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记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

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DOI：

10.3791/54142

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2016年6月19日

 ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning, Beijing Normal University, 2Department of Biomedical Science, The University of Sheffield

本文内容

摘要

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。

摘要

昆虫感光细胞和视觉中间神经元的电压反应可通过传统的尖锐微电极进行精确记录。本文所述方法可使研究者从单个细胞中稳定记录持续时间较长（从数分钟至数小时）的高质量胞内反应 黑腹果蝇 R1-R6感光细胞和大单极细胞（LMCs）对光刺激的反应。由于记录系统噪声较低，该技术可用于研究果蝇复眼中单个细胞之间的变异，以及这些细胞的输出如何反映视觉环境的物理特性。本文概述了实施该技术的全部关键步骤。首先介绍了构建适合记录的电生理装置的基本步骤，包括实验设备的设计与选型。随后说明了如何制备合适的（尖锐的）记录电极和（钝头的）参考电极以进行记录前准备。详细描述了如何将一只完整的果蝇固定在定制的果蝇固定装置中，在其复眼上制作一个小窗口，并以最小损伤的方式将记录电极插入该窗口。本文还解释了如何定位细胞感受野的中心，对被研究细胞进行暗适应或光适应，并记录其对动态光刺激的电压反应。最后，阐述了稳定正常记录的判断标准，展示了单个细胞对不同光刺激所产生特征性的高质量电压反应，并简要定义了如何量化其信号传递性能。该方法的许多环节在技术上具有挑战性，需要反复练习和耐心才能掌握。但一旦研究人员熟练掌握并根据实验目标进行优化，该技术将提供卓越的 体内 神经生理学数据

引言

果蝇（Drosophila melanogaster）的复眼是研究感光细胞和中间神经元阵列在神经图像采样与处理以及动物视觉中功能组织的优秀模型系统。该系统具有最完整的连接图谱1,2，并易于进行遗传操作和精确的神经活动监测（具有高信噪比和时间分辨率）3-10。

果蝇（Drosophila）的复眼呈模块化结构，包含约750个看似规则、由晶状体覆盖的结构单元，称为小眼（ommatidia），这些小眼共同为果蝇提供几乎覆盖头部周围所有方向的全景视觉视野。眼睛的主要信息采样单元是其杆状感光细胞7,8,11。每个小眼包含八个感光细胞（R1-R8），它们共享同一个角膜小眼面，但朝向七个不同的方向。外层感光细胞R1-R6对蓝绿光最敏感，而位于其上方、朝向相同方向的内层细胞R7和R8则表现出三种不同的光谱敏感亚型：浅色型（pale）、黄色型（yellow）和背侧边缘区（dorsal rim area, DRA）12-15。

果蝇光感受器结构及突触连接；视叶小叶单元排列示意图
图1. 功能组织 果蝇 眼睛. (A果蝇复眼中，前两个视叶——小眼和外髓质——以灰色标示。小眼的R1-R6感光细胞以及外髓质的大单极细胞（LMCs：L1-L3）易于获取 体内 与传统的锐利微电极记录相比。示意图中的电极标示了在视网膜中从R1-R6记录的常规路径。在视网膜下层（lamina）中对LMC进行记录的一种方法是将电极向左平行移动。B视网膜小叶是由按视网膜拓扑结构排列的卡式单元组成的基质，每个单元包含处理来自视觉空间特定小区域信息的神经元。由于神经重叠现象，来自不同相邻小眼的六个感光细胞将其轴突（R1-R6）投射至同一个视网膜小叶卡式单元，向L1-L3神经元及一个无长突细胞（Am）形成组胺能输出突触。CR1-R6轴突末梢与视觉中间神经元（包括L4、L5、Lawf、C2、C3和T1）之间的神经信息传递在小叶小柱内极为复杂。DR1-R6 光感受器轴突接受来自L2和L4单极细胞的突触反馈。B）和（C）根据 Rivera-alba 等人进行的修改2. 请点击此处以查看此图的放大版本。

的 果蝇 眼为神经重叠型16这意味着，属于七个相邻小眼、观察空间中同一点的八个感光细胞的神经信号，会在接下来的两个神经纤维网层——即视网膜下神经组织（lamina）和髓质（medulla）——中的一个神经小叶内汇聚在一起。其中，六个外周感光细胞R1-R6将其轴突终末投射至视网膜下神经组织（lamina）的神经柱中。图1），R7和R8细胞绕过该层，并与其对应的髓质小柱形成突触连接17-19。这些精确的神经连接构成了果蝇早期视觉视网膜拓扑映射的神经基础，其中每个视叶（lamina）图1A-C) 和髓质柱（ cartridge ）代表空间中的单个点。

大单极细胞（LMC：L1、L2 和 L3）以及无长突细胞（Am）接收来自 R1-R6 光感受器的直接输入，这些细胞位于视网膜小叶中1,2,20。其中，L1 和 L2 是体积最大的细胞，介导主要的信息通路（图 1D），它们分别对亮边和暗边的移动产生反应，从而构成运动检测器的计算基础21,22。行为学实验表明，在中等对比度条件下，这两条通路促进相反方向的运动感知：L1 细胞介导从后向前的运动感知，而 L2 细胞介导从前向后的运动感知23,24。连接性研究进一步提示，L4 神经元可能在相邻小叶模块之间的侧向通信中发挥关键作用25,26。在相同模块及两个相邻模块中的 L2 与 L4 细胞之间均发现了 reciprocal 突触连接。在下游通路中，每个 L2 细胞及其三个相关的 L4 细胞将轴突投射到共同的靶细胞——髓状体中的 Tm2 神经元，在此处来自相邻模块的输入被认为被整合以处理从前向后的运动信息27。尽管 L1 神经元通过缝隙连接和化学突触接收来自同模块 L2 细胞的输入，但它们并不直接与 L4 细胞或相邻的视网膜小叶模块相连。

只有属于L2/L4环路而非L1通路的神经元向R1-R6感光细胞轴突提供突触反馈1,2（图1D）。同小室连接具有特异性，即L2仅连接至R1和R2，L4仅连接至R5；而所有R1-R6感光细胞均可接收来自相邻小室中一个或两个L4细胞的突触反馈。此外，Am神经元与R1、R2、R4和R5之间存在强烈的突触连接，胶质细胞也以突触方式参与该网络，因而可能参与神经图像处理6。最后，轴突间的缝隙连接在小室内连接相邻的R1-R6感光细胞，并连接R6与R7/R8感光细胞，从而参与各小室中信息的不对称表征与处理14,20,28。

