记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

摘要

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。

摘要

昆虫感光细胞和视觉中间神经元的电压反应可通过传统的尖锐微电极进行精确记录。本文所述方法可使研究者从单个细胞中稳定记录持续时间较长（从数分钟至数小时）的高质量胞内反应 黑腹果蝇 R1-R6感光细胞和大单极细胞（LMCs）对光刺激的反应。由于记录系统噪声较低，该技术可用于研究果蝇复眼中单个细胞之间的变异，以及这些细胞的输出如何反映视觉环境的物理特性。本文概述了实施该技术的全部关键步骤。首先介绍了构建适合记录的电生理装置的基本步骤，包括实验设备的设计与选型。随后说明了如何制备合适的（尖锐的）记录电极和（钝头的）参考电极以进行记录前准备。详细描述了如何将一只完整的果蝇固定在定制的果蝇固定装置中，在其复眼上制作一个小窗口，并以最小损伤的方式将记录电极插入该窗口。本文还解释了如何定位细胞感受野的中心，对被研究细胞进行暗适应或光适应，并记录其对动态光刺激的电压反应。最后，阐述了稳定正常记录的判断标准，展示了单个细胞对不同光刺激所产生特征性的高质量电压反应，并简要定义了如何量化其信号传递性能。该方法的许多环节在技术上具有挑战性，需要反复练习和耐心才能掌握。但一旦研究人员熟练掌握并根据实验目标进行优化，该技术将提供卓越的 体内 神经生理学数据

引言

果蝇（Drosophila melanogaster）的复眼是研究感光细胞和中间神经元阵列在神经图像采样与处理以及动物视觉中功能组织的优秀模型系统。该系统拥有最完整的神经连接图谱^1,2，并易于进行遗传操作和精确的神经活动监测（具有高信噪比和时间分辨率）^3-10。

果蝇（Drosophila）的复眼具有模块化结构，包含约750个看似规则、由晶状体覆盖的结构单元，称为小眼（ommatidia），这些小眼共同为果蝇提供几乎覆盖头部周围所有方向的全景视觉视野。眼睛的主要信息采样单元是其杆状感光细胞^7,8,11。每个小眼包含八个感光细胞（R1-R8），它们共享同一个角膜小眼面，但朝向七个不同的方向。外层感光细胞R1-R6对蓝绿光最为敏感，而位于其上方、朝向相同方向的内层细胞R7和R8则表现出三种不同的光谱敏感亚型：浅色型（pale）、黄色型（yellow）和背侧边缘区（dorsal rim area, DRA）^12-15。

图1. 功能组织 果蝇 眼睛. (A果蝇复眼中，前两个视神经节——视网膜和外髓质——以灰色标示。视网膜R1-R6光感受器细胞以及外髓质的大单极细胞（LMCs：L1-L3）易于获取 体内 与传统的锐利微电极记录相比。示意图中的电极标示了在视网膜中从R1-R6记录的常规路径。在视网膜下层（lamina）中对LMC进行记录的一种方法是将电极向左平行移动。B视网膜是一层由视网膜拓扑排列的柱状单元组成的基质，每个柱状单元包含一组神经元，负责处理来自视觉空间中特定小区域的信息。由于神经叠加效应，来自相邻小眼的六个光感受器将其轴突（R1-R6）投射至同一个视网膜柱状单元，向L1-L3神经元及一个无长突细胞（Am）形成组胺能输出突触。CR1-R6轴突末梢与视觉中间神经元（包括L4、L5、Lawf、C2、C3和T1）之间的神经信息传递在小叶小柱内十分复杂。DR1-R6 光感受器轴突接收来自 L2 和 L4 单极细胞的突触反馈。B）和（C）根据 Rivera-alba 等人进行的修改². 请点击此处以查看此图的放大版本。

这 果蝇 眼为神经重合型¹⁶这意味着，属于七个相邻小眼、观察空间中同一点的八个感光细胞的神经信号，会在接下来的两个神经节（视叶和视网膜）中的一个神经小叶内汇聚。其中，六个外周感光细胞R1-R6将其轴突终末投射到视叶的神经柱中。图1），R7和R8细胞绕过该层，并与其对应的髓质小柱形成突触连接^17-19。这些精确的神经连接构成了果蝇早期视觉视网膜拓扑映射的神经基础，其中每个视杆（lamina）图1A-C) 和髓质柱（ cartridge ）代表空间中的单个点。

大单极细胞（LMC：L1、L2 和 L3）以及无长突细胞（Am）在视杆中接收来自 R1-R6 光感受器的直接输入^1,2,20。其中，L1 和 L2 是体积最大的细胞，介导主要的信息通路（图 1D），它们对明、暗移动边缘产生反应，从而构成运动检测器的计算基础^21,22。行为学实验表明，在中等对比度条件下，这两条通路促进相反方向的运动感知：L1 细胞介导后向前的运动感知，而 L2 细胞介导前向后的运动感知^23,24。连接性研究进一步提示，L4 神经元可能在相邻小叶单元之间的侧向通信中发挥关键作用^25,26。在相同及两个相邻小叶单元中的 L2 与 L4 细胞之间发现了 reciprocal 突触。在下游，每个 L2 细胞及其三个相关的 L4 细胞将轴突投射到共同的靶细胞——髓质中的 Tm2 神经元，在此处来自相邻小叶单元的输入被认为被整合以处理前向后的运动信息²⁷。尽管 L1 神经元通过缝隙连接和突触从同一个小叶单元的 L2 细胞接收输入，但它们并不直接与 L4 细胞或相邻的视杆小叶单元相连。

只有属于L2/L4环路而非L1通路的神经元向R1-R6感光细胞轴突提供突触反馈^1,2（图1D）。虽然同小室连接具有特异性，即L2仅连接R1和R2，L4仅连接R5，但所有R1-R6感光细胞均可接收来自相邻小室中一个或两个L4神经元的突触反馈。此外，Am神经元与R1、R2、R4和R5之间存在强烈的突触连接，胶质细胞也与该网络形成突触连接，因此可能参与神经图像处理⁶。最后，轴突间的缝隙连接在小叶中连接相邻的R1-R6感光细胞以及R6与R7/R8感光细胞，有助于每个小室中信息的不对称表征与处理^14,20,28。

