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方法文章

通过预防热应激对大鼠的不利影响 枯草芽孢杆菌 菌株

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DOI：

10.3791/54122

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2016年7月11日

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, Auburn University

本文内容

摘要

我们描述了一种通过口服有益细菌进行预处理以预防大鼠热应激效应的实验方案。该方案可经修改后用于不同的给药途径以及不同化合物的分析。

摘要

本研究旨在评估以下因素的保护作用 枯草芽孢杆菌 应对此类热应激相关并发症的品系。本研究共使用32只Sprague-Dawley大鼠。动物每日口服给药两次，持续两天 B. subtilis BSB3 菌株或 PBS。末次处理后的第二天，每组进一步分为两个实验组（一组用 PBS 处理，另一组用） B. subtilis) 置于45 o在42°C下持续25分钟。两个对照组在室温下放置25分钟。所有大鼠均被实施安乐死，各组均分析不同参数。热应激的不良影响通过肠上皮绒毛高度和总黏膜厚度的降低、细菌从肠腔移位、红细胞囊泡化增加以及血液中脂多糖（LPS）水平升高来评估。治疗的保护效果通过预防上述副作用来评价。本方案设定为通过口服给予大鼠细菌以预防热应激并发症，但该方案可经修改后用于其他给药途径及不同化合物的分析。

引言

不同的应激源会影响人类和动物的健康。温度是最具应激性的因素之一，可导致慢性、急性甚至致命性疾病1。在许多情况下，热应激后肠道形态的改变以及肠道屏障完整性的丧失已有记录2,3。这一保护性屏障负责防止肠道细菌及其毒素（特别是脂多糖（LPS））从肠腔易位至体内循环系统4,5。肠道微生物群的稳定性显著影响肠道屏障功能、宿主的免疫反应以及对应激条件的耐受能力6。因此，调节肠道微生物群可能为预防与应激相关不良效应提供一种新的途径。

有益细菌已被用作一种有前景的策略，通过调节肠道微生物群来有效管理多种临床病症，例如腹泻、炎症性肠病、特应性皮炎和代谢紊乱7-10益生菌的有益作用包括产生支持肠道健康的必需代谢物、刺激免疫系统、促进乳糖耐受性以及修复上皮功能障碍。益生菌在预防应激相关并发症方面具有显著效果。 体外 在动物模型中11,12.

研究人员已给予更多关注 芽孢杆菌属 将细菌作为益生菌，因为这些细菌有助于维持肠道稳态13 并对宿主产生有益影响14我们之前的数据表明具有高效性 芽孢杆菌属 益生菌对抗病原体 体外15,16 以及在临床试验中17,18. 在此，我们旨在评估预防作用 B. subtilis BSB3菌株对热应激后并发症的防护作用

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方案

所有实验程序均经阿拉巴马州奥本大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 培养基、培养皿和细菌培养物的制备

  1. 在锥形瓶中接种10 ml营养肉汤，加入一株在营养琼脂平板上过夜培养的 Bacillus subtilis BSB3 菌落。
  2. 配制500 ml孢子形成培养基19（每升含：Bacto营养肉汤，8 g；10% (w/v) KCl，10 ml；1.2% (w/v) MgSO4·7H2O，10 ml；琼脂，15 g），于121 oC高压灭菌20分钟。冷却至50 oC后，加入以下无菌溶液：1 M Ca(NO3)2，1 ml；0.01 M MnCl2，1 ml；1 mM FeSO4，1 ml。
  3. 将制备好的培养基在室温下冷却至40 oC，持续20分钟，在无菌操作台中将25 ml培养基倒入20个无菌培养皿中。静置过夜使培养基凝固。
  4. 取0.5 ml过夜培养的 Bacillus subtilis BSB3 菌液，均匀涂布于培养皿中的培养基表面。于37 oC培养5天，直至90%形成孢子。通过高分辨率显微镜观察相位明亮的孢子。
  5. 向培养皿中加入1 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS），使用无菌细胞刮刀刮取菌体以收获细菌。将菌悬液储存于冰箱中，待用时取出。
  6. 通过将适当稀释度（10-5 至 10-6）的0.1 ml细菌悬液涂布于孢子形成培养基平板，并在37 oC培养18–24小时，以确认细菌的活性。
  7. 使用菌落计数器统计平板上的菌落数量，计算待测悬液中的细菌滴度。用PBS将细菌悬液调整至终浓度为1 × 108 CFU/ml。

2. 动物

  1. 使用32只雄性Sprague–Dawley大鼠（250 - 300 g），在无特定病原体条件下饲养，自由摄取标准颗粒饲料和水。维持平均温度（21 ± 1 oC）、湿度（50 ± 5%）以及12小时光照-黑暗循环。

