清醒自由活动小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法

摘要

麻醉小鼠表现出非生理性的全身血压，由于血压与自主神经系统之间存在密切关系，这使得无法对自主神经张力进行有意义的评估。因此，本文介绍了一种在清醒小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法。

摘要

肾交感神经在生理和病理生理过程中均发挥重要作用。在慢性肾病、高血压、心力衰竭、糖尿病和肥胖等众多研究领域中，评估肾交感神经活动（RSNA）具有重要意义。因此，明确交感神经系统的作用对于正确解读实验结果和理解疾病机制至关重要。传统上，RSNA的测量是在麻醉的啮齿类动物（包括小鼠）中进行的。然而，小鼠在麻醉和手术期间通常会出现持续数小时的系统性低血压和血流动力学不稳定。由于交感神经张力与心血管状态密切相关，这种非生理状态会干扰对RSNA的准确解读。为克服传统方法的这一局限性，我们开发了一种在清醒、自由活动的小鼠中测量RSNA的新方法。小鼠被长期植入遥测仪，用于连续监测血压，同时植入颈静脉输注导管和定制的双极电极，以直接记录RSNA。经过48至72小时的恢复期后，小鼠存活率为100%，且所有小鼠行为正常。在此时间点，80%的小鼠成功记录到RSNA，其中70%和50%的小鼠分别在术后4天和5天内获得可分析的信号。所有小鼠均记录到生理范围内的血压值（116±2 mmHg；n=10）。记录到的RSNA在进食和理毛行为期间增加，这与文献报道一致。此外，通过神经节阻断以及使用药理学试剂调节血压，进一步验证了RSNA信号的可靠性。本文描述了一种有效且可操作的方法，可用于在清醒、自由活动的小鼠中清晰记录RSNA。

引言

随着大量基因工程小鼠模型的建立，利用小鼠开展多领域生物医学研究的兴趣持续增长。总体而言，技术进步已跟上小鼠在生理学研究中日益广泛的应用步伐，目前已有大量专为小鼠设计的微型化设备，可用于测量其关键生理参数。尽管用于清醒大鼠直接测量自主神经张力的遥测设备已问世十余年，但目前尚无适用于清醒小鼠的微型化神经活动评估设备。研究人员通常通过间接方法来克服这一限制，例如检测血浆或尿液儿茶酚胺水平、进行药理学自主神经阻断，或对血压/心率波动进行频谱分析¹。

尽管这些方法提供了有价值的信息，但其结果仅能反映整体自主神经张力的全局图像，而无法揭示孤立神经群体对所研究现象的具体贡献。另一种方法是直接记录特定神经的活动，该方法已在麻醉小鼠中实施，但存在诸多问题。在手术后数小时内，维持麻醉小鼠的血压在生理范围内极为困难。事实上，在这类实验中，血压常常未被报告，或仅显示在极低水平（例如60–80 mmHg，而清醒小鼠通常为>100 mmHg）²。由于麻醉小鼠模型中心血管系统的脆弱性，加之血压与交感神经张力之间存在相互依赖关系，往往难以对自主神经活动进行有意义的评估^3,4。

为解决这一局限性，我们开发了一种可在清醒、自由活动的小鼠中....

方案

所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》，并经密西西比大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准。

1. 动物与饲养

1. 实验小鼠（24 - 35 g）到达机构实验动物设施后。
2. 在整个实验方案各阶段，为小鼠提供标准啮齿类动物饲料和自来水，可自由取食和饮用，饲养环境温度和湿度需严格控制。

2. 可植入RSNA电极的定制化制备

注意：应在预定手术前至少提前几天制备可植入的肾交感神经活动（RSNA）电极，以留出足够的时间进行固化和灭菌（如下所述）。

1. 用刀片（最好使用#11刀片）裁剪三段等长的绝缘不锈钢多股导线，每段250 mm（裸线直径0.0254 mm，涂层后直径0.14 mm）。用刀片刮除每段导线一端约15 mm的绝缘层，以暴露底层金属。
   1. 仅将两个导线的裸露端各焊接一个单芯公针连接器（黄铜材质，镀金），以制成双极电极引线（图1A）。第三根导线的末端保持裸露，作为接地线使用。
   2. 将一段短的（约2.0–2.5 cm）直径为1.6 mm的热缩管套在针形连接器和导线上，完全覆盖导线与针形连接器之间新焊接的接头。
      注意：插入放大器头级的针形连接器尖端必须保持裸露。
   3. 用小镊子或止血钳夹住导线，置于热风枪上方加热，使热缩管收缩，从而对针形连接器与导线之间的连接处进行电气绝缘。对第二根导线....

结果

按照所述方案操作，小鼠存活率为100%——本研究中所有接受手术的小鼠均成功存活并恢复良好。术后24小时内，所有小鼠行为正常，表现出典型的进食、理毛和探索行为。此时未见任何疼痛或痛苦迹象。术后48小时，在12只小鼠中有10只记录到了可验证且清晰的肾交感神经活动（RSNA）信号。该信号在术后72小时仍保留在这些小鼠中；然而，至术后第4天，仅有7只（70%）小鼠记录到真实的RSNA信号，至术后第5天则仅有5只（50%）小鼠仍可记录到该信号。那些由于电噪声或心电图信号干扰而未能获得高质量RSNA信号的小鼠，直至实施安乐死时仍保持良好健康状态。

术后48小时，清醒小鼠的平均动脉压为116±2 mmHg，相应的心率为596±22 bpm（n=10）。此时同步记录的血压和肾交感神经活动（RSNA）代表性样本显示，RSNA呈现出清晰可见且具有特征性的节律性放电（图2）。在正常活动（如进食和理毛）过程中，由实验人员直接观察并记录到的RSNA典型性升高现象也存在（图3）。.......