在近乎完整的黑腹果蝇（Drosophila）中对单个光感受器和视觉中间神经元进行细胞内电压记录，可获得毫秒以下时间分辨率、高信噪比的数据^3,5,7-10,29，这对于解析相连神经元之间快速的神经计算过程至关重要。目前的光学成像技术尚无法达到这一精度，因其噪声显著更高，且通常仅能在10–100毫秒的时间分辨率下工作。此外，由于电极尖端极细且尖锐，该方法不仅限于记录胞体，还可直接记录小型活性神经结构，例如LMC的树突网络或光感受器轴突——这些结构无法被尺寸大得多的膜片钳电极尖端触及。重要的是，与大多数膜片钳技术相比，该方法在结构上侵入性更小、造成的损伤更轻，因而对被研究细胞的胞内环境和信息采样影响更小。因此，传统的尖锐微电极技术已持续为神经信息处理在合适时间尺度上的研究贡献了基础性发现和原创性见解，推动了我们对视觉机制的理解^3-10。

本文解释了如何 体内 细胞内记录 黑腹果蝇 R1-R6 光感受器和 LMC 的记录由 Juusola 实验室完成。本方案将介绍如何搭建合适的电生理记录装置、制备果蝇样本以及进行记录操作。文中展示了部分代表性数据，并讨论了使用该方法时可能遇到的一些常见问题及潜在解决方案。

方案

以下实验方案符合谢菲尔德大学和北京师范大学的所有动物护理指南。

1. 试剂与仪器准备

1. 记录与光刺激设备设置
   1. 选择至少 2.5 x 2.5 m 的记录区域，在具备空调、湿度可控并能提供暗记录条件的房间内进行电生理实验。确保该区域足够大，可舒适容纳以下设备：(i) 1 x 1 m 的防震台，台上放置实验装置（果蝇刺激与记录装置）、体视显微镜以及带有两个鹅颈管的冷光源，所有设备均置于一个大型 >180厘米高的法拉第笼；（ii）一个38U机柜，用于放置个人计算机（带平板LCD显示器）、微电极放大器、LED驱动器、滤光片、温度控制单元、示波器及其他必要的电子仪器；（iii）供研究人员使用的小型实验桌和椅子。
   2. 将设备放置在远离冰箱、离心机和电梯等电噪声和机械噪声源的位置。使用独立的浪涌保护器，以防止电网电压尖峰对设备中的电子装置造成损害。理想情况下，将设备连接至独立的不间断电源（UPS电池），以最大限度减少噪声干扰。
   3. 使用黄铜和黑色塑料制作一个圆锥形果蝇饲养装置图2）。使用黄铜部件，钻出一个外部边缘逐渐变细的小孔，孔的外径缩小至约0.8 mm（与典型果蝇胸部宽度相匹配）。
      注意：该孔需向持蝇器的尖端逐渐变细，以便容纳比平均尺寸更大的 果蝇由下方气流向上喷射的物体会在顶部边缘卡住，陷入至肩部深度。
   4. 设计并构建一种机械稳定性强且精确的果蝇刺激与记录装置图3）。使用铝或黄铜（高导电性金属）制作果蝇准备平台支架，并在其周围构建带有内置滚珠轴承的万向节臂系统，以实现光刺激的平滑、精确的 x、y 方向定位与固定。
      注意：这种集成的复合设计可最大限度地减少机械振动，否则振动可能导致记录电极尖端从被研究细胞中脱落。该系统还可整合基于帕尔帖元件的闭环温度控制系统，使研究人员能够使用对温度敏感的遗传构建体，例如 shibire。^TS用于评估突触环路计算^9,30将装置进行阳极氧化处理或涂成黑色，以尽量减少光刺激的散射。
      1. 将果蝇刺激与记录装置固定在防震台的面包板上，例如利用其公制螺纹孔并通过M6螺栓固定。使用黑色面包板或将面包板覆盖黑色织物，以减少实验过程中的光线散射。
      2. 将可垂直调节的果蝇固定平台杆安装在万向节臂系统的中心位置，并用锁紧螺钉固定。将果蝇（置于果蝇固定装置内，见步骤2）放置于平台杆上，使连接在万向节臂上的光源径向对准果蝇头部。确保果蝇复眼中心 precisely 位于万向节臂x轴与y轴的交点（0, 0），以便能够准确地将光刺激定位到果蝇视野内的任意位置。
         注意：此功能对于将单个细胞的反应特性映射到特定的眼部位置是必要的； 例如在寻找电生理学证据以证实结构适应性（例如明区或锐区，分别表现为敏感性或分辨率的提高）时³¹.
   5. 将体视显微镜安装在防震台上的果蝇刺激与记录装置后方，使其能够舒适地高倍观察果蝇的眼睛。
   6. 将冷光源安装在显微镜顶部，使光源的双头半刚性蛇形灯管朝下指向果蝇标本固定装置。可自由调节的双光束照明有助于在将记录电极经果蝇眼部小孔插入时更清晰地观察电极尖端。
   7. 连接合适的 x、y、z 微型操作器装置（粗调） & 使用M6螺栓或磁性支架，将记录电极和前置放大器固定在防震台右侧的果蝇刺激与记录装置旁。
      注意：Juusola 实验室的不同装置配备了不同的操纵器；具体信息见材料与试剂表。这些装置均可提供高质量的细胞内记录。
   8. 在可垂直调节的果蝇实验平台支架上安装一个小型手动三轴显微操作器，用于固定参考电极。调整参考电极的方向，使其朝向果蝇样本。
   9. 使用钢板在防震台周围搭建一个独立的、遮光的法拉第笼，将果蝇刺激与记录装置包围其中，以防止外界电磁干扰。法拉第笼前方保持开放，便于实验过程中运输果蝇标本。在前方悬挂内置铜网或铝网（用于接地）的黑色布质帘幕，以屏蔽噪声和光线。将法拉第笼内壁涂成黑色，以减少光散射，并用螺栓将笼体底脚固定于地面，防止振动。
   10. 使用BNC电缆将高阻抗细胞内微电极放大器的电压和电流输出端连接至两个独立的低通滤波器（贝塞尔型或类似类型）的输入端。同样，将滤波器的输出端连接至数据采集系统（DA/AD卡）的AD连接模块/板卡的相应通道。根据供应商手册，通过专用电缆将DA/AD卡连接至个人计算机。
   11. 在个人计算机上安装适用于所选数据采集系统的相应采集软件。确保数据采集驱动程序与个人计算机的操作系统兼容。
   12. 将果蝇刺激与记录装置、法拉第笼、铜网（位于窗帘内）、显微镜、显微操作器、冷光源以及装有所有仪器的38U设备机柜（包括细胞内放大器、滤波器、温度控制单元、计算机和液晶显示器等），通过设备接地线和M6压接环形接地端子，连接至单一的中央接地点。使用数字万用表检测，确保所有部件均处于同一接地电位。
       注意：为了获得尽可能最佳的低噪声记录条件，接地配置通常因不同实验装置而异。
       1. 如有需要，可将中心接地点进一步连接至建筑物接地端和/或微电极放大器的中心接地端。在实际电生理实验中测试整个系统功能后，应根据需要调整接地配置，以尽量减少记录中的噪声。
   13. 设置软件增益（1 - 10倍）、信号滤波（通常使用截止频率为500 Hz的低通滤波器，适用于R1-R6和LMC数据）以及采样率（至少1 kHz）。确保参数设置符合奈奎斯特-香农采样定理。³²例如，在采集截止频率为500 Hz的低通滤波数据时，应使用1 kHz或更高的采样频率，以尽量减少混叠效应。
       1. 由于R1-R6感光细胞的特征性电压反应为40 - 65 mV，而LMC细胞为20 - 45 mV，因此应相应设置放大倍数和显示刻度，以实现高分辨率的采样与数据可视化。