在近乎完整的黑腹果蝇（Drosophila）中对单个光感受器和视觉中间神经元进行细胞内电压记录，可获得毫秒以下时间分辨率、高信噪比的数据3,5,7-10,29，这对于解析相连神经元之间快速的神经计算至关重要。目前的光学成像技术尚无法达到这一精度，因其噪声显著更高，且通常仅能在10–100毫秒的时间分辨率下工作。此外，由于电极尖端极细且尖锐，该方法不仅限于记录胞体，还可直接记录小型活性神经结构，例如LMC的树突网络或光感受器轴突——这些结构无法用体积更大的膜片钳电极尖端触及。重要的是，与大多数膜片钳技术相比，该方法在结构上侵入性更小、造成的损伤更轻，因而对被研究细胞的胞内环境和信息采样影响更小。因此，传统的尖锐微电极技术已持续为神经信息处理在合适时间尺度上的研究贡献基础性发现和原创性见解，推动了我们对视觉机制的理解3-10。

本文解释了如何 体内 细胞内记录 果蝇 R1-R6 光感受器和 LMC 的记录由 Juusola 实验室完成。本方案将介绍如何构建合适的电生理记录装置、制备果蝇样本以及进行记录操作。文中展示了部分代表性数据，并讨论了使用该方法时可能遇到的一些常见问题及潜在解决方案。

方案

以下方案符合谢菲尔德大学和北京师范大学的所有动物护理指南。

1. 试剂与仪器准备

  1. 记录与光刺激设备设置
    1. 选择至少 2.5 x 2.5 m 的记录区域，在具备空调、湿度可控并能提供暗记录条件的房间内进行电生理实验。确保该区域足够大，可舒适容纳以下设备：(i) 1 x 1 m 的防震台，台上放置实验装置（果蝇刺激与记录设备）、体视显微镜以及带有两个鹅颈管的冷光源，所有设备均置于一个大型 >180 cm高的法拉第笼；(ii) 一个38U机柜，用于放置个人计算机（配平板LCD显示器）、微电极放大器、LED驱动器、滤光片、温度控制单元、示波器及其他必要的电子仪器；以及(iii) 供研究人员使用的小型实验桌和椅子。
    2. 将设备放置在远离冰箱、离心机和电梯等电噪声和机械噪声源的位置。使用独立的浪涌保护器，以防止电网电压尖峰对设备的电子装置造成损害。理想情况下，将设备连接至独立的不间断电源（UPS电池），以最大限度减少噪声干扰。
    3. 使用黄铜和黑色塑料制作一个圆锥形果蝇饲养装置（图2）。使用黄铜部件，钻出一个外部边缘逐渐变细的小孔，孔径缩小至约0.8 mm（与典型果蝇胸部宽度相匹配）。
      注意：该孔需向持蝇器的尖端逐渐变细，以便容纳大于平均尺寸的 果蝇由下方气流向上喷射的物体，会在顶部边缘卡住，陷入至肩部深度。
    4. 设计并构建一种机械稳定性强且精确的果蝇刺激与记录装置图3）使用铝或黄铜（高导电性金属）制作果蝇准备平台支架，并在其周围构建带有内置滚珠轴承的万向节臂系统，以实现光刺激的平滑、精确的 x、y 方向定位与固定。
      注意：这种集成的复合设计可最大限度地减少机械振动，否则振动可能导致记录电极尖端从被研究细胞中脱落。该系统还可整合基于帕尔帖元件的闭环温度控制系统，使研究人员能够使用温度敏感的遗传构建体，例如 shibire。TS用于评估突触环路计算9,30将装置进行阳极氧化处理或涂成黑色，以尽量减少光刺激的散射。
      1. 将果蝇刺激与记录装置固定在防震台的面包板上，例如利用其公制螺纹孔并通过M6螺栓固定。使用黑色面包板或将面包板覆盖黑色织物，以减少实验过程中的光线散射。
      2. 将可垂直调节的果蝇固定平台杆安装在万向节臂系统的中心位置，并用锁紧螺钉固定。将果蝇（置于果蝇固定装置内，见步骤2）放置于平台杆上，使连接在万向节臂上的光源径向对准果蝇头部。确保果蝇复眼的中心 precisely 位于万向节臂x轴与y轴的交点（0, 0），以便能够准确地将光刺激定位到果蝇视野内的任意位置。
        注意：此功能对于将单个细胞的响应特性映射到特定的眼部位置是必要的； 例如在寻找电生理学证据以证实结构适应性（例如明区或锐区）时，这些区域应分别表现出敏感性或分辨率的增强31.
    5. 将体视显微镜安装在防震台上的果蝇刺激与记录装置后方，使其能够舒适地高倍观察果蝇的眼睛。
    6. 将冷光源安装在显微镜顶部，使光源的双头半刚性蛇形导光管向下指向果蝇标本固定装置。可自由移动的双光束照明有助于在将记录电极经由小孔插入果蝇眼部时，更清晰地观察电极尖端。
    7. 连接合适的 x、y、z 微型操作器装置（粗调） & 使用M6螺栓或磁性支架，将记录电极和前置放大器固定在防震台右侧的果蝇刺激与记录装置旁。
      注意：Juusola 实验室的不同装置配备了不同的操纵器；具体信息见材料与试剂表。这些装置均可提供高质量的细胞内记录。
    8. 在可垂直调节的果蝇实验平台支架上安装一个小型手动三轴显微操作器，用于固定参考电极。调整参考电极的方向，使其朝向果蝇样品。
    9. 使用钢板在防震台周围搭建一个独立的、遮光的法拉第笼，将果蝇刺激与记录装置包围其中，以防止外界电磁干扰。法拉第笼前方保持开放，便于实验时运送果蝇样本。在前方悬挂内置铜网或铝网（用于接地）的黑色布帘，以屏蔽噪声和光线。将法拉第笼内壁涂成黑色，以减少光散射，并用螺栓将笼体底脚固定于地面，防止振动。
    10. 使用BNC电缆将高阻抗细胞内微电极放大器的电压和电流输出端连接至两个独立的低通滤波器（贝塞尔型或类似类型）的输入端。同样，将滤波器的输出端连接至数据采集系统（DA/AD卡）的AD连接模块/板卡的相应通道。根据供应商手册，通过专用电缆将DA/AD卡连接至个人计算机。
    11. 在个人计算机上安装适用于所选数据采集系统的相应采集软件。确保数据采集驱动程序与个人计算机的操作系统兼容。
    12. 将果蝇刺激与记录装置、法拉第笼、铜网（位于窗帘内）、显微镜、显微操作器、冷光源以及装有所有仪器的38U设备机柜（包括细胞内放大器、滤波器、温度控制单元、计算机和液晶显示器等），通过设备接地线和M6压接环形接地端子，连接至单一的中央接地点。使用数字万用表检测，确保所有部件均处于同一接地电位。
      注意：为了获得最佳的低噪声记录条件，接地配置通常因实验装置的不同而有所差异。
      1. 如有需要，可将中心接地点进一步连接至建筑物接地端和/或微电极放大器的中心接地点。在实际电生理实验中测试整个系统功能后，应根据需要调整接地配置，以尽量减少记录中的噪声。
    13. 设置软件放大倍数（1 - 10倍）、信号滤波（通常使用截止频率为500 Hz的低通滤波器，适用于R1-R6和LMC数据），以及采样率（至少1 kHz）。确保参数设置符合奈奎斯特-香农采样定理。32例如，在采集截止频率为500 Hz的低通滤波数据时，应使用1 kHz或更高的采样频率，以尽量减少混叠效应。
      1. 由于R1-R6光感受器的特征性电压反应为40 - 65 mV，而LMC的反应为20 - 45 mV，因此应相应设置放大倍数和显示刻度，以实现高分辨率的数据采样与可视化。

