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Brachionus 轮虫生存时间的测定：母体条件的同步化

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DOI：

10.3791/54126

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2016年7月22日

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1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

本文内容

摘要

轮虫是用作生态毒理学和衰老研究模型的微型浮游动物。本文提供了一种在Brachionus轮虫中进行高效且可重复的生存时间测定的实验方案。连续多代保持培养条件的一致性尤为重要，因为母体状况会影响子代的生命史特征。

摘要

轮虫是一类世界性分布的微型浮游动物，由于具有寿命短、易于培养以及孤雌生殖（可实现克隆培养）等优势，常被用作生态毒理学和衰老研究的模式生物。然而，在测定其存活时间时需格外谨慎，因为其存活时间会受到母体年龄和母体营养条件的影响。本文提供了一种在对多代培养条件进行严格同步后，对Brachionus属轮虫存活时间进行高效且可重复测定的实验方案。经验表明，若同步化程度不足，会导致早期死亡率升高以及存活率逐渐下降，从而显著降低统计效力。事实上，在未充分同步的条件下，热量限制（CR）未能显著延长B. plicatilis的寿命；而在此前及本研究中，使用高度同步化轮虫样本的实验已证实热量限制可延长其寿命。该方案可能也适用于其他无脊椎动物模型，包括果蝇Drosophila melanogaster和线虫Caenorhabditis elegans，因为在这些物种中也已报道存在母体年龄效应。

引言

轮虫是一类微观的广布性浮游动物（<1 mm），属于轮虫动物门1。其身体结构简单，体细胞数量约为1,000个，并具有一个称为头冠的轮状纤毛结构，用于运动和摄食。大多数轮虫属于单巢纲（Monogononta）或蛭形纲（Bdelloidea），分别包含约1,600种和500种2。单巢纲轮虫通常具有有性和无性两种繁殖阶段（周期性孤雌生殖），而蛭形纲轮虫则通过专性孤雌生殖进行繁殖3。因此，可以获得遗传上完全相同的轮虫个体，从而确保实验具有高度的可重复性。此外，轮虫作为模式生物还具备多种其他优势，例如寿命短、易于培养、拥有已测序的基因组和转录组数据4-7，以及在系统发育上与节肢动物和线虫相距较远的独特位置8。因此，轮虫在生态学、毒理学和衰老研究中是一种极具前景的无脊椎动物模型9-12。

在这些研究领域中，暴露于环境胁迫或化学物质下的存活时间是一个常被测量的参数13-19。然而，在测量轮虫存活时间时需格外谨慎，因为其易受母体环境条件的影响。例如，在单巢轮虫Brachionus manjavacas中，来自年老母体的雌性子代寿命短于来自年轻母体的子代；但母体的热量限制（CR）可在一定程度上抵消高龄母体带来的不利影响20。在B. plicatilis中，母体的热量限制可使子代具有更长的寿命、在饥饿条件下更长的存活时间以及更高的氧化应激抗性，这些均与抗氧化酶表达水平的增强相关21,22。母体年龄效应在蛭形轮虫中也已被观察到23。因此，在进行存活时间测量之前，应谨慎地在多个世代中同步实验轮虫的培养条件。

本文提供了一种在多代培养条件同步后测定Brachionus轮虫存活时间的实验方案。采用间歇性禁食（IF）——即周期性喂食轮虫的热量限制（CR）变体——以揭示由于间歇性禁食对寿命的已知影响所带来的同步化效应22,24。

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方案

1. 培养基的制备

注意：使用稀释一半的 Brujewicz 人工海水，盐度为 16.5 ppt（PSU）。其他类型的人工海水也常用于培养 Brachionus 轮虫25,26。

  1. 向4.5 L蒸馏水中加入454 mM NaCl、26 mM MgCl2、27 mM MgSO4、10 mM KCl和10 mM CaCl2（最终体积为5 L）。也可使用去离子稀释水代替蒸馏水。在其他所有盐溶解后，再加入CaCl2。
  2. 配制0.48 M NaHCO3储备液（200倍浓度），取25 ml加入上述溶液中，NaHCO3的终浓度为2.4 mM。
  3. 配制0.4 M NaBr储备液（500倍浓度），取10 ml加入上述溶液中，NaBr的终浓度为0.8 mM。用蒸馏水定容至5 L。
  4. 用0.45 µm膜滤器过滤该溶液。使用前用无菌水按1:1体积比稀释。
    注意：可将Brujewicz人工海水配制成2倍浓度的储备液。

2. 一般培养条件

  1. 在20至30 °C条件下，将实验室培养或野外捕获的轮虫置于无菌的100 ml烧杯中进行培养。较高温度会导致寿命缩短并加速繁殖。为实验操作方便，建议使用25 °C。轮虫密度或人工海水体积在此并非关键因素。
  2. 在人工海水中培养食物微藻种类 11。详见Snell et al. (2014) 的描述 11。通常使用Tetraselmis tetrathele (~2 × 105 个细胞/ml27,28)、T. suecica (~6 × 105 个细胞/ml25,29) 和 Nannochloropsis oculata (~7 × 106 个细胞/ml30,31)。 由于食物藻类（种类、培养条件、生化组成）显著影响Brachionus轮虫的存活时间，所有实验组应使用同一批次的微藻。
  3. 通过定期投喂和更换培养液（例如，每2天投喂一次，每周接种一次），以批量培养方式维持轮虫的保种群体。当轮虫处于最佳状态时，可观察到大量新生幼体以及携带2-3个卵的成体。
    注意：获取实验用轮虫的另一种方法是孵化休眠卵。由休眠卵孵化的轮虫被认为具有良好的同步性，其寿命与由非混交卵孵化的轮虫无显著差异11。然而，来自休眠卵的轮虫比来自非混交卵的轮虫更早开始繁殖。因此，在测量其繁殖特征时需格外谨慎。