图 2. 锥形果蝇固定器。该固定器由两部分组成：中心黄铜单元及其外部的黑色锥形塑料外壳。黄铜单元中心的孔道呈锥形，末端直径较小，仅能允许果蝇勉强通过。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3. 电生理实验装置概览。 该装置包括一个独立的避光法拉第笼、防震台、果蝇刺激与记录设备，以及内嵌铜网或铝网并用于接地的黑色布帘。仪器架与法拉第笼内所有设备均连接至同一中心接地端。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 制备微电极
   1. 使用拉针仪从有丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.6 mm）或石英玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.5、0.6 或 0.7 mm）毛细管中拉制参考微电极。尽量形成短而平缓的锥形。
      注意：不同仪器的拉管仪程序设置各不相同；具体参数详见材料与试剂表。由于参比电极尖端在插入果蝇标本前会被折断，因此尖端孔径大小并不关键。
   2. 使用拉针仪从细丝状硼硅酸盐玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.6 mm）或石英玻璃（外径：1.0 mm；内径：0.5、0.6 或 0.7 mm）毛细管中拉制记录微电极。尽量形成长度为 10 - 15 mm 的细长、平缓渐细的锥形尖端。
   3. 使用光学显微镜检查记录电极是否具有正确的锥形。将电极用可塑性粘合剂固定在玻璃载片上，使用40倍空气物镜观察其尖端。
      注意：理想的电极应平滑地逐渐变细，直至其几乎不可见的尖端，尖端周围可见连续的、平行的明暗相间的干涉条纹。某些拉制仪参数会产生高阻抗电极，其尖端形似“喇叭”，无法成功穿刺细胞。因此，对电极进行视觉检查至关重要。
   4. 将电极用油灰（或类似的可塑性粘合剂）水平固定在一个较大的培养皿上，以便安全存放和运输至电生理实验装置。确保电极尖端始终暴露在空气中，避免意外接触任何物体。
   5. 实验前立即用适当的盐溶液回填记录电极和参考电极。使用连接有微小颗粒过滤器并带有精细塑料尖端（如微载枪头）的小型5 ml注射器。
      1. 进行光感受器实验时，用 3 M KCl 溶液将记录电极完全充满（电极粗端形成液滴），因为该溶液可最大程度减小液结电位对记录电压的影响。
      2. 为研究对来自R1-R6感光细胞的突触输入通过氯离子电导变化作出反应的组胺能LMC，使用含3 M醋酸钾和0.5 mM KCl的溶液填充记录电极，因为该溶液对细胞的氯离子电位影响较小。用果蝇任氏液填充参考电极，其成分（单位：mM）为：120 NaCl、5 KCl、10 TES（C₆H₁₅一氧化氮₆S），1.5 CaCl₂，4 MgCl₂，以及 30 蔗糖⁵.
   6. 测试新拉制的记录电极在记录系统中的电阻。
      1. 确保电极夹内的银丝均匀地镀上一层氯化银（呈紫灰色，而非光亮的银白色），以尽量减少记录伪迹（如连接电位的漂移）。若未达到要求，应更换为正确氯化的银丝。
      2. 如有需要，对新的银电极进行氯化处理。将电极丝小心清洁（通过快速穿过火焰），使其呈现光亮的银白色。避免用手直接触碰，以确保表面形成均匀的氯化银层。将电极丝浸入原液浓度的家用漂白剂中 15–30 分钟，直至其呈现紫灰色。或者，可对每根电极丝进行电镀处理（将其作为正极置于含 3 M KCl 的溶液中，并以 1 mA/cm² 的电流密度通电）² 表面面积）持续10 - 15秒，直至充分包被。
      3. 将回填的记录电极和参考电极连接至相应的电极夹。在可垂直调节的果蝇记录平台支架上放置一小滴任氏液。将电极尖端浸入任氏液中，测量记录电极尖端的电阻。
         注意：仅当测试从新批次玻璃管中拉制的电极的电阻特性，或通过迭代优化微电极拉制仪程序时，才需要执行此步骤。
      4. 在进行电阻测量之前，请阅读放大器制造商用户手册中关于适当测量设置的说明。对于性能良好的记录电极，其尖端电阻应为 ~100 - 220 MΩ。

2. 果蝇 准备

1. 收集羽化后5至10天的果蝇，放入含有标准培养基的洁净果蝇管中。较年轻的果蝇甚至“新生”果蝇也可获得良好的记录效果；但由于其复眼较软，为记录电极切开角膜时操作更为困难。
2. 制作果蝇捕捉管和果蝇制备台（图4）。有关这些自制工具的组装方式，请参见图4。
   1. 制作果蝇捕捉管时，将50 ml塑料离心管的锥形底部尖端切掉，然后将1 ml移液器吸头的大端插入并粘合到该新开口处。
   2. 最后，将移液器吸头的小端切割至适当大小，使果蝇能够顺利通过。请机械加工车间协助组装一个小型果蝇制备平台，该平台应支持双轴旋转，并可将果蝇固定装置锁定在不同位置。