用于流体动力学分析的喷嘴几何结构对比，附带标尺作为比例参考。
图 2. 锥形果蝇固定装置。 该固定装置由两部分组成：中心黄铜单元及其锥形黑色塑料外罩。黄铜单元内部的中心孔逐渐收窄至较小直径，仅能勉强让果蝇通过。请点击此处查看此图的放大版本。

静态平衡；防震装置；果蝇制备示意图；显微镜；受控环境。
图 3. 电生理实验装置概览。 该装置包括一个独立的避光法拉第笼、防震台、果蝇刺激与记录设备，以及内嵌铜网或铝网并用于接地的黑色布帘。仪器架与法拉第笼内所有设备均连接至同一中心接地端。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 制备微电极
    1. 使用拉针仪从有丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.6 mm）或石英玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.5、0.6 或 0.7 mm）管中拉制参考微电极。尽量形成短而平缓的锥形。
      注意：不同仪器的拉针仪程序设置各不相同；具体参数详见材料与试剂表。参考电极尖端的孔径大小并不关键，因为在插入果蝇样本前需将电极尖端折断。
    2. 使用拉针仪从细丝状硼硅酸盐玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.6 mm）或石英玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.5、0.6 或 0.7 mm）毛细管中拉制记录微电极。尽量形成长度为 10 - 15 mm 的细长、渐变锥形。
    3. 使用光学显微镜检查记录电极是否具有正确的锥形。将电极用可塑性粘合剂固定在玻璃载片上，采用40倍空气物镜观察其尖端。
      注意：理想的电极应平滑地逐渐变细，直至其几乎不可见的尖端，尖端周围可见连续的、平行的明暗相间的干涉条纹。某些拉制仪参数会产生高阻抗电极，其尖端呈“喇叭状”，无法成功穿刺细胞。因此，对电极进行视觉检查至关重要。
    4. 将电极用油灰（或类似的可塑性粘合剂）水平固定在一个较大的培养皿上，以便安全存放和运输至电生理实验装置。确保电极尖端始终暴露在空气中，避免意外接触任何物体。
    5. 实验前立即用适当的盐溶液回填记录电极和参考电极。使用连接有微小颗粒过滤器并带有精细塑料尖端（如微载枪头）的小型5 ml注射器。
      1. 进行光感受器实验时，用 3 M KCl 溶液将记录电极完全充满（电极粗端形成液滴），因为该溶液可最大程度减小液接电位对记录电压的影响。
      2. 为研究组胺能的LMC（小叶间神经元），其通过氯离子电导变化响应来自R1-R6感光细胞的突触输入，应使用含3 M醋酸钾和0.5 mM KCl的溶液填充记录电极，因该溶液对细胞内氯离子平衡电位的影响较小。参考电极则用果蝇任氏液填充，其成分为（单位：mM）：120 NaCl、5 KCl、10 TES（C6H15一氧化氮6S），1.5 CaCl2，4 MgCl2，以及30蔗糖5.
    6. 测试新拉制的记录电极在记录系统中的电阻。
      1. 确保电极夹内的银丝均匀镀上氯化银（呈紫灰色，而非闪亮的银白色），以尽量减少记录伪迹（如液结电位漂移）。若未达到要求，应更换为正确氯化的银丝。
      2. 如有需要，对新的银电极进行氯化处理。将电极丝小心清洁（通过快速穿过火焰），使其呈现光亮的银白色。避免用手直接触碰，以确保表面形成均匀的氯化银层。将电极丝浸入原液浓度的家用漂白剂中 15–30 分钟，直至其呈现紫灰色。或者，采用电镀法处理每根电极丝（将其作为正极置于含 3 M KCl 的溶液中，并以 1 mA/cm² 的电流密度通电）2 表面面积）持续10 - 15秒，直至充分包被。
      3. 将回填的记录电极和参考电极连接至相应的电极夹。在可垂直调节的果蝇记录平台支架上放置一小滴任氏液。将电极尖端浸入任氏液中，测量记录电极尖端的电阻。
        注意：仅当测试从新批次玻璃管中拉制的电极的电阻特性，或通过迭代优化微电极拉制仪程序时，才需要执行此步骤。
      4. 在进行电阻测量之前，请阅读放大器制造商用户手册中关于适当测量设置的说明。对于性能良好的记录电极，其尖端电阻应为 ~100 - 220 MΩ。

2. 黑腹果蝇 准备

  1. 收集羽化后5至10天的果蝇，放入含有标准培养基的干净果蝇管中。较年轻的果蝇甚至“新生”果蝇也可获得良好的记录效果；但由于其眼睛较软，为记录电极切割角膜开口时难度更大。
  2. 制作果蝇捕捉管和果蝇制备台（图4）。有关这些自制工具的组装方式，请参见图4。
    1. 制作果蝇捕捉管时，将50 ml塑料离心管的锥形底部尖端切掉，然后将1 ml移液器吸头的大端插入并粘合到该新开口上。
    2. 最后，将移液器吸头的小端切割至适当大小，使果蝇能够轻松通过。请机械加工车间协助组装一个小型果蝇制备平台，该平台应能实现果蝇固定装置的双轴旋转，并可将固定装置锁定在不同位置。