3. 实验设计

  1. 在动物适应环境2天后，开始通过口服灌胃进行处理11。使用带有口服灌胃针的注射器，对16只大鼠每天两次给予B. subtilis BSB3悬液（每只1 ml），连续给药两天（B. subtilis组）；另对16只大鼠每天两次给予PBS（每只1 ml），连续两天（PBS组）（图1）。
  2. 处理结束后，将每组再细分为四个亚组（每组8只大鼠）：第1组为对照组（PBS/无应激），第2组为B. subtilis组（B. subtilis/无应激），第3组为应激组（PBS/热应激），第4组为B. subtilis加应激组（B. subtilis/热应激）。
  3. 使用电子数字体温计测量每只大鼠的直肠温度。将第1组和第2组大鼠置于室温下25分钟。将第3组和第4组动物置于温度45 oC、相对湿度55%的气候室中25分钟。
  4. 之后，使用电子数字体温计再次测量所有组别中每只大鼠的直肠温度，并将所有动物在室温下静置4小时。
  5. 在可密封的麻醉罐中使用异氟烷（2–4%）对大鼠进行麻醉，观察至大鼠深度麻醉（对足趾夹捏无反应）。采用断头器快速断头法处死大鼠。
  6. 使用无热原移液管从每只大鼠收集躯干血20（15–16 ml），放入无热原试管中以获取血清，并立即用移液器取每只大鼠7 µl血液样本用于显微镜检查。
  7. 将装有血液的试管置于冰箱中至少30分钟，以促进凝固。在20 oC下以7,000 × g离心10分钟，迅速用移液器吸取血清。将每只大鼠获得的血清分装为每份50 µl，于-20 oC保存直至检测。

4. 手术步骤

  1. 使用电剪剪除尸体腹侧腹部和胸部的所有毛发。将尸体置于无菌柜中，并用70%酒精处理去毛后的表面。
  2. 使用无菌手术刀在腹部正中做切口。用无菌镊子从每只大鼠体内取出肝脏、肠系膜淋巴结、脾脏和小肠。

5. 细菌移位分析 

  1. 将每份肝脏、肠系膜淋巴结和脾脏样本放入预先称重的无菌试管中并称重。通过计算含有样本的试管重量与空试管重量之差，得出样本重量。
  2. 向试管中加入无菌 PBS，使样本制成 1:10 (w/v) 的稀释液，并使用无菌玻璃组织匀浆器对每个样本进行匀浆，以获得均匀的悬浮液21。
  3. 用无菌 PBS 对每个样本进行连续稀释（10-1 至 10-4）。取每种组织各稀释度的 0.1 ml，分别接种于麦康凯琼脂、5% 血液琼脂以及添加氯化血红素（0.005 g/L）和维生素 K1（0.01 g/L）的布氏杆菌血液琼脂平板表面。
  4. 将麦康凯琼脂和 5% 血液琼脂平板在需氧条件下、布氏杆菌血液琼脂平板在厌氧条件下，于 37 oC 培养22。
  5. 培养 24 小时后计数需氧菌菌落，培养 48 小时后计数厌氧菌菌落，使用菌落计数器进行计数。结果以每克组织中菌落形成单位（CFU）的数量表示。

6. 组织学分析 

  1. 通过手术操作（步骤 4.1 - 4.2）从每只大鼠取出小肠样本。用Bouin固定液固定样本，经石蜡包埋后制备 6 µm 切片，并按照标准程序23进行苏木精-伊红染色。
  2. 使用高分辨率显微镜系统测量每份样本的小肠绒毛高度和总黏膜厚度（放大倍数 100X）24。每只大鼠分析 4 份样本，每份样本至少进行二十次测量。结果以微米表示。

7. 细胞因子检测

  1. 根据制造商的说明书，使用商业化的大鼠ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ和IL-10的细胞因子水平。
  2. 利用相应试剂盒的标准品为每组检测样本绘制标准曲线，并通过将实验数据与适当的标准曲线进行比较，确定各样本中细胞因子的水平。

8. 脂多糖检测

  1. 根据制造商的说明书，使用大鼠LPS ELISA试剂盒检测血清中LPS的水平。通过将所获得的数值与标准曲线的数值进行比较，估算样本中LPS的浓度。

9. 血液的高分辨率光学显微镜观察

  1. 使用先前描述的显微镜系统25,26。将显微镜系统、摄像机和计算机置于减震平台上25，以记录实时图像。使用Richardson载玻片对测试图像进行校准，方法如前所述27。
  2. 取每只大鼠新鲜抽取的血液7 µl置于玻璃载玻片上，加盖盖玻片，拍摄并记录每个样本中10个72 × 53.3 µm2视野的图像（放大倍数1,700倍）。
  3. 使用可实时提供高分辨率直接可视光学图像的软件测定囊泡浓度。每种实验条件下至少分析20个图像帧28。