图 4. 制作果蝇样本所需的工具与装置。 果蝇捕捉管由将一个1 ml塑料移液器吸头粘接到一个50 ml塑料离心管上制成。定制的果蝇制备台可使果蝇固定器自由旋转，并锁定在便于操作果蝇的特定位置。果蝇使用电加热蜂蜡器熔化的蜂蜡固定。石蜡油通过一个由粗毛发连接至手柄制成的小型涂抹器进行涂抹。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 用一个1 ml的移液枪头收集实验所需的果蝇，枪头大小应刚好允许果蝇通过。将带有移液枪头的捕获管连接到果蝇培养管上。利用果蝇天生向上攀爬（抗重力性）的习性，使其进入移液枪头中。建议优先选择体型最大的雌性果蝇，因为在电生理实验中体型具有重要意义。
   注意：果蝇体型越大，其细胞也越大，获得高质量细胞内记录的可能性越高。较小的果蝇（包括雌性和雄性）也可用于记录，但制备难度更高。一旦果蝇被限制在较大的移液枪头中，务必及时封闭果蝇管，防止其他果蝇逃逸。
4. 将一个100 ml的注射器通过一段柔性塑料软管连接至移液枪头的较大开口端——果蝇仍停留在枪头内。
5. 将移液枪头的细端（其扩大部分仅允许一只Drosophila通过）对准果蝇固定器底部的开口，轻轻推动注射器排出少量空气，将果蝇推入果蝇固定器中。
   1. 通过体视显微镜观察，并缓慢注入更多空气，直至果蝇头部从果蝇固定器的锥形末端伸出。确保果蝇从胸部至固定器顶部的小开口处被牢固固定。
6. 使用蜡加热器将蜂蜡从果蝇的“肩部”位置将其固定在果蝇固定器上。调节蜡加热器的温度，使其尽可能低，同时仍能干净地熔化蜂蜡。
   注意：当温度适当时，蜂蜡呈现透明状；温度过高会导致蜂蜡“烧焦”；温度过低则蜂蜡无法充分软化。固定果蝇时操作应准确且迅速，长时间的热暴露可能损伤果蝇。此处不推荐使用光固化牙科胶，因其固化过程过慢。

图 5. 为 活体实验准备果蝇。左图，将一只 Drosophila 的头部正直地置于果蝇固定装置中，并用加热融化的蜂蜡将其喙、右眼和肩部固定在装置上。右图，使用锋利的刀片在眼睛最厚的部分（位于赤道略上方，距后部角质层仅几个小眼处）切开一个小口。轻轻移除一小片角膜，并用凡士林密封切口，以防止眼睛干燥。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 固定果蝇头部。将蜂蜡涂抹在喙（图5）和右眼眼角处，注意避开角膜，并通过这些点将头部固定在果蝇固定装置上。
8. 制备微型刀具。使用两个刀片夹持器/断裂器（均带平面握柄）夹紧一片非不锈钢剃须刀片，将其锋利边缘轻敲裂出一条细小条带。出于健康与安全考虑，请佩戴护目镜以保护眼睛（尽管刀片破裂时碎片反弹的可能性极低）。理想情况下，应制得一个形似尖塔的锋利刃缘。确保该“尖塔”牢固地附着于刀片夹持器上，但操作时务必小心，避免造成自身伤害！
9. 使用微型刀具，在果蝇左眼处切开一个仅包含数个小眼的小孔——位置约在眼赤道线上方背侧角膜下4至5个小眼处，以便为记录微电极提供通路。操作需在体视显微镜下进行，并使用高倍放大观察制备过程。
   注意：由于果蝇眼睛具有弹性且对探针有阻力，使用“尖塔”形刀具切割效果最佳。该切割技术难度较高，请仔细观看视频演示。将果蝇固定装置保持在特定方向（置于果蝇制备架上）可使解剖操作更为容易。初学者可能觉得显微手术较难掌握，但随着练习深入，研究人员的三维感知能力和操作灵巧性会逐渐提高。
10. 小心移除刚切开的小片角膜，暴露出下方的视网膜。迅速用石油 jelly 涂抹工具上的细毛蘸取少量石油 jelly，覆盖住眼部的小孔。
    注意：石油 jelly 在此具有多重作用。它可防止组织脱水以及血淋巴凝结，后者可能导致插入的记录电极断裂。此外，石油 jelly 还会附着在微电极表面，降低其管壁电容，从而改善记录系统的频率响应，提高所记录神经信号的时间分辨率。注意避免将石油 jelly 涂抹至眼睛其他区域，以免影响光学清晰度。

3. 记录R1-R6光感受器或LMC的反应

1. 操作微电极放大器时，务必保持接地（例如通过触碰法拉第笼或防震台的金属表面），以防止意外将静电传递至前置放大器，从而避免损坏电路。
2. 使用两个鹅颈式导光管从上方照亮果蝇制备平台的立柱（图6A）（冷光源置于法拉第笼内），以便在密切视觉控制下将果蝇固定器放置在立柱上的理想位置。