显微镜下的果蝇解剖装置；果蝇制备台、石蜡加热器、刀片切割器可见。
图4. 制作果蝇标本所需的工具与装置。 果蝇捕捉管由将1 ml塑料移液器吸头粘接到50 ml塑料离心管上制成。定制的果蝇制备台可使果蝇固定器自由旋转，并锁定在便于操作果蝇的特定位置。果蝇通过电加热石蜡装置使用蜂蜡进行固定。凡士林则通过连接在手柄上的粗毛制成的小型涂抹器进行涂抹。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用一个1 ml的移液枪头收集实验所需的果蝇，枪头口径应刚好允许果蝇通过。将装有移液枪头的捕蝇管连接到果蝇培养管上。利用果蝇天生向上攀爬（抗重力性）的习性，使其爬入枪头内。建议优先选择体型最大的雌蝇，因为在电生理实验中体型至关重要。
    注意：果蝇体型越大，其细胞也越大，获得高质量细胞内记录的可能性越高。较小的果蝇（包括雌性和雄性）也可提供优良的记录，但制备难度更高。一旦果蝇进入较大的移液枪头，务必立即封闭果蝇管，防止其他果蝇逃逸。
  2. 将一个100 ml的注射器通过一段柔性塑料软管连接到移液枪头的较大开口端——此时果蝇仍在枪头内。
  3. 将移液枪头的细端（其口径略扩大，刚好允许一只Drosophila通过）对准果蝇固定器底部的孔洞，并从注射器中轻轻挤出少量空气，将果蝇吹入果蝇固定器中。
    1. 通过体视显微镜观察，缓慢注入更多空气，直至果蝇头部从固定器的锥形末端露出。确保果蝇从胸部至固定器顶部的小孔之间被牢固固定。
  4. 使用石蜡加热器将蜂蜡从果蝇的“肩部”处将其固定在果蝇固定器上。调节石蜡加热器的温度，使其尽可能低，仅需足以干净地熔化蜂蜡即可。
    注意：当温度适当时，蜂蜡呈现透明状；温度过高会导致蜂蜡“烧焦”；温度过低则蜂蜡仍保持僵硬。固定果蝇时操作应准确且迅速，长时间的热暴露可能损伤果蝇。此处不建议使用光固化牙科胶，因其固化过程过慢。

果蝇眼部检查，显微镜图像，突出显示用于生物学研究的左眼标记过程。
图 5. 为 活体实验准备果蝇。左图，将一只Drosophila的头部正直地置于果蝇固定装置中，并用加热融化的蜂蜡将其喙、右眼和肩部固定在装置上。右图，使用锋利的刀片在眼睛最厚的部分（位于赤道稍上方，距后部角质层仅数个小眼处）切开一个小口。轻轻移除一小片角膜，并用凡士林密封切口，以防止眼睛干燥。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 固定果蝇头部。将蜂蜡涂抹在喙（图5）和右眼眼角处，注意避开角膜，并通过这些点将头部固定在果蝇固定装置上。
  2. 制备微型刀具。使用两个带有平面握柄的刀片夹持器/断裂器夹紧一片非不锈钢剃须刀片，从其锋利边缘敲裂出一小条。出于健康与安全考虑，请佩戴护目镜以保护眼睛（尽管刀片断裂时碎片反弹的可能性极低）。理想情况下，应制得一个形似尖塔的锋利刀刃。确保该“尖塔”牢固地附着在刀片夹持器上，但操作时需小心，避免造成自身伤害！
  3. 使用微型刀具，在果蝇左眼处切开一个仅包含数个小眼的小孔——位置约在眼赤道线上方、背侧角膜下方4至5个小眼处，以便为记录微电极提供通路。操作应在体视显微镜下进行，并使用高倍率观察制备过程。
    注意：由于果蝇眼睛具有弹性且对探针有阻力，使用“尖塔”形刀具切割效果最佳。该切割技术难度较高，请仔细观看视频演示。将果蝇固定装置保持在特定方向（在果蝇制备架上）可使解剖操作更为容易。初学者可能觉得显微手术较难掌握，但随着练习，神经适应性将逐步提升研究者的三维感知能力和操作灵巧性。
  4. 小心移除刚刚切开的小片角膜，暴露其下的视网膜。迅速用石油 jelly 涂抹工具上的细毛蘸取少量石油 jelly，覆盖住眼部的小孔。
    注意：石油 jelly 在此具有多种作用。它可防止组织脱水以及血淋巴凝结，后者可能导致插入的记录电极断裂。同时，石油 jelly 会附着在微电极表面，降低其管壁电容，从而改善记录系统的频率响应，提高所记录神经信号的时间分辨率。注意避免将石油 jelly 涂抹至眼睛其他区域，以免影响光学清晰度。

3. 记录R1-R6感光细胞或LMC的信号

  1. 操作微电极放大器时务必保持接地（例如通过触碰法拉第笼或防震台的金属表面），以避免意外将静电传递至前置放大器，从而损坏电路。
  2. 使用两个鹅颈式导光管从上方照亮果蝇制备平台支柱（图6A）（冷光源置于法拉第笼内），以便在密切的视觉控制下将果蝇固定器放置在支柱上的理想位置。

