通过预防热应激对大鼠的不利影响 枯草芽孢杆菌 菌株

摘要

我们描述了一种通过口服有益细菌进行预处理以预防大鼠热应激效应的实验方案。该方案可经修改后用于不同的给药途径以及不同化合物的分析。

摘要

本研究旨在评估以下因素的保护作用 枯草芽孢杆菌 应对此类热应激相关并发症的品系。本研究共使用32只Sprague-Dawley大鼠。动物每日口服给药两次，持续两天 B. subtilis BSB3 菌株或 PBS。末次处理后的第二天，每组进一步分为两个实验组（一组用 PBS 处理，另一组用） B. subtilis) 置于45 ^o在42°C下持续25分钟。两个对照组在室温下放置25分钟。所有大鼠均被实施安乐死，各组均分析不同参数。热应激的不良影响通过肠上皮绒毛高度和总黏膜厚度的降低、细菌从肠腔移位、红细胞囊泡化增加以及血液中脂多糖（LPS）水平升高来评估。治疗的保护效果通过预防上述副作用来评价。本方案设定为通过口服给予大鼠细菌以预防热应激并发症，但该方案可经修改后用于其他给药途径及不同化合物的分析。

引言

不同的应激源会影响人类和动物的健康。温度是最具应激性的因素之一，可导致慢性、急性甚至致命性疾病¹。在许多情况下，热应激后肠道形态的改变以及肠道屏障完整性的丧失已有记录^2,3。这一保护性屏障负责防止肠道细菌及其毒素（特别是脂多糖（LPS））从肠腔易位至体内循环系统^4,5。肠道微生物群的稳定性显著影响肠道屏障功能、宿主的免疫反应以及对应激条件的耐受能力⁶。因此，调节肠道微生物群可能为预防与应激相关不良效应提供一种新的途径。

有益细菌已被用作一种有前景的策略，通过调节肠道微生物群来有效管理多种临床病症，例如腹泻、炎症性肠病、特应性皮炎和代谢紊乱^7-10益生菌的有益作用包括产生支持肠道健康的必需代谢物、刺激免疫系统、促进乳糖耐受性以及修复上皮功能障碍。益生菌在预防应激相关并发症方面具有显著效果。 体外 在动物模型中^11,12.

研究人员已给予更多关注 芽孢杆菌属 将细菌作为益生菌，因为这些细菌有助于维持肠道稳态¹³ 并对宿主产生有益影响¹⁴我们之前的数据表明具有高效性 芽孢杆菌属 益生菌对抗病原体 体外^15,16 以及在临床试验中^17,18....

方案

所有实验程序均经阿拉巴马州奥本大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 培养基、培养皿和细菌培养物的制备

1. 在锥形瓶中接种10 ml营养肉汤，加入一株在营养琼脂平板上过夜培养的 Bacillus subtilis BSB3 菌落。
2. 配制500 ml孢子形成培养基¹⁹（每升含：Bacto营养肉汤，8 g；10% (w/v) KCl，10 ml；1.2% (w/v) MgSO₄·7H₂O，10 ml；琼脂，15 g），于121 ^oC高压灭菌20分钟。冷却至50 ^oC后，加入以下无菌溶液：1 M Ca(NO₃)₂，1 ml；0.01 M MnCl₂，1 ml；1 mM FeSO₄，1 ml。
3. 将制备好的培养基在室温下冷却至40 ^oC，持续20分钟，在无菌操作台中将25 ml培养基倒入20个无菌培养皿中。静置过夜使培养基凝固。
4. 取0.5 ml过夜培养的 Bacillus subtilis BSB3 菌液，均匀涂布于培养皿中的培养基表面。于37 ^oC培养5天，直至90%形成孢子。通过高分辨率显微镜观察相位明亮的孢子。
5. 向培养皿中加入1 ml....