图 6. 实验中果蝇夹持器与电极的定位。（A-B）果蝇夹持器置于记录平台之上，该平台还通过帕尔帖元件提供温度控制（A：中央白色圆形平台）。万向臂可精确调节光刺激的位置，使其与果蝇保持等距（通过 x、y 轴旋转），并将光源（液体或石英光纤束末端）直接对准果蝇的眼睛。在我们的许多装置中，光刺激由发光二极管（LED，配备线性电流驱动器）或单色仪产生。因此，这些刺激具有特定的（带通滤波的）光谱成分，波长范围可选为 300 - 740 nm，并覆盖 4 - 6 个对数强度单位（通过独立的中性密度滤光片衰减调节）。（C）两个微电极由独立的显微操作器控制，插入果蝇头部：参考电极（上方）穿过单眼；记录电极（左侧）穿过左眼的小孔。（D）为了获得尽可能多的光感受器记录，记录微电极沿吻部-单眼轴线平行插入孔中。当电极尖端穿入并密封至某一光感受器时，可自由旋转的光源即固定于该位置，使细胞对该特定光刺激产生最大电压反应。此空间位置即为该细胞感受野的中心。若孔靠近外骨骼，采用相同电极角度还可进一步实现对大细胞（LMC）的穿刺记录（左）。若孔离外骨骼较远，则另一种有效的电极入射角度也可用于获取 LMC 记录（右）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 将果蝇固定器（内含果蝇！）安装到果蝇制备平台的支架上。旋转果蝇固定器，使果蝇的左眼正对实验操作者（图6B）。
4. 在体视显微镜下观察样本，使用小型粗调微操纵器将钝性参考电极轻柔地穿过果蝇的单眼插入头壳内（图6C）。切勿将电极插入过深，以免损伤果蝇脑组织。
   1. 或者，可将参考电极插入胸部背面。务必确保果蝇状态健康（触角可活动），且其复眼完整，未被意外损伤。若样本状态不佳，应重新准备新的果蝇用于实验。
5. 将尖锐的记录微电极通过先前准备好的、涂有石蜡油的小开口插入左眼。使用体视显微镜的高倍放大功能，并调整导光管和焦平面，使电极尖端通过其反射模式在三维空间中清晰可见。
   注意：图6D展示了在记录感光细胞和L2型大单极细胞（LMC）时，果蝇头部相对于记录微电极进入眼睛角度的略微不同位置。将电极插入眼睛而不折断是实验中最困难的阶段。若电极尖端未对准眼睛的小开口而撞击角膜，通常会导致电极断裂。
6. 当两个电极均牢固插入样本并与其体液形成电接触后，打开微电极放大器。
7. 关闭法拉第笼内的冷光源，并将其从电源拔下。将其插头连接至中央接地端，以最小化接地环路引起的电噪声；同时移开鹅颈式导光管，以便卡丹臂系统可在果蝇周围自由移动。关闭室内照明，确保果蝇样本处于相对黑暗环境中。
8. 测量记录电极在眼内的电阻（按放大器用户手册说明操作）。仅使用电阻值在100–250 MΩ范围内的记录电极。
   注意：使用电阻<70 MΩ的电极几乎不可能获得高质量的细胞内记录。若电阻<80 MΩ，很可能电极尖端已断裂。此时应关闭放大器并更换记录电极。
   1. 更换电极并将其插入眼内后，重新开启放大器测量其电阻。有时电极进入组织时尖端可能被碎屑堵塞，可通过放大器的电容“嗡鸣”（buzz）和电流脉冲功能，利用快速共振或排斥作用清除堵塞。
9. 将放大器设置为电流钳（CC）或桥式记录模式。由于此时两个电极均位于电学连通的细胞外空间，需将信号偏移量（记录电压）调零，以消除记录电极与参考电极之间的任意电压差。可通过放大器显示屏或示波器屏幕监测信号偏移的变化。
10. 等待2–3分钟，使果蝇眼睛完成暗适应。
11. 以远程控制微操纵器的X轴压电步进装置，或轻柔旋转手动操纵器的精细调节旋钮，将记录电极尖端逐步深入眼内，每次推进0.1至1微米。
12. 在推进记录电极的过程中，用短暂（1–10毫秒）的光脉冲刺激果蝇眼睛。
    注意：若记录电极位于视网膜内且眼睛功能正常，每次闪光将引起短暂而微小的电压下降（0.2–5 mV的超极化），称为视网膜电图（ERG）。这种细胞外空间场电位的变化源于视网膜细胞对光的集体响应。然而，一旦电极尖端进入视叶的外髓区（lamina），接近L2型大单极细胞（LMC），ERG将发生反转，表现为去极化反应。
13. 利用卡丹臂系统移动光源，围绕果蝇眼睛寻找能引发最大ERG反应的位置。
    注意：该位置对应于视觉空间中的一个小区域，即位于记录电极尖端附近的感光细胞（或LMC）所接收光输入的视野范围。
14. 用记录电极穿刺细胞。
    注意：穿刺可能自发发生，也可能在电极微步前进时发生。轻敲微操纵器系统或使用放大器的“嗡鸣”功能可进一步促进穿刺，这些操作可在组织中引起电极尖端共振。当电极刺入感光细胞膜并进入其细胞内空间时，记录电极与参考电极之间的电压差会突然从0 mV降至约-65 mV（范围为-55至-75 mV）；而在穿刺LMC时，该电压下降通常较小（-30至-50 mV）。这些电压差代表了相应细胞的负静息电位。根据记录电极的质量（尖锐程度）及其穿刺的细胞结构，记录电极的电压读数可能迅速或逐渐稳定至静息电位，此过程伴随细胞膜与电极外壁的密封。但如果穿刺不完全或质量较差，电极通常会滑出细胞，记录电位逐渐回升至零。
15. 当电极密封良好、显示稳定的膜电位（暗静息电位）时，定位被穿刺细胞感受野的中心。使用卡丹臂系统移动闪光刺激光源，在果蝇眼睛周围寻找能引发细胞最大电压反应的视觉空间位置。当光源正对感受野中心时，锁定卡丹臂。
    注意：在黑暗条件下，Drosophila 感光细胞对强光脉冲的响应表现为40–65 mV的去极化电压反应^4,5，而稳定的LMC记录则显示20–45 mV的超极化反应^9,10,14。偶尔可能发生胶质细胞穿刺，其特征为<-80 mV的静息电位，以及更缓慢、更微弱（约5 mV）的饱和性光诱导去极化。具有不同眼色素的Drosophila 果蝇（如白眼⁷和肉桂眼突变体）的感光细胞，其响应幅度与野生型相当。
16. 在放大器的电流钳（CC）模式下，通过向被研究细胞注入小幅度（0.1 nA）、短暂（100–200毫秒）的电流脉冲，补偿记录电极的电容，以最小化细胞膜充电过程中的记录伪迹。
    注意：该重要步骤在放大器用户手册中有详细说明，建议在正式实验前使用电学细胞模型进行练习。
17. 记录细胞对光脉冲及其他具有不同统计或物理特性的刺激（如自然光强时间序列或随机对比度模式）的电压响应。例如，测试记录响应如何随明适应或暗适应条件变化。
    注意：可通过在光路中添加中性密度滤光片，以预设强度的持续光照精确实现明适应^4,5。或者，通过关闭光刺激一段预设时间实现长时间暗适应。由于记录系统的机械稳定性、记录电极的高质量以及样本的完整性，稳定的记录条件有时可持续数小时。因此，在理想情况下，可从单个细胞在不同适应条件下收集大量数据。当电极滑出细胞时，记录的响应会减弱，平均电压逐渐趋近于零。
18. 使用微操纵器的精细X轴控制，小心推进记录电极，直至其接触并穿刺下一个细胞（通常为最近的神经邻居）。切勿沿Y轴或Z轴移动电极，此类操作会导致电极横向“犁过”组织，损伤眼部结构！
    注意：使用优质电极和健康样本时，可在同一只果蝇中连续数小时（偶尔甚至整个工作日>8小时）记录多个感光细胞的高质量响应（但很少能记录多个LMC），且信号无明显衰减。
19. 定期保存带有标识信息（如日期、基因型和记录细胞类型）的数据文件。由于一次成功的记录会生成大量数据，应在实验记录本中做好详细书面记录，以便后续数据分析。