用于果蝇神经活动测量的显微镜与电极电生理实验装置。
图6. 实验中果蝇固定装置与电极的定位。（A-B）果蝇固定装置置于记录平台之上，该平台通过帕尔贴元件（A：中央白色圆形平台）实现温度控制。万向臂可精确调节光刺激的位置，使光源（液体或石英光纤束末端）与果蝇保持等距，并直接对准其眼睛（通过x、y轴旋转调节）。在我们的许多实验装置中，光刺激由LED（配备线性电流驱动器）或单色仪产生，因此刺激具有特定的（带通滤波）光谱成分，波长范围为300–740 nm，并覆盖4–6个对数强度单位（通过独立的中性密度滤光片衰减调节）。（C）两个微电极由独立的显微操作器控制，定位在果蝇头部：参考电极（上方）穿过单眼；记录电极（左侧）穿过左眼的小孔。（D）为获得尽可能多的感光细胞记录，记录微电极沿吻部-单眼轴线平行插入孔中。当电极尖端穿入并密封至某一感光细胞时，可自由旋转的光源即固定于该位置，此时细胞对该特定光刺激产生最大电压反应。该空间位置即为该细胞感受野的中心。若小孔靠近外骨骼，采用相同电极角度还可进一步记录到L2中间神经元（LMC）信号（左）；若小孔距离外骨骼较远，则另一种有效的电极入射角度也可用于获取LMC记录（右）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将果蝇固定器（内含果蝇！）安装到果蝇制备平台的支架上。旋转果蝇固定器，使果蝇的左眼正对研究人员图6B).
  2. 使用小型粗调显微操作器，在体视显微镜下观察，将钝性参考电极轻柔地穿过果蝇的单眼插入头囊中 图6C不要将电极插入过深，以免损伤果蝇脑组织。
    1. 或者，将参考电极插入果蝇胸部后部。务必始终确保果蝇表现健康（触角有活动），且其复眼完整，未被意外损伤；若制备样本不够理想，应重新准备新的果蝇用于实验。
  3. 通过先前准备好的、覆盖石蜡油的小开口，将锋利的记录微电极插入左眼。在体视显微镜下使用高倍放大，调整导光管和焦平面，使电极尖端通过其反射模式在三维空间中清晰可见。
    注意： 图6D 展示了在记录光感受器和LMC信号时，果蝇头部相对于记录微电极进入眼睛角度的略微不同位置。将电极插入眼睛而不使其断裂是实验中最困难的阶段。如果电极尖端未能对准眼睛上的微小开口而撞击到角膜，通常会导致电极断裂。
  4. 在微电极和参考电极均牢固插入标本并与其体液形成电接触后，开启微电极放大器。
  5. 关闭冷光源（位于法拉第笼内）并拔掉电源。将其插头连接至中央接地端，以最大限度减少接地环路引起的电噪声，并将鹅颈式导光管移开，以便卡丹臂系统可在果蝇周围自由移动。关闭室内灯光，确保果蝇标本处于相对黑暗的环境中。
  6. 测量记录电极在眼内的电阻（按照放大器用户手册中的说明进行）。仅使用电阻为100 - 250 MΩ的记录电极。
    注意：几乎不可能通过 <70 MΩ 电极。如果阻值为 <80 MΩ，电极尖端可能已损坏。此时应关闭放大器并更换记录电极。
    1. 电极更换并插入眼内后，打开放大器以测量其电阻。有时电极尖端进入组织时可能被碎屑堵塞，可通过放大器的电容性蜂鸣和电流脉冲功能予以解决，这些功能通常可通过快速共振或排斥作用清除堵塞物。
  7. 将放大器设置为电流钳（CC）或桥式记录模式。由于记录电极与参考电极目前均处于电学连通的细胞外空间，需将信号偏移（记录电压）调零，以消除两者之间的任意电压差。通过放大器的显示读数或示波器屏幕监测信号偏移的变化。
  8. 等待2-3分钟使果蝇眼睛暗适应。
  9. 使用遥控显微操作器的X轴压电步进装置，或通过轻轻旋转手动操作器的精细调节旋钮，以0.1至1微米的微小步长，逐步将记录电极尖端向眼球内部推进。
  10. 用短暂的光刺激（1 - 10 毫秒）闪光刺激果蝇复眼，同时将记录电极逐步推进至组织中。
    注意：如果记录电极位于视网膜内且眼球功能正常，每次闪光将引起电压短暂而微小的下降（0.2 - 5 mV 去极化），称为视网膜电图（ERG）。这种细胞外空间场电位的变化是由视网膜细胞对光的集体反应所引起的。然而，一旦电极尖端进入视叶（lamina）并靠近LMCs，ERG信号将发生反转，呈现去极化反应。
  11. 使用Cardan臂系统移动光源，围绕果蝇复眼调整位置，找到能够诱发出最大ERG反应的光照位置。
    注：此位置表示位于记录电极尖端附近、负责采样光输入的感光细胞（或大细胞）在视觉空间中的微小区域。
  12. 用记录电极穿刺细胞。
    注意：穿刺可自发发生，或在电极微步向前推进时发生。轻敲显微操作仪系统或使用放大器的“buzz”功能可进一步促进穿刺；这些操作会使电极尖端在组织中产生共振。当电极刺入感光细胞膜并进入其胞内空间时，记录电极与参考电极之间的电压差会突然从 0 mV 下降至约 -65 mV（介于 -55 至 -75 mV 之间）；而在穿刺大细胞（LMC）时，该电压下降通常较小（介于 -30 至 -50 mV 之间）。这些电压差代表相应细胞的负静息电位。根据记录电极的质量（尖锐程度）及其穿刺的细胞结构不同，记录电极的电压读数可能迅速或逐渐稳定至静息电位，此过程伴随细胞膜与电极外壁之间形成密封。但如果穿刺仅部分完成或质量不佳，电极通常会滑出细胞，记录到的电位将回升至接近零。
  13. 当电极密封良好并显示出稳定的膜电位（深静息电位）时，定位被穿刺细胞感受野的中心。利用万向臂系统移动闪光刺激的位置，在果蝇复眼中扫描，以确定在视觉空间中能够引发该细胞最大电压反应的光刺激点。当光刺激正对感受野中心时，锁定万向臂。
    注意：在黑暗中， 果蝇 光感受器对强光脉冲产生40 - 65 mV的去极化电压反应4,5而稳定的LMC记录显示20至45 mV的超极化反应9,10,14. 胶质细胞穿刺可能偶尔发生，表现为 <-80 mV 静息电位，以及更缓慢且更小的（约 5 mV）光诱导饱和去极化。感光细胞在 果蝇 具有不同眼色素的果蝇，例如白眼果蝇7 朱砂突变体对野生型表现出相似的反应幅度。
  14. 使用放大器的电流钳（CC）模式，向被研究细胞注入微小（0.1 nA）、短暂（100–200毫秒）的电流脉冲，以补偿记录电极的电容，从而在细胞膜充电过程中最大限度地减少记录伪迹。
    注意：此重要步骤在放大器的用户手册中有详细说明，应在实际实验前先使用电生理细胞模型进行练习。
  15. 记录对具有不同统计或物理特性的光脉冲及其他感兴趣刺激（如自然光照强度时间序列或随机对比度模式）的电压反应。例如，检测记录到的反应如何随明适应或暗适应而变化。
    注意：通过在光路中添加预选强度的中性密度滤光片，可对所研究的细胞进行准确的光适应4,5或者，为了进行长时间的暗适应，可关闭光刺激一段预设的时间。由于记录系统的机械稳定性、记录电极的高质量以及制备样本的完整性，稳定的记录条件有时可持续数小时。因此，在状态良好的情况下，有可能从单个细胞在不同适应条件下收集大量数据。当电极从细胞中滑脱时，记录到的反应会减弱，平均电压开始趋近于零。
  16. 使用显微操作器的精细 x 轴控制，小心推进记录电极，直至电极接触并穿入下一个细胞（通常为最近的神经邻近细胞）。切勿沿 y 轴或 z 轴移动电极，因为此类操作会导致电极横向“犁划”组织，损伤眼部结构！
    注意：使用良好的电极和健康的样本，可在同一只果蝇中持续数小时（偶尔可长达整个工作日）记录到多个感光细胞的高质量反应（但极少能记录到多个大细胞的反应）>8 小时）而无明显信号衰减。
  17. 定期保存带有标识信息的数据文件，例如日期、基因型和记录的细胞类型。由于一次成功的记录实验可能产生大量数据，因此应在实验记录本中做好详细的书面记录，以供后续数据分析使用。