10. 统计学

  1. 以均值和标准差表示所有数值。进行统计分析并绘制图表。采用双样本 t 检验分析结果，设定显著性水平为 0.05 以定义统计学显著性。

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结果

动物在热应激前和热应激后的平均体温分别为 36.7 ± 0.07 oC 和 40.3 ± 0.17 oC（P < 0.05）。大鼠暴露于高温（第3组）导致绒毛高度和总黏膜厚度显著降低 （图 2、图 3）。在应激前口服给予BSB3菌株可保护肠道免受高温的有害影响。

通过细菌学分析每只大鼠的肠系膜淋巴结（MLN）、肝脏和脾脏，测定肠道细菌的移位情况。浓度为 1.7 x 10 的细菌培养物3 ± 4.6 × 102 CFU/g 组织 （图4） 仅从经PBS预处理并暴露于高温的大鼠（第3组）的肠系膜淋巴结和肝脏中分离出细菌。对照组大鼠（第1、2组）以及接受BSB3菌株的热应激动物（第4组）的所有检测样本均无菌。脾脏样本中未分离出任何细菌。

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讨论

暴露于高温会导致严重的健康问题29。预防和早期发现与热应激相关的并发症至关重要30。 本方案可用于评估各种预防热应激不良影响方法的有效性。

本方案中的关键步骤包括：热处理程序（45 oC，25 分钟）；在血液采集和处理过程中使用无热原材料，以防止肠毒素污染；将血清分装样品保存在 -20 oC，避免反复冻融；以及在细菌易位分析过程中遵循无菌操作。该方案最初设计用于通过口服给予大鼠细菌，以预防热应激的副作用。对于其他给药途径或其他化合物，本方案可进行相应修改。例如，可在热应激前延长给药时间，或将口服给药改为直肠给药。Bacillus subtilis 细菌被用于在动物暴露于高温前通过口服给药预防热应激并发症。为了治疗热应激引发的并发症，可在动物经历热应激后使用细菌进行治疗，从而对本方案进行调整。

研究表明，体温升高会导致红细胞囊泡化增加，而预先用 B. subtilis 细菌...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由奥本大学基金 FOP 101002-139294-2050 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich 密苏里州圣路易斯P4417
乙醇 Pharmco产品公司，美国康涅狄格州布鲁克菲尔德 64-17-5
琼脂VWR97064-334
麦康凯琼脂平板VWR470180-742
5% 血琼脂平板VWR89405-024
含血红素和维生素K的布鲁氏菌血琼脂平板VWR89405-032
布因氏液’s固定剂美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司15990
大鼠IL-10 ELISA试剂盒美国加利福尼亚州卡马里奥，InvitrogenKRC0101
大鼠IL-1β ELISA试剂盒美国加利福尼亚州卡马里奥，InvitrogenKRC0011
IL-6 大鼠 ELISA 试剂盒美国加利福尼亚州卡马里奥，InvitrogenKRC0061
INF-γ 大鼠 ELISA 试剂盒美国加利福尼亚州卡马里奥，InvitrogenKRC4021
TNF-α 大鼠 ELISA 试剂盒Invitrogen，加利福尼亚州卡马里奥，美国KRC3011
大鼠LPS ELISA试剂盒NeoBioLab，马萨诸塞州，美国RL0275
环境舱 6020-1卡龙，俄亥俄州马里埃塔，美国6020-1
离心 Beckman Coulter，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国Optima L-90K
超速离心机
光学显微镜光学系统CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本
菌落计数器美国宾夕法尼亚州匹兹堡费舍尔科学公司RE-3325
冷冻机Haier，美国纽约布鲁克林HCMO50LA
超微量酶标仪Bio-Tek Instrument，美国佛蒙特州维努斯基ELx 808
自动洗膜仪Bio-Tek Instrument，美国佛蒙特州维努斯基ELx50
移液器Gilson，Pipetman，法国P100、P200、P1000
C24 恒温振荡培养箱美国康涅狄格州恩菲尔德，新不伦瑞克科学公司经典 C24
摇床振荡器 Reliable Scientific, Inc.，Nesbit，密西西比州，美国55
培养皿Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国875713100 mm × 15 mm
SterilGard III Advance美国缅因州桑福德巴克公司SG403
培养用生长瓶康宁公司，美国纽约州康宁市4995PYREX 250 ml 锥形瓶
光学光谱仪 Genesys 20Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆4001
Sony DXC-33 视频摄像机索尼
理查德森测试载玻片美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司80303
Millipore 水纯化系统MilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus 软件美国马里兰州，媒体控制学公司
三梁天平OHAUS 公司，帕西帕尼，新泽西州，美国
组织匀浆器，DounceVWR71000-518

参考文献

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