结果

本文所采用的尖端微电极记录方法已针对果蝇（Drosophila）眼部进行优化，可用于可靠地量化视网膜和外髓质细胞中的神经信息采样与处理过程，以及它们之间的通信^{4,5,7,8,10,33}。该方法已被广泛应用于研究不同野生型品系、突变体或基因工程果蝇品系中的视觉信号编码，充分证明了其价值；不仅可用于量化突变、温度、饮食或特定基因表达所带来的影响^{3,4,6,9,10,14,30,34}，还可揭示视觉行为改变背后的机制性原因^14,34。此外，该方法也易于应用于其他昆虫的神经生理记录^35,36，从而推动神经行为学领域的视觉研究。接下来，我们将展示该方法成功应用的若干实例。

图 7. 果蝇 R1-R6 感光细胞在 20 和 25 ^oC 下对光脉冲的电压反应。 由于尖锐微电极穿刺通常非常稳定，因此可以通过加热或冷却果蝇，记录同一 R1-R6 感光细胞在不同环境温度下对特定光刺激的电压反应。在我们的实验装置中，果蝇固定装置置于基于闭环帕尔帖元件的温控系统上，使我们能够在数秒内改变果蝇头部的温度。较高温度会加速电压反应，并特征性地降低 R1-R6 感光细胞的静息电位（如红色箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

研究温度对光感受器输出的影响

通过设计优良且隔振的记录系统，该方法可用于通过加热或冷却果蝇来测量温度对单个细胞神经输出的影响。图中示例显示了同一 R1-R6 光感受器在 20 和 25 ^oC 下对一个持续 10 毫秒的强光脉冲的电压反应（图 7）。如先前定量研究所示^4,9，升温会降低光感受器在暗处的静息电位，并加快其电压反应速度。

图8. 果蝇R1-R6光感受器的信号传递性能随光强增强而提高。（A）同一微电极在相同细胞中于20 ^oC条件下记录的光感受器对弱光（下方）和强光（上方；亮度高10,000倍）重复自然光强度时间序列的输出。强光刺激的响应幅度更大，因其整合了更多单光子引发的初级响应（即“光子 bumps”）^4,5,7,8。（B）叠加显示20个连续的、持续1秒的电压响应。单个响应（浅灰色）取自适应趋势（A中的箭头）消退之后（A中的虚线框）。对应的响应均值（即信号）为较深的曲线。信号与单个响应之间的差异即为噪声。（C）采用标准方法^4,5,7,8通过记录数据的信噪比（SNR）来量化细胞的信号传递性能。在强光刺激下，光感受器输出的可靠信号传递频率范围比弱光条件下宽约64 Hz（强光：SNR'_Bright ≥1，最高达84 Hz；弱光：SNR'_Dim ≥1，最高达20 Hz），且信噪比显著提高，从SNR_Dim^MAX = 87 提升至SNR_Bright^MAX = 1,868。请点击此处查看此图的放大版本。

通过重复刺激研究适应性与神经编码

该方法具有非侵入性，对视网膜和髓板结构造成的损伤相对较小，因此非常适合在接近自然生理状态下体内（in vivo）研究单个细胞对不同光刺激的信号响应性能。图8展示了在20 ^oC条件下，一个R1-R6光感受器对弱光和强光重复自然光强时间序列刺激的电压响应，而图9则展示了另一个R1-R6光感受器和一个LMC（小叶中间神经元）在25 ^oC条件下对另一种自然光刺激的响应。由于在同一果蝇体内同时进行视网膜和髓板区域的细胞内记录——即使用两根尖锐微电极分别在视网膜和髓板中记录——技术难度过高，难以实现，因此突触前和突触后记录分别来自两只不同的果蝇³⁰。

图9. 果蝇R1-R6光感受器和LMC在25 ^oC下对重复自然刺激的电压响应。（A）通过不同果蝇上的不同微电极记录的R1-R6（灰色）和LMC（黑色）输出。（B）完全光适应条件下，对同一自然刺激模式连续20次的突触前（上方）和突触后（下方）响应，单个响应以浅灰色显示，对应的平均响应（信号）以较深轨迹表示。信号与单个响应之间的差异即为噪声。（C）通过记录的信噪比（SNR）量化细胞的信号传递性能。LMC输出的可靠信号传递范围比R1-R6输出宽约10 Hz（SNR'_LMC ≥1，最高达104 Hz；SNR'_R ≥1，最高达94 Hz）。两者的信噪比均较高（SNR_LMC^MAX = 142，SNR_R^MAX = 752），由于记录噪声较低，其差异反映了细胞间真实存在的编码差异。请点击此处查看该图的放大版本。

刺激开始后，记录结果通常显示快速适应的趋势，这种趋势在5-6秒内基本消失。此后，细胞对每次持续1秒的刺激呈现高度一致的反应（每个虚线框内包含20次此类反应）。当这些反应叠加时，其可重复性变得明显（图8B 和 图9B）。单个反应以细灰线表示，其平均值以较粗的深色线表示。平均反应被视为神经信号，而神经噪声则是平均值与各个单独反应之间的差异^4,5,9,37,38。在频域中相应的信噪比（图8C 和 图9C）是通过对信号和噪声数据片段进行傅里叶变换得到功率谱，并将平均信号功率谱除以相应的平均噪声功率谱而获得的^4,5,9,37,38。典型地，记录到的神经输出对自然刺激的信噪比峰值很高（100 - 1,000），在最稳定的记录条件下，当记录噪声极低时，信噪比甚至可达到 >>1,000 的水平（例如，图8C）。还应注意，升温扩展了细胞可靠信号传递的带宽⁴（SNR'_Bright≥ 1）；例如，图8 和 图9 中两个R1-R6细胞之间的相对差异为10 Hz（在20 ^oC时为84 Hz，在25 ^oC时为94 Hz）。

人们还可以利用香农方程，根据每个细胞的信噪比进一步估算其信息传递速率。³²，或通过三重外推法计算响应熵与噪声熵率之间的差值³⁹有关信息理论分析的更多细节，以及该方法在使用这些分析时的优势与局限性，已在先前的出版物中详述。^7,8,39.