结果

此处针对果蝇（Drosophila）眼部改良的尖锐微电极记录方法，可用于可靠地量化视网膜和外髓质细胞中的神经信息采样与处理过程，以及它们之间的通信4,5,7,8,10,33。该方法已被用于研究不同野生型品系、突变体或基因工程果蝇品系中的视觉信号编码，充分证明了其应用价值；不仅可用于量化突变、温度、饮食或特定基因表达所带来的影响3,4,6,9,10,14,30,34，还可揭示视觉行为改变背后的机制性原因14,34。此外，该方法也易于应用于其他昆虫的神经生理实验35,36，从而推动神经行为学领域的视觉研究。接下来，我们将展示该方法成功应用的若干实例。

感光细胞电压反应示意图；细胞内记录装置；温度对电位的影响。
图 7. 果蝇 R1-R6 感光细胞在 20 和 25 oC 下对光脉冲的电压反应。 由于尖锐微电极穿刺通常非常稳定，因此可以通过加热或冷却果蝇，记录同一 R1-R6 感光细胞在不同环境温度下对特定光刺激的电压反应。在我们的实验装置中，果蝇固定装置置于基于闭环帕尔帖元件的温控系统上，使我们能够在数秒内改变果蝇头部的温度。较高温度会加快电压反应，并特征性地降低 R1-R6 感光细胞的静息电位（如红色箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

研究温度对光感受器输出的影响

通过设计精良且隔振良好的记录系统，该方法可用于通过加热或冷却果蝇来测量温度对单个细胞神经输出的影响。给出的示例显示了同一R1-R6光感受器在20和25℃下对持续10毫秒的强光脉冲的电压反应 oC (图7）。如先前所定量4,9，升温会降低感光细胞在暗处的静息电位，并加快其电压反应。

果蝇感光细胞电压记录，光刺激下的信号适应与噪声比图示。
图 8. 果蝇 R1-R6 感光细胞的信号传递性能随光照强度增强而提高。（A）同一微电极在相同细胞、20 oC 条件下记录的对弱光（下方）和强光（上方；亮度高 10,000 倍）重复自然光强度时间序列的感光细胞输出。强光刺激的响应幅度更大，因其整合了更多单光子引发的微小反应（即“光子 bumps”）4,5,7,8。（B）叠加显示 20 个连续的、每段持续一秒的电压响应。单个响应（浅灰色）取自适应趋势（图 A 中箭头所示）消退之后（图 A 中虚线框区域）。对应的响应均值（即信号）以较深线条表示。信号与单个响应之间的差异即为噪声。（C）采用标准方法4,5,7,8通过信噪比（SNR）量化细胞的信号传递性能。在强光刺激下，感光细胞可靠信号传递的频率范围比弱光条件下宽约 64 Hz（强光：SNR'Bright ≥1，最高达 84 Hz；弱光：SNR'Dim ≥1，最高达 20 Hz），且信噪比显著提升，从 SNRDimMAX = 87 提高至 SNRBrightMAX = 1,868。请点击此处查看该图的放大版本。

通过重复刺激研究适应性与神经编码

该方法具有非侵入性，对视网膜和髓板结构造成的损伤相对较小，因此非常适合在接近自然生理状态下体内（in vivo）研究单个细胞对不同光刺激的信号响应性能。图8展示了在20 oC条件下，一个R1-R6光感受器对弱光和强光重复自然光强度时间序列刺激的电压响应，而图9则展示了另一个R1-R6光感受器和一个LMC在25 oC条件下对另一种自然光刺激的响应。由于在同一果蝇体内同时进行视网膜和髓板区域的细胞内记录——即使用两根尖锐微电极分别在视网膜和髓板中记录——技术难度过高而难以实现，因此突触前和突触后记录分别来自两只不同的果蝇30。

细胞内电压响应分析示意图；光刺激；果蝇中的信噪比。
图9. 果蝇R1-R6光感受器和LMC在25 oC下对重复自然刺激的电压响应。（A）通过不同果蝇上的不同微电极记录的R1-R6（灰色）和LMC（黑色）输出。（B）完全光适应条件下，对同一自然刺激模式连续记录20次，突触前（上方）和突触后（下方）的个体响应（浅灰色）及相应的平均响应（信号，深色轨迹）。信号与个体响应之间的差异即为噪声。（C）通过记录的信噪比（SNR）量化细胞的信号传递性能。LMC输出的可靠信号传递范围比R1-R6输出宽约10 Hz（SNR'LMC ≥1，最高达104 Hz；SNR'R ≥1，最高达94 Hz）。两者的信噪比均较高（SNRLMCMAX = 142，SNRRMAX = 752），且由于记录噪声较低，二者之间的差异反映了细胞间真实的编码差异。请点击此处查看该图的放大版本。

刺激开始后，记录结果通常显示快速适应的趋势，这种趋势在5-6秒内基本消失。此后，细胞对每次持续1秒的刺激呈现产生高度一致的反应（每个虚线框内包含20次此类反应）。当这些反应叠加时，其可重复性变得明显图8B 和 图9B）。单个反应以细灰线表示，其均值以较粗的深色线表示。平均反应被视为 神经信号，而 神经噪声 平均值与每个个体反应之间的差异4,5,9,37,38. 频域中的相应信噪比（图8C 和 图9C通过将信号和噪声数据片段进行傅里叶变换得到功率谱，并将平均信号功率谱除以相应的平均噪声功率谱，获得结果。4,5,9,37,38通常情况下，记录到的神经输出对自然刺激的信噪比最高可达较高水平（100 - 1,000），在噪声极低且最稳定的记录条件下，该比值可达到以下数值 >>1,000 (例如., 图8C）。还应注意，升温会扩大细胞可靠信号传导的带宽4 (SNR'明亮≥ 1）；例如，两个 R1-R6 之间的相对差异 图8 和 9分别为10 Hz（20时84） oC 和 25℃ 时的 94 Hz oC）。

人们还可以利用香农方程，根据每个细胞的信噪比进一步估算其信息传递速率。32，或通过三重外推法计算响应熵与噪声熵率之间的差值39有关信息理论分析的更多细节，以及该方法在使用和局限性方面的具体说明，已在先前的出版物中给出。7,8,39.