结果

动物在热应激前和热应激后的平均体温分别为 36.7 ± 0.07 ^oC 和 40.3 ± 0.17 ^oC（P < 0.05）。大鼠暴露于高温（第3组）导致绒毛高度和总黏膜厚度显著降低 （图 2、图 3）。在应激前口服给予BSB3菌株可保护肠道免受高温的有害影响。

通过细菌学分析每只大鼠的肠系膜淋巴结（MLN）、肝脏和脾脏，测定肠道细菌的移位情况。浓度为 1.7 x 10 的细菌培养物³ ± 4.6 × 10² CFU/g 组织 （图4） 仅从经PBS预处理并暴露于高温的大鼠（第3组）的肠系膜淋巴结和肝脏中分离出细菌。对照组大鼠（第1、2组）以及接受BSB3菌株的热应激动物（第4组）的所有检测样本均无菌。脾脏样本中未分离出任何细菌。

讨论

暴露于高温会导致严重的健康问题²⁹。预防和早期发现与热应激相关的并发症至关重要³⁰。 本方案可用于评估各种预防热应激不良影响方法的有效性。

本方案中的关键步骤包括：热处理程序（45 ^oC，25 分钟）；在血液采集和处理过程中使用无热原材料，以防止肠毒素污染；将血清分装样品保存在 -20 ^oC，避免反复冻融；以及在细菌易位分析过程中遵循无菌操作。该方案最初设计用于通过口服给予大鼠细菌，以预防热应激的副作用。对于其他给药途径或其他化合物，本方案可进行相应修改。例如，可在热应激前延长给药时间，或将口服给药改为直肠给药。Bacillus subtilis 细菌被用于在动物暴露于高温前通过口服给药预防热应激并发症。为了治疗热应激引发的并发症，可在动物经历热应激后使用细菌进行治疗，从而对本方案进行调整。

研究表明，体温升高会导致红细胞囊泡化增加，而预先用 B. subtilis 细菌.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich 密苏里州圣路易斯	P4417
乙醇	Pharmco产品公司，美国康涅狄格州布鲁克菲尔德	64-17-5
琼脂	VWR	97064-334
麦康凯琼脂平板	VWR	470180-742
5% 血琼脂平板	VWR	89405-024
含血红素和维生素K的布鲁氏菌血琼脂平板	VWR	89405-032
布因氏液’s固定剂	美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司	15990
大鼠IL-10 ELISA试剂盒	美国加利福尼亚州卡马里奥，Invitrogen	KRC0101
大鼠IL-1β ELISA试剂盒	美国加利福尼亚州卡马里奥，Invitrogen	KRC0011
IL-6 大鼠 ELISA 试剂盒	美国加利福尼亚州卡马里奥，Invitrogen	KRC0061
INF-γ 大鼠 ELISA 试剂盒	美国加利福尼亚州卡马里奥，Invitrogen	KRC4021
TNF-α 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，加利福尼亚州卡马里奥，美国	KRC3011
大鼠LPS ELISA试剂盒	NeoBioLab，马萨诸塞州，美国	RL0275
环境舱 6020-1	卡龙，俄亥俄州马里埃塔，美国	6020-1
离心	Beckman Coulter，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国	Optima L-90K
超速离心机
光学显微镜光学系统	CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本
菌落计数器	美国宾夕法尼亚州匹兹堡费舍尔科学公司	RE-3325
冷冻机	Haier，美国纽约布鲁克林	HCMO50LA
超微量酶标仪	Bio-Tek Instrument，美国佛蒙特州维努斯基	ELx 808
自动洗膜仪	Bio-Tek Instrument，美国佛蒙特州维努斯基	ELx50
移液器	Gilson，Pipetman，法国	P100、P200、P1000
C24 恒温振荡培养箱	美国康涅狄格州恩菲尔德，新不伦瑞克科学公司	经典 C24
摇床振荡器	Reliable Scientific, Inc.，Nesbit，密西西比州，美国	55
培养皿	Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国	875713	100 mm × 15 mm
SterilGard III Advance	美国缅因州桑福德巴克公司	SG403
培养用生长瓶	康宁公司，美国纽约州康宁市	4995	PYREX 250 ml 锥形瓶
光学光谱仪 Genesys 20	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	4001
Sony DXC-33 视频摄像机	索尼
理查德森测试载玻片	美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司	80303
Millipore 水纯化系统	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus 软件	美国马里兰州，媒体控制学公司
三梁天平	OHAUS 公司，帕西帕尼，新泽西州，美国
组织匀浆器，Dounce	VWR	71000-518