图10. 捕食性蝇类R1-R6感光细胞和LMC在19 ^oC下对重复自然刺激的电压响应。（A）通过同一微电极从同一只蝇中记录到的R1-R6（灰色）和LMC（黑色）输出；电极在眼内推进过程中，先记录到突触后信号，随后记录到突触前信号。（B）在初步适应后（A中的虚线框），连续记录了20次突触前（上方）和突触后（下方）对相同自然刺激模式的响应（浅灰色迹线）。它们的均值为信号（上方较深的迹线），而各次响应与均值之间的差异即为噪声。（C）相应的信噪比（SNR）计算方法同图8C和图9C。LMC输出的可靠信号传递频率范围比R1-R6输出宽约100 Hz（SNR'_LMC^MAX ≥1，最高达234 Hz；而SNR'_R^MAX  ≥1，最高达134 Hz）。两者的信噪比均较高（SNR_LMC^MAX = 137，SNR_R^MAX = 627），并且由于使用了同一微电极进行记录，二者之间的差异反映了突触前与突触后神经输出的真实差异。这些结果表明，记录系统的噪声较低，对分析结果的影响可忽略不计。请点击此处查看该图的放大版本。

神经行为学视觉研究

该方法还可用于记录不同昆虫物种复眼的突触前和突触后电压反应^7,8,35,36（图10），从而支持对视觉信息处理进行比较神经行为学研究。对于所展示的记录系统，唯一需要的调整是为所研究的物种配备新的样品固定装置，每个装置需具有合适尺寸的开口。这些示例性记录来自一只雌性捕食性蝇（Coenosia attenuata）。图中显示了R1-R6光感受器和LMC在相同重复光刺激下的细胞内电压反应，刺激条件与用于Drosophila的图9相同，但实验温度为19 ^oC。在此情况下，突触前和突触后的数据均来自同一只蝇，依次记录，使用同一根记录电极（充填3 M KCl），电极先穿过外侧视神经叶，再进入前部视网膜。与25 ^oC下的Drosophila数据相比，即使在较低温度下，Coenosia的数据仍表现出更快的动力学响应，使可靠信号传递（信噪比 >>1）的有效频率范围更广。这种在自然刺激神经编码中的功能适应性与Coenosia的捕食性生活方式一致³⁶，其快速的空中捕猎行为需要高精度的时空信息。

讨论

我们介绍了如何使用锋利的传统微电极在完整的果蝇复眼中记录R1-R6感光细胞和LMC细胞的细胞内反应的基本关键步骤。在过去18年中，该方法已与定制的硬件和软件工具共同优化，以获得高质量且持久的记录，用于回答广泛的实验问题。通过投入时间和资源构建稳定而精确的实验装置，并制备出具有理想电学特性的微电极，高质量的记录便可成为任何从事黑腹果蝇（Drosophila）视觉神经生理学研究的实验室中的常规操作。尽管设计良好的记录系统和光刺激系统对于快速执行不同实验范式至关重要，但有三个操作步骤对成功记录尤为关键：（i）制备果蝇样本时尽量减少对复眼的损伤；（ii）拉制出具备合适电学特性的微电极；（iii）将记录电极插入复眼时避免损伤其尖端。最终，为了获得有意义的数据，研究人员必须理解电生理学的物理基础，以及如何为特定靶细胞类型制备合适的微电极。

因此，该技术的局限性主要取决于研究者的耐心、经验和技术水平。由于掌握该技术需要较长时间，尤其对于微小样本而言 果蝇 细胞，电生理学初学者最好先以较大的昆虫复眼（例如丽蝇）进行练习³⁶ 或蝗虫³⁵使用相同的设备，一旦能够常规地对较大的光感受器和中间神经元进行高质量的细胞内记录，便可继续进行下一步 果蝇 眼睛。该技术的另一项局限在于细胞鉴定。穿透的 果蝇 细胞可通过电泳方式加载染料，包括 Lucifer yellow 或 neurobiotin。然而，由于微电极尖端尺寸较小，电泳效率较电阻较低的电极（如膜片钳电极）更低。此外，填充染料的微电极通常电学性能较差，使其在记录高质量电生理信号时更为困难 果蝇 光感受器和大运动前神经元（LMCs）。

有时会出现技术问题，表现为输入信号不稳定或完全缺失。这通常与电压信号持续漂移或超出放大器的记录范围（过高或过低）有关。大多数情况下，这种现象是由于记录电极被堵塞所致，或者电极尖端过细——电阻过高或管壁电容过大——无法有效传导快速的信号变化。尽管可以尝试通过“蜂鸣”电极电容的方式来疏通尖端，有时确实有效，但通常最有效的解决方法是直接更换记录电极。这可能还需要进一步调整微电极拉制仪的参数，以降低新电极的尖端电阻。在某些实验准备过程中，若使用石蜡油封闭角膜孔洞耗时过长，电极尖端也可能被堵塞。长时间暴露于空气中会使新暴露的视网膜组织干燥，其表层会变成类似胶状的物质。若发生这种情况，当将电极从眼球中抽出时，研究者通常会看到一团红色的组织黏附在记录电极上。此时唯一的解决办法是重新制备样本。石蜡油在电生理记录中具有多种优势：（i）可防止血淋巴凝固，避免其损坏电极尖端；（ii）可包覆电极尖端，降低其管壁电容，从而减小电极的时间常数，进而可能提高所记录神经信号的时间分辨率^40,41；（iii）保持电极尖端清洁，便于穿刺；穿刺后，（iv）甚至有助于将电极尖端与细胞膜密封⁴²。

当电极架的氯化银导线断裂或去氯化时，信号可能进一步变得不稳定或完全丢失；此时只需更换或重新氯化旧导线即可。信号缺失也可能是因为一个（或两个）电极架未牢固连接到插孔中。然而，设备本身发生故障的情况极为罕见。如果无法检测到信号，且已排除所有其他可能性，则应检查记录装置的各个部件（包括前置放大器、放大器、低通滤波器和模数/数模转换器）是否正确连接并正常工作。实现这一目的的一种方法是，用一台已知正常工作的设备中的相应仪器逐一替换现有仪器。或者，可使用信号发生器逐个检测各电子元件的性能。

但电生理学家面临的最常见技术问题或许是记录噪声。广义上，记录噪声是指除神经元对特定刺激的直接反应之外所观察到的电活动。由于果蝇制备样本在操作正确时非常稳定，因此所观察到的噪声（超出反应本身自然变异性之外的部分）通常来源于记录设备中的接地回路，或来自附近电子设备的干扰。此类噪声通常为50/60 Hz的电源嗡鸣及其谐波，但有时也包含更复杂的波形。为了确定噪声的来源，可将果蝇制备样本的固定装置从实验装置中移除，通过一滴果蝇任氏液将记录电极与参考电极连接（或将电极置于少量任氏液浴中；见步骤1.2.6），并在电压钳或桥式模式下记录信号。若在记录信号中观察到噪声，则表明该噪声很可能来自果蝇制备样本之外的外部来源。