讨论

本文介绍、演示并验证了一种新颖的方法，可在清醒、自由活动并舒适地待在自家笼具中的小鼠身上，对其进行靶向性的肾交感神经活性（RSNA）评估。在手术植入动脉压遥测仪、留置静脉输注导管以及定制的双极RSNA电极后，小鼠术后恢复，并静养48至72小时。在整个实验过程中（包括实验阶段），小鼠始终舒适地待在自家笼具中，可自由获取食物、饮水，并享受环境丰富化措施。所有后续的实验操作均由研究者远程完成，不会对动物造成干扰。就RSNA信号的质量与解读而言，该方法完全避免了麻醉、手术创伤以及束缚状态和其他来自身体与心理应激的不良且不可避免的生理干扰。因此，这些通常会影响交感神经活动测量结果解读的严重混杂因素得以有效消除。

所有小鼠均健康状况良好，术后24小时即表现出明亮、活跃、反应灵敏、进食、饮水、理毛以及嬉戏和探索等典型行为。无论是否成功记录到有效的肾交感神经活动（RSNA）信号，所有动物均表现出这些特征，并积极参与所提供的环境丰富化措施。尽管据报道，植入遥测探针后完全恢复正常血压所需的恢复时间可能长达4–7天⁹，但动脉压恢复至正常水平所需时间要短得多.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特氟龙涂层不锈钢多股绞合线	A-M Systems	793200	直径0.001英寸，裸露；直径0.0055英寸，涂覆
#11 手术刀片	Fisher Scientific	ALMM9011
电烙铁和焊料			任何适用的型号或品牌
雄性微型针式连接器	A-M Systems	520200	镀金黄铜
雌性微型针式连接器	A-M Systems	520100	镀金黄铜
热缩管	Radio Shack	型号：278-1610 | 目录编号：2781610	1.6 mm 直径
聚乙烯90（PE90）管	VWR	CA-63018-703	内径 0.86 mm；外径 1.27 mm
解剖显微镜	徕卡显微系统	Leica M80	任何品牌或型号均可适用
聚乙烯10（PE10）导管	Braintree Scientific	PE10 50 英尺	内径 0.28 mm；外径 0.61 mm
超级胶水液体	Loctite	n/a	液体配方；任何适用品牌均可
超级胶水凝胶	Loctite	n/a	凝胶配方；任何适用品牌
聚乙烯管	科学用品	BB31695-PE/13	用于底座，内径 2.7mm；外径 4.0mm
医院消毒灭菌服务 & 臭氧灭菌包			联系当地医院消毒供应中心
异氟烷麻醉	Abbott	05260-05
Deltaphase等温加热垫 &和手术台	Braintree Scientific	39OP	将加热垫保持在37℃恒温环境中°C 水浴；相应的手术台必不可少
格隆溴铵	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
异氟烷蒸发器系统 &和流量计	Braintree Scientific	VP I	包含医用级氧气供应
组织剪	Fine Science Tools	14173-12
精细弹簧剪	Fine Science Tools	15006-09
小型棉签	Fisher Scientific	23400100
精细直头镊子	Fine Science Tools	11254-20	#5，杜蒙生物学吸头 FST
斜口镊子	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 杜蒙特FST
小型吸收探针	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 组分硅胶聚合物	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	从 WPI 购买额外的专用吸头
5-0 Polysorb 缝合线	泰科医疗	n/a
6-0 丝线缝合线	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel 品牌，线轴
放射遥测探针	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
放射遥测接收器	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
环境压力参考	Data Sciences International (DSI)	4月1日
压力输出适配器	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena 脉冲管路	Braintree Scientific	RPT-040
输液旋转接头	Instech Solomon	375/D/22
旋转支撑臂 &和装片	Instech Solomon	SMCLA
聚砜按钮	Instech Solomon	LW62S/6
不锈钢弹簧	Instech Solomon	PS62
Vetbond 外科粘合剂	3M	n/a
三重抗生素软膏	Fougera	n/a
PowerLab 8通道数据采集系统 &和软件	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC绝缘电缆	Belden	PVC音频连接线 32 AWG
前置放大头stage	Dagan Corporation	Model 4002
差分放大器	Dagan Corporation	EX4-400
硝普钠	Sigma Aldrich	71778-25G
去甲肾上腺素	Sigma Aldrich	P6126-5G
0.9% NaCl 无菌生理盐水	贝克顿·迪金森		联系当地医院供应商
六甲季铵	Sigma Aldrich	H0879-5G
不锈钢顶防震台	n/a	n/a	自行设计定制；使用放置于台面上的实心钢板亦可
法拉第笼	n/a	n/a	定制设计并自主构建
小型动物毛发修剪器	n/a	n/a	药店，适合男士使用的胡须修剪器
脱毛膏	n/a	n/a	Veet 品牌，敏感肌配方
10% 聚维酮碘	普渡产品	Betadiene
70% 乙醇	n/a	n/a
钢制微型牵开器	n/a	n/a	自制。将一个钢制回形针弯曲 & 使用4-0丝线形成牵开线
止血钳	精细科学工具	13011-12
热风枪	Fisher Scientific	09-201-27