3. 通过预培养同步轮虫

  1. 从原种群中选取单个轮虫，按照 2.1-2.3 节所述方法培养，建立用于实验的亚种群。通常培养两周。
  2. 从该亚种群中收集携带卵的轮虫（收集数量为实验所需个体数的两倍），将其作为单一的同龄群体（密度：约 50 个个体/mL），在 6 孔培养板中按照 2.1-2.3 节所述方法，在新鲜培养基中进行自由摄食（ad libitum）培养。控制种群密度至关重要，因为条件化培养基会影响Brachionus轮虫的生殖生理学特性32,33。
  3. 将成体产下的第一批卵孵化出的幼体转移至新配制的培养基中。重复此操作 2-3 代。
  4. 使用在特定时间段内（例如，<3 小时）孵化出的幼体来测定存活时间。为避免在选择单一个体时可能存在的偏差（尽管概率极低），应使用多个独立的亚种群验证实验的可重复性。
    注意：由于轮虫在此条件下通常仅进行无性繁殖，需确保整个实验过程中无雄性个体存在。雄性个体比幼体更小，且通常比雌性运动更快。在特定条件下，混交雌性与非混交雌性的寿命不同29。

4. 生存时间的测定

  1. 将新生个体置于塑料培养板中（通常使用24孔或48孔板，每孔加入1 ml人工海水）。
  2. 每隔24小时将轮虫转移至新配制的培养液中；若在较高温度（30 °C及以上）条件下培养，则每隔12小时转移一次。记录每个个体的子代数量及其存活状态。当轮虫头冠纤毛的运动完全停止时，记录为死亡。
    注意：轮虫常附着于孔板侧壁。轻柔吹打液体有助于发现轮虫。若未能找到轮虫，或其在吹打过程中意外受损，应记录为"删失"，而非"死亡"。
  3. 当实验用轮虫开始活跃繁殖时，及时移除新生个体。新生个体生长迅速，有时难以与实验用轮虫区分。

5. 数据分析

  1. 通过在Y轴上绘制累积生存率、在X轴上绘制时间，生成Kaplan-Meier生存曲线（图1和图2）。这是生存数据最常用的表示方法。使用非参数的对数秩检验（也称为Mantel-Cox检验）对生存时间进行统计学比较34。其他标准统计软件包（如JMP和R）也包含对数秩检验。
    注意：不要使用Student t检验或方差分析（ANOVA）后接参数多重比较方法，因为生存数据通常不符合正态分布35。此外，这些方法未考虑删失个体。若无删失数据，可使用Mann-Whitney U检验。

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结果


图1 显示了不同步化程度较高的种群的代表性生存曲线（共两个重复）。在此实验中，轮虫每日被喂食 [随意摄取 （AL组）或隔日喂食（IF组）。AL组和IF组的中位生存时间分别为13天和18天。尽管已知间歇性禁食（IF）可延长轮虫的寿命，但本实验未能检测到AL组与IF组之间在寿命上的统计学显著差异。从经验上看，同步化不足会导致早期死亡率升高，并引起存活率逐渐下降，正如本实验所观察到的结果。由于处理不当或亚群所处水体质量较差而对轮虫造成的损伤，也往往会产生类似结果。

当轮虫的培养条件处于最佳状态且个体间发育同步良好时，早期死亡现象几乎观察不到，因此轮虫通常在实验的后期阶段以同步化的方式死亡（图2）。AL组和IF组的中位生存时间分别为13天和20天。尽管本实验所用动物数量少于图1中的实验，但两组之间的寿命差异在统计学上仍具有显著性。此...

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讨论

本方案描述了一种测量Brachionus轮虫存活时间的方法。关键步骤是在多个世代中实现轮虫状态的同步化。当实验用轮虫实现良好同步时，通常会观察到典型的I型存活曲线，早期死亡率极低，这与此前多项研究报道的结果一致18,24,37,38。因此，其存活时间的标准差相较于不同步的轮虫更小，从而提高了统计效能。同步化还有望提高存活时间测量的可重复性——由于母代在最佳条件下培养，本方案可抵消母代可能带来的不利影响。若在仔细同步后仍观察到早期死亡现象，建议使用新配制的培养基、另一批次的饵料藻类，或重新建立实验群体（即，从步骤3.1重新开始）。

该方案的一个局限性在于，高度同步的轮虫可能具有潜在的过度敏感性。例如，在筛选延长寿命的化学物质时，本方案筛选出的一些化学物质可能无法检测到对不同步性较强的轮虫寿命产生显著影响的效果例如，来自野生和批量培养种群的个体）。因此，对此类实验结果的解读应持谨慎态度。

母体年龄对子代生存时间的影响也在其他无脊椎动物模型中得到报道，包括果...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢海洋生物学实验室的 George Jarvis 、Martha Bock 和 Bette Hecox-Lea 在拍摄过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Wako190-13921
氯化镁Wako136-03995
硫酸镁Wako131-00427
氯化钾Wako168-22111
氯化钙Wako035-00455
碳酸氢钠Wako199-05985
溴化钠Wako190-01515
膜滤器（0.45 µm 孔径）MilliporeHAWP04700
培养板，6孔，未处理Thomas Scientific6902D01平底
培养板，48孔，未处理Thomas Scientific6902D07平底
活体四鞭藻（Tetraselmis）Carolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersion 6.0d

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