛选，再利用正交引物进行去多重化处理，随后进行深度测序。由于突变被限制在测序读长范围内，该方法可最大化获取包含突变的有效测序读数，尤其适用于长度超过测序读长的基因。此外，该技术允许对整个突变文库进行同时或"单批次"筛选，从而减少工作量，并避免不同突变经受不同筛选强度的可能性。在实际操作中，该方案的关键步骤主要涉及实验组织管理：在克隆过程（方案步骤2.3）中，必须确保诱变PCR产物被正确分组并克隆至相应的正交引物位点载体中；在测序样本制备过程中（方案步骤4.1），必须正确使用正交引物，以及用于分离各个NNS子文库组并添加索引序列的引物。

本实验方案的三个主要步骤——文库构建、筛选和测序——可在多个方面进行修改。在文库构建过程中，可采用多种技术引入突变，例如通过易错PCR，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
酵母提取物	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333-500G
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506-500G
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500
盐酸四环素	Sigma-Aldrich	T7660-5G
培养皿	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
寡核苷酸引物	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol 规模，标准脱盐
pBR322_AvrII	可按要求提供		在 TEM-1 基因下游插入 AvrII 限制性酶切位点的 pBR322 质粒
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	可按要求提供		五种经修饰的 pBR322 质粒，每种均包含一对正交引物结合位点
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0491L	包含 5x PCR 缓冲液和 PCR 添加剂（GC 增强剂）
15 ml 锥形管	Corning	430025
多通道移液器（Eppendorf ResearchPlus）	Eppendorf
96 孔 PCR 板	Fisher Scientific	14230232
96 孔板密封膜	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96 孔热循环仪	Applied Biosystems	4375786
6x 凝胶上样染料	New England Biolabs	B7024S
琼脂糖	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
溴化乙锭	Bio-Rad	161-0433
紫外透射仪（FOTO/Analyst ImageTech）	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB 缓冲液	Qiagen	19086
96 孔黑色侧壁透明底检测板	Corning	3651
λ 噬菌体 DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA 试剂	Invitrogen	P7581	双链 DNA 定量试剂，用于实验步骤 2.2.4
Victor 3 V 微孔板读数仪	PerkinElmer
DNA 纯化试剂盒	Zymo Research	D4003
微量离心管	Corning	3621
长波长紫外灯	Fisher Scientific	FBUVLS-80
琼脂糖凝胶 DNA 提取缓冲液	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
EVB100 电转感受态大肠杆菌	Avidity	EVB100
电穿孔仪（E. coli Pulser）	Bio-Rad	1652102
电穿孔比色皿	Bio-Rad	165-2089
分光光度计（Ultrospec 3100 pro）	Amersham Biosciences	80211237
50 ml 锥形管	Corning	430828
质粒纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740588.25
8 排 PCR 管条	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32854	双链 DNA 定量试剂
Qubit 检测管	Invitrogen	Q32856
Qubit 荧光计	Invitrogen	Q32866
氨苄青霉素钠盐	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）	Illumina	MS-102-2003
MiSeq 桌面测序仪	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	也可使用 Illumina HiSeq 平台进行测序
FLASh 软件	约翰·霍普金斯大学 - 开源	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	用于合并下一代测序数据中成对末端读段的软件
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
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501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
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701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG