基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

摘要

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。

摘要

本方法描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测方法，该方法已开发并验证，用于定量检测在不同培养条件下由纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞产生的细胞外嘌呤核苷酸和核苷。腺苷5'-单磷酸（AMP）、腺苷（ADO）和肌苷（INO）的色谱分离在室温下于基于硅胶的反相色谱柱上进行，该色谱柱可用于极性化合物的保留。该方法采用由7 mM乙酸铵和乙腈组成的二元流动相，流速为1.00 ml/min。使用设定在260 nm波长的光电二极管阵列紫外检测器监测洗脱液。通过生成标准校准曲线，计算出每种嘌呤化合物分析定量的方程。随后进行系统控制、数据采集与分析。应用本方案时，AMP、INO和ADO的洗脱时间分别为7、11和11.9分钟，每个样品的总运行时间为20分钟。该方案可适用于不同类型的细胞和细胞系（包括悬浮和贴壁细胞），并以培养基作为基质。其优点在于样品前处理简便快速，且仅需少量上清液即可完成分析。此外，使用无血清培养基可省略乙腈蛋白沉淀步骤，避免对嘌呤化合物最终浓度造成影响。该方法的一个局限性在于每次单一样品运行前均需进行色谱柱平衡运行，导致实验总运行时间延长，因而不适用于高通量筛选应用。

引言

腺苷（ADO）是一种嘌呤核苷，其腺嘌呤分子通过糖苷键连接到核糖糖基上。当存在于细胞外环境时，它可通过抑制免疫系统的过度反应来保护细胞免受损伤。这一作用已在多种疾病模型中得到证实，例如结肠炎¹、糖尿病²、哮喘³、脓毒症⁴和缺血性损伤⁵。ADO的主要功能之一是抑制肿瘤微环境中的免疫应答，从而促进肿瘤的免疫逃逸⁶。因此，参与ADO生成及其信号传导的机制具有重要的治疗研究价值⁷。

在正常生理条件下，组织微环境中的腺苷（ADO）水平相对较低，且明显低于免疫细胞的检测阈值。然而，在缺氧、缺血、炎症、感染、代谢应激以及肿瘤转化过程中，ADO水平会迅速升高⁸。细胞外ADO水平的升高作为对组织损伤信号的响应，具有双重功能：一方面以自分泌和旁分泌方式报告组织损伤，另一方面引发可普遍视为细胞保护性的组织反应。

细胞外腺苷（ADO）可通过多种机制生成，包括通过核苷转运蛋白介导从细胞内区室释放，或因腺苷脱氨酶功能受损导致降解受阻而积累。导致细胞外ADO水平升高的主要途径涉及一系列外核苷酸酶的作用，这些酶是膜结合的外切酶，可通过磷酸水解死亡或濒死细胞释放的核苷酸来生成ADO。该途径依次由CD39（外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1）和CD73（5'-核苷酸酶）催化完成：CD39将细....

方案

CLL 血液样本的获取遵循机构指南和《赫尔辛基宣言》。

1. 从慢性淋巴细胞白血病患者血液样本中分离白血病淋巴细胞

1. 用肝素钠抗凝管（绿色管帽）采集血样¹⁷。
2. 用室温 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）将全血按 1:3 比例稀释。
3. 通过密度梯度离心法从血样中纯化外周血单个核细胞（PBMC）。
   1. 在 15 ml 离心管中加入 5 ml 密度梯度离心介质（例如，Ficoll），小心加入 10 ml 稀释后的血液。立即在室温下以 1,500 × g 离心 20 分钟。
4. 用连接真空泵的玻璃巴斯德吸管吸去部分上清液，用 5 ml 吸管收集密度梯度介质与稀释血浆界面之间的 PBMC 白膜层。转移至 50 ml 离心管中，加入 PBS 洗涤（终体积 50 ml），在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。
5. 用玻璃巴斯德吸管吸去上清液，将沉淀重悬于 50 ml PBS 中，并用血细胞计数板计数细胞。
6. 按照标准免疫染色流程，使用抗 CD19 和抗 CD5 抗体对 PBMC 进行染色，通过流式细胞术检测 PBMC 亚群组成¹⁸。
   注意：慢性淋巴细胞白血病（CLL）淋巴细胞为 CD19⁺/CD5⁺。
7. 使用流式细胞仪检测 CD19

结果

为评估一例代表性慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者新鲜纯化的外周血单个核细胞（PBMC）中白血病细胞的百分比（%），使用抗CD19和抗CD5抗体对细胞进行标记。图3左侧面板显示针对活细胞设置的选择性门控的流式细胞术散点图。图3展示了CLL患者PBMC在B细胞纯化前（中面板）和纯化后（右面板）的示例。

CD73⁺ CLL 细胞中嘌呤类化合物的 HPLC 定量分析示例如图 4A所示。AMP、INO 和 ADO 在 260 nm 处不同的保留时间可实现这些化合物的同步定量。当实验条件正确时，所有核苷酸和核苷的色谱峰均能实现良好的分离。以 200 µM AMP 作为起始底物浓度时，ADO 和 INO 的色谱峰清晰可见，其浓度处于标准曲线的检测范围内。然而，即使使用较低浓度的底物（e.g., 100 µM），也能获得理想的结.......

讨论

本文所述方案可用于评估纯化的人白血病细胞培养上清液中CD39/CD73腺苷代谢系统的活性。通过该高效液相色谱（HPLC）方法，可追踪并定量测定由CD73依赖性酶促反应生成的腺苷（ADO），以及其随后被CD26/ADA依赖性途径降解为肌苷（INO）的过程。使用酶抑制剂有助于对实验流程进行控制，并设置内部对照。本方案的优点与创新之处在于：i）适用于处于培养状态的活细胞；ii）所需培养基用量少；iii）样品前处理极为简便。

我们的系统由一个分离模块组成，该模块配备四元低压混合泵、在线真空脱气装置和自动进样器。AMP、ADO 和 INO 的色谱分离是在基于硅胶的反相色谱柱上实现的，该色谱柱用于极性化合物的保留。二元流动相系统由缓冲液 A（7 mM 乙酸铵溶于双去离子水中，用盐酸调节 pH 至 3.0）和缓冲液 B（乙腈）组成。

该HPLC方法灵敏、可靠且可重复，适用于不同的细胞培养模型，包括贴壁细胞和悬浮细胞。该方法也可用于比较不同的培养条件，例如常氧（21% O₂）与低氧（1-3% O₂）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人血
Milli-Q 水	Millipore		双去离子水
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
纯化的抗-CD3、-CD14、-CD16 抗体	实验室自制		小鼠单克隆抗体
PE 标记的抗-CD19 抗体	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC 标记的抗-CD5 抗体	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads 羊抗小鼠 IgG 磁珠	Invitrogen	11031
磷酸盐缓冲液（PBS）	Amresco	E404-200TABS	片剂
牛血清白蛋白（BSA）	ID bio	1000-70	标准级
分离缓冲液			PBS 含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA，pH 7.4
AIM V 无血清培养基	GIBCO	12055-091	液体（研究级）
腺苷 5’-二磷酸（ADP）	Sigma-Aldrich	A2754
腺苷 5’-单磷酸（AMP）	Sigma-Aldrich	A1752
腺苷（ADO）	Sigma-Aldrich	A9251
肌苷（INO）	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-亚甲基-ADP（APCP）	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 抑制剂
EHNA 盐酸盐	Sigma-Aldrich	E114	腺苷脱氨酶抑制剂
脱氧辅酶霉素（dCF）	Tocris	2033	腺苷脱氨酶抑制剂
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
双嘧达莫	Sigma-Aldrich	D9766	核苷转运体抑制剂
乙腈（CHROMASOLV Plus）	Sigma-Aldrich	34998	HPLC 级
乙酸铵	Sigma-Aldrich	9688	7 mM，pH 3.0
盐酸	Sigma-Aldrich	30721-1L	最低浓度 37%
名称	公司	目录编号	备注
设备
Bürker 细胞计数器	VWR	631-0920	血细胞计数板
DynaMag-15 磁力架	Invitrogen	12301D	Dynal 磁珠分离器
微量离心安全锁扣管	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET 离心管	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 注射式滤器	Sartorius Stedim Biotech	17821	膜孔径 0.2 µm
短螺纹小瓶	VWR	548-0029	1.5 ml/玻璃
微量内插管	VWR	548-0006	0.1 ml/玻璃
螺旋盖	VWR	548-0085	9 mm/聚丙烯蓝色
Atlantis dC18 色谱柱	Waters	186001344	5 µm，4.6 mm × 150 mm
Atlantis dC18 保护柱	Waters	186001323	5 µm，4.6 mm × 20 mm
Waters Alliance 2965 分离模块	Waters		HPLC 分离模块
Waters 2998 光电二极管阵列（PDA）检测器	Waters		紫外检测器
Waters Empower2 软件	Waters