细胞内电压反应记录；叠加反应与信号性能图。
图 10. 杀手蝇 R1-R6 光感受器和 LMC 在 19 oC 下对重复自然刺激的电压反应。（A）通过同一微电极从同一只果蝇记录的 R1-R6（灰色）和 LMC（黑色）输出；随着电极在眼内推进，先记录突触后，后记录突触前。（B）在初始适应后（A 中虚线框），捕获了对同一自然刺激模式的 20 次连续突触前（上方）和突触后（下方）反应（浅灰色迹线）。它们的均值为信号（上方较深迹线），而各自与单个反应的差异即为噪声。（C）信噪比（SNR）的计算方法如 图 8C 和 9C 所示。LMC 输出的可靠信号传递范围比 R1-R6 输出宽约 100 Hz（SNR'LMCMAX ≥1，最高达 234 Hz；而 SNR'RMAX  ≥1，最高达 134 Hz）。两者的信噪比均较高（SNRLMCMAX = 137，SNRRMAX = 627），并且由于记录中使用了同一微电极，其差异反映了突触前与突触后神经输出的真实差别。这些结果表明，记录系统的噪声较低，对分析的影响可忽略不计。请点击此处查看该图的放大版本。

神经行为学视觉研究

该方法还可用于记录不同昆虫物种复眼中突触前和突触后的电压反应7,8,35,36 (图10），从而允许对视觉信息处理进行比较神经行为学研究。对于所介绍的记录系统，唯一需要的调整是为所研究的物种配备新的样品固定装置，每个装置需具有适当尺寸的开口。这些示例记录来自一只雌性食蚜蝇（Coenosia attenuata）。它们展示了R1-R6光感受器和LMC在相同重复光刺激下的细胞内电压反应，该刺激方式用于 果蝇 对应物在 图9，但在19 oC. 本实验中，突触前和突触后数据均记录自同一只果蝇；使用同一根记录电极（内充3 M KCl），先后依次记录，电极先通过侧部 lamina，再进入前部视网膜。与之相比， 果蝇 25 时的数据 oC，该 Coenosia 数据——即使在较低温度下——也显示出动力学更快的响应；扩展了可靠信号传递的范围（信噪比） >>1）在更宽的频率范围内。这种神经编码对自然刺激的功能性适应与 Coenosia其捕食性生活方式36，这需要高精度的时空信息以实现快速的空中捕食行为。

讨论

我们介绍了如何使用锋利的传统微电极在完整的果蝇复眼中记录R1-R6感光细胞和LMC细胞的细胞内反应的基本关键步骤。在过去18年中，该方法已与定制的硬件和软件工具共同优化，以获得高质量且持久的记录，用于回答广泛的实验问题。通过投入时间和资源构建稳定而精确的实验装置，并制备出具有理想电学特性的微电极，高质量的记录便可成为任何从事黑腹果蝇（Drosophila）视觉神经生理学研究的实验室中的常规操作。尽管设计良好的记录系统和光刺激系统对于快速执行不同实验范式至关重要，但有三个操作步骤对成功记录尤为关键：（i）制备果蝇样本时尽量减少对复眼的损伤；（ii）拉制出具备合适电学特性的微电极；（iii）将记录电极插入复眼时避免损伤其尖端。最终，为了获得有意义的数据，研究人员必须理解电生理学的物理基础，以及如何为特定靶细胞类型制备合适的微电极。

因此，该技术的局限性主要取决于研究者的耐心、经验和技术水平。由于掌握该技术需要较长时间，尤其对于微小样本而言 果蝇 细胞，电生理学初学者最好先以较大的昆虫复眼（例如丽蝇）进行练习36 或蝗虫35使用相同的设备，一旦能够常规地对较大的光感受器和中间神经元进行高质量的细胞内记录，便可继续进行下一步 果蝇 眼睛。该技术的另一项局限在于细胞鉴定。穿透的 果蝇 细胞可通过电泳方式加载染料，包括 Lucifer yellow 或 neurobiotin。然而，由于微电极尖端尺寸较小，电泳效率较电阻较低的电极（如膜片钳电极）更低。此外，填充染料的微电极通常电学性能较差，使其在记录高质量电生理信号时更为困难 果蝇 光感受器和大运动前神经元（LMCs）。

有时会出现技术问题，表现为输入信号不稳定或完全缺失。这通常与电压信号持续漂移或超出放大器的记录范围（过高或过低）有关。大多数情况下，这种现象是由于记录电极被堵塞所致，或者电极尖端过细——电阻过高或管壁电容过大——无法有效传导快速的信号变化。尽管可以尝试通过“蜂鸣”电极电容的方式来疏通尖端，有时确实有效，但通常最有效的解决方法是直接更换记录电极。这可能还需要进一步调整微电极拉制仪的参数，以降低新电极的尖端电阻。在某些实验准备过程中，若使用石蜡油封闭角膜孔洞耗时过长，电极尖端也可能被堵塞。长时间暴露于空气中会使新暴露的视网膜组织干燥，其表层会变成类似胶状的物质。若发生这种情况，当将电极从眼球中抽出时，研究者通常会看到一团红色的组织黏附在记录电极上。此时唯一的解决办法是重新制备样本。石蜡油在电生理记录中具有多种优势：（i）可防止血淋巴凝固，避免其损坏电极尖端；（ii）可包覆电极尖端，降低其管壁电容，从而减小电极的时间常数，进而可能提高所记录神经信号的时间分辨率40,41；（iii）保持电极尖端清洁，便于穿刺；穿刺后，（iv）甚至有助于将电极尖端与细胞膜密封42。

当电极架的氯化银导线断裂或去氯化时，信号可能进一步变得不稳定或完全丢失；此时只需更换或重新氯化旧导线即可。信号缺失也可能是因为一个（或两个）电极架未牢固连接到插孔中。然而，设备本身发生故障的情况极为罕见。如果无法检测到信号，且已排除所有其他可能性，则应检查记录装置的各个部件（包括前置放大器、放大器、低通滤波器和模数/数模转换器）是否正确连接并正常工作。实现这一目的的一种方法是，用一台已知正常工作的设备中的相应仪器逐一替换现有仪器。或者，可使用信号发生器逐个检测各电子元件的性能。

但电生理学家面临的最常见技术问题或许是记录噪声。广义上，记录噪声是指除神经元对特定刺激的直接反应之外所观察到的电活动。由于果蝇制备样本在操作正确时非常稳定，因此所观察到的噪声（超出反应本身自然变异性之外的部分）通常来源于记录设备中的接地回路，或来自附近电子设备的干扰。此类噪声通常为50/60 Hz的电源嗡鸣及其谐波，但有时也包含更复杂的波形。为了确定噪声的来源，可将果蝇制备样本的固定装置从实验装置中移除，通过一滴果蝇任氏液将记录电极与参考电极连接（或将电极置于少量任氏液浴中；见步骤1.2.6），并在电压钳或桥式模式下记录信号。若在记录信号中观察到噪声，则表明该噪声很可能来自果蝇制备样本之外的外部来源。