另一种识别噪声来源的有效方法是将电极架替换为连接到放大器的电子细胞模型。在一个理想配置且良好接地的系统中，记录到的信号现在应几乎无噪声，仅显示来自模数转换器的随机比特噪声（在最佳情况下甚至比特噪声也不存在）。如果仍然存在噪声，则需重新检查所有设备是否正确接地。检测接地回路的一个简便方法是：（i）断开所有设备部件的接地线；（ii）使用欧姆表确认断开后每个部件确实与地隔离；（iii）将各个部件逐一直接连接至中央接地点，而不是通过设备的其他部分间接连接。同时尝试改变设备的配置。例如，有时将计算机和显示器移离设备更远可降低噪声；但在其他情况下，将计算机放入设备机架内部反而能减少噪声。还值得尝试拔掉附近的设备，观察噪声是否减少，或对额外组件进行屏蔽。此外，尝试拔下或更换记录设备中的不同组件，尤其是BNC电缆（其接地连接可能存在问题）。当使用细胞模型时，若仅观察到比特噪声，则初始噪声源可能来自电极或果蝇制备本身。例如，参考电极可能意外接触到了头囊内的运动神经或活性肌肉纤维（或在胸部放置时干扰了飞行肌）。通常最简单的做法是重新制备一只用于记录的果蝇，并注意尽量减少对果蝇的损伤。但如果噪声持续存在且为宽带噪声，则很可能是电极不适合实验需求——过于尖锐或过细（因而噪声过大），或根本不适用于当前目的；我们甚至观察到石英电极充当了天线，拾取到微弱的广播信号！尽管为了从特定细胞类型获得稳定高质量记录，需要反复调整拉制仪的参数以制备出理想的微电极，这一过程可能非常耗时，但这是值得的。一旦记录电极被优化适配于实验，便可实现持久且极高质量的记录。

尖端微电极记录技术也可用于研究多种样本中的神经信息处理过程，包括昆虫眼睛和大脑中不同的信息处理层^43,44。由于微电极尖端可以制作得非常精细，因此通常对被研究细胞的损伤小于大多数膜片钳技术的应用。重要的是，现代采样-保持微电极放大器能够良好地控制电极尖端的电学特性^40,45-47。因此，当正确应用时，该技术可在亚毫秒分辨率下，从体内^3,5,7-10,44或体外⁴⁸样本中获得高信噪比的可靠数据。这种精度是当前光学成像技术无法实现的，因为后者噪声更大、速度更慢。此外，该方法可用于在电流钳和电压钳配置下表征小细胞的电膜特性^{5,29,33,36,40-42,49}，为连接实验与理论的生物物理和经验建模方法提供有价值的数据^{7,8,11,33,49-54}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于制作果蝇标本的体视变焦显微镜	奥林巴斯	SZX12 DFPLFL1.6x PF 目镜：WHN30x-H/22	可实现约150倍放大，工作距离长；定制重型钢制台式支架
体视显微镜在细胞内实验装置中的应用	·  Olympus	奥林巴斯 SZX7；目镜：WHN30x-H/22	需要30倍目镜，以便在将电极穿过角膜小孔进入眼内时，能清晰观察到电极尖端的反射光
尼康显微镜	尼康 SMZ645；目镜：C-W30x/7
防振台	Melles Griot	面包板上带有公制M6孔	我们定制的实验装置在厚重的面包板上钻有一个大孔，可使来自下方的果蝇准备平台支柱（内含带电子元件的铜制散热片）穿过
纽波特
显微操作仪	Narishige	Narishige NMN-21	在我们的细胞内记录装置中，使用了不同的显微操作器系统来驱动尖端记录电极进入果蝇复眼。所列出的所有操作器均能成功地从黑腹果蝇的光感受器细胞和大细胞（LMCs）获得持久且稳定的记录。
Huxley Bertram	Huxley xyz轴精细手动控制
Sensapex	Sensapex 三轴系统
Märzhä用户	Märzhä配备额外X轴压电步进器和MS 314控制器的用户DC-3K
磁力架	任何带开关的磁力底座均可使用		例如，在法拉第笼内管理线缆
电极夹持器	哈佛仪器	ESP/W-F10N
银丝	World Precision Instruments	AGW1510	0.3 - 0.5 mm 直径；电极夹需进行氯化处理
光纤光源	多种不同品牌，包括 Olympus
光纤束	超精细技术		为向万向节臂系统传递LED光刺激，我们使用液体和石英光导纤维（波长范围从紫外到红外）。
索恩实验室
果蝇捕捉管		P80-50P 50 ml 离心管，聚丙烯材质，100 个/包	从50 ml塑料离心管上切下锥形底部，并在其上粘接一个1 ml移液器吸头。
数字采集系统	国家仪器公司
单电极电流/电压钳制微电极放大器	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	表现卓越！
前置放大器	标准（±150 nA）	对于 npi SEC-10LX
LED 光源与驱动器	2通道OptoLED（Cairn Research Ltd.，英国）		我们的许多刺激系统均为自主研发
自行设计与构建
数据采集与分析软件	可供选择的公司众多		Biosyst；Juusola 实验室用于实验与理论研究的定制Matlab系统
个人电脑或 Mac			确保计算机（PC 或 Mac）与数据采集系统及软件兼容
万向节系统	自行设计与构建		提供光刺激的精确定位（x,y,z）
帕尔帖温度控制系统	自行设计与构建
法拉第笼	自建		电磁噪声屏蔽
细丝状硼硅酸盐玻璃毛细管		外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
细丝化石英玻璃毛细管		外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
拉针仪	Sutter Instrument Company	Model P-2000 激光 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	对于硼硅酸盐参比电极，使用预设程序#11（膜片电极）：加热值 = 350；灯丝 = 4；拉速 = 36；延迟 = 200）。对于硼硅酸盐记录电极，使用预设程序#12（该程序通常可拉制出性能良好的传统尖端电极）  用于感光细胞记录：加热值 = 355；灯丝值 = 4；速度 = 50；延迟 = 225；拉力 = 150。对于需要更细电极尖端的LMC记录，这些参数需进行调整。拉制石英毛细管时，P-2000手动操作建议使用细尖微电极的程序。这些程序’ 预设参数可作为系统性优化的有用起点，以制备出穿透成功率高且记录噪声低的电极。
参比电极用细胞外林格溶液	来自 Fisher Scientific 的化学品	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 蔗糖	参见方案部分的配方
用于填充记录微电极的 3 M KCl 溶液	Fisher Scientific 公司的盐类	10010310，KCl
凡士林	凡士林
非不锈钢剃须刀片
刀片架/刀片分割器	Fine Science Tools 品牌，由 Dumont 生产	10053-09	9 cm
蓝丁胶	Bostik		或者，使用模具粘土
镊子	Dumont 品牌的精细科学工具	11252-00	#5SF（超细吸头）