另一种识别噪声来源的有效方法是将电极架替换为连接到放大器的电子细胞模型。在一个理想配置且良好接地的系统中，记录到的信号现在应几乎无噪声，仅显示来自模数转换器的随机比特噪声（在最佳情况下甚至比特噪声也不存在）。如果仍然存在噪声，则需重新检查所有设备是否正确接地。检测接地回路的一个简便方法是：（i）断开所有设备部件的接地线；（ii）使用欧姆表确认断开后每个部件确实与地隔离；（iii）将各个部件逐一直接连接至中央接地点，而不是通过设备的其他部分间接连接。同时尝试改变设备的配置。例如，有时将计算机和显示器移离设备更远可降低噪声；但在其他情况下，将计算机放入设备机架内部反而能减少噪声。还值得尝试拔掉附近的设备，观察噪声是否减少，或对额外组件进行屏蔽。此外，尝试拔下或更换记录设备中的不同组件，尤其是BNC电缆（其接地连接可能存在问题）。当使用细胞模型时，若仅观察到比特噪声，则初始噪声源可能来自电极或果蝇制备本身。例如，参考电极可能意外接触到了头囊内的运动神经或活性肌肉纤维（或在胸部放置时干扰了飞行肌）。通常最简单的做法是重新制备一只用于记录的果蝇，并注意尽量减少对果蝇的损伤。但如果噪声持续存在且为宽带噪声，则很可能是电极不适合实验需求——过于尖锐或过细（因而噪声过大），或根本不适用于当前目的；我们甚至观察到石英电极充当了天线，拾取到微弱的广播信号！尽管为了从特定细胞类型获得稳定高质量记录，需要反复调整拉制仪的参数以制备出理想的微电极，这一过程可能非常耗时，但这是值得的。一旦记录电极被优化适配于实验，便可实现持久且极高质量的记录。

尖端微电极记录技术也可用于研究多种样本中的神经信息处理过程，包括昆虫眼睛和大脑中不同的信息处理层43,44。由于微电极尖端可以制作得非常精细，因此通常对被研究细胞的损伤小于大多数膜片钳技术的应用。重要的是，现代采样-保持微电极放大器能够良好地控制电极尖端的电学特性40,45-47。因此，当正确应用时，该技术可在亚毫秒分辨率下，从体内3,5,7-10,44或体外48样本中获得高信噪比的可靠数据。这种精度是当前光学成像技术无法实现的，因为后者噪声更大、速度更慢。此外，该方法可用于在电流钳和电压钳配置下表征小细胞的电膜特性5,29,33,36,40-42,49，为连接实验与理论的生物物理和经验建模方法提供有价值的数据7,8,11,33,49-54。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者感谢Mick Swann、Chris Askham和Martin Gautrey在设计和制造实验装置的许多电气与机械部件过程中所做出的重要贡献。MJ目前的研究工作得到了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC资助号：BB/M009564/1）、中国认知神经科学与学习国家重点实验室开放研究基金、中国高端外国专家资助项目、芬兰Jane和Aatos Erkko基金会资助以及Leverhulme信托基金（RPG-2012-567）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于制作果蝇标本的体视变焦显微镜奥林巴斯SZX12 DFPLFL1.6x PF 目镜：WHN30x-H/22可实现约150倍放大，工作距离长；定制重型钢制台式支架
体视显微镜在细胞内实验装置中的应用·  Olympus奥林巴斯 SZX7；目镜：WHN30x-H/22需要30倍目镜，以便在将电极穿过角膜小孔进入眼内时，能清晰观察到电极尖端的反射光
尼康显微镜尼康 SMZ645；目镜：C-W30x/7
防振台Melles Griot面包板上带有公制M6孔我们定制的实验装置在厚重的面包板上钻有一个大孔，可使来自下方的果蝇准备平台支柱（内含带电子元件的铜制散热片）穿过
纽波特
显微操作仪NarishigeNarishige NMN-21在我们的细胞内记录装置中，使用了不同的显微操作器系统来驱动尖端记录电极进入果蝇复眼。所列出的所有操作器均能成功地从黑腹果蝇的光感受器细胞和大细胞（LMCs）获得持久且稳定的记录。 
Huxley BertramHuxley xyz轴精细手动控制
SensapexSensapex 三轴系统
Märzhä用户Märzhä配备额外X轴压电步进器和MS 314控制器的用户DC-3K
磁力架任何带开关的磁力底座均可使用例如，在法拉第笼内管理线缆
电极夹持器哈佛仪器ESP/W-F10N
银丝World Precision Instruments AGW15100.3 - 0.5 mm 直径；电极夹需进行氯化处理
光纤光源多种不同品牌，包括 Olympus
光纤束超精细技术为向万向节臂系统传递LED光刺激，我们使用液体和石英光导纤维（波长范围从紫外到红外）。
索恩实验室
果蝇捕捉管P80-50P 50 ml 离心管，聚丙烯材质，100 个/包从50 ml塑料离心管上切下锥形底部，并在其上粘接一个1 ml移液器吸头。
数字采集系统国家仪器公司
单电极电流/电压钳制微电极放大器npi SEC-10LXhttp://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html表现卓越！
前置放大器标准（±150 nA）对于 npi SEC-10LX
LED 光源与驱动器2通道OptoLED（Cairn Research Ltd.，英国）我们的许多刺激系统均为自主研发 
自行设计与构建
数据采集与分析软件可供选择的公司众多Biosyst；Juusola 实验室用于实验与理论研究的定制Matlab系统
个人电脑或 Mac确保计算机（PC 或 Mac）与数据采集系统及软件兼容
万向节系统 自行设计与构建提供光刺激的精确定位（x,y,z）
帕尔帖温度控制系统 自行设计与构建
法拉第笼自建电磁噪声屏蔽
细丝状硼硅酸盐玻璃毛细管外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
细丝化石英玻璃毛细管外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
拉针仪Sutter Instrument CompanyModel P-2000 激光 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪对于硼硅酸盐参比电极，使用预设程序#11（膜片电极）：加热值 = 350；灯丝 = 4；拉速 = 36；延迟 = 200）。对于硼硅酸盐记录电极，使用预设程序#12（该程序通常可拉制出性能良好的传统尖端电极）  用于感光细胞记录：加热值 = 355；灯丝值 = 4；速度 = 50；延迟 = 225；拉力 = 150。对于需要更细电极尖端的LMC记录，这些参数需进行调整。拉制石英毛细管时，P-2000手动操作建议使用细尖微电极的程序。这些程序’ 预设参数可作为系统性优化的有用起点，以制备出穿透成功率高且记录噪声低的电极。
参比电极用细胞外林格溶液来自 Fisher Scientific 的化学品10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 蔗糖参见方案部分的配方
用于填充记录微电极的 3 M KCl 溶液Fisher Scientific 公司的盐类10010310，KCl
凡士林凡士林
非不锈钢剃须刀片
刀片架/刀片分割器Fine Science Tools 品牌，由 Dumont 生产10053-099 cm
蓝丁胶Bostik或者，使用模具粘土
镊子Dumont 品牌的精细科学工具11252-00#5SF（超细吸头）

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