本方案描述了使用定制的便携式FRET分析仪对荧光共振能量转移（FRET）传感器数据进行快速且高灵敏度定量的方法。该设备用于在可最大化检测灵敏度的关键温度范围内检测麦芽糖，从而实现对糖含量的实用且高效的评估。
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摘要
摘要
近年来，福斯特共振能量转移（FRET）传感器的改进使其可用于检测多种小分子，包括离子和氨基酸。然而，FRET传感器固有的信号强度较弱，这一问题严重限制了其在多个领域的应用，并导致必须使用昂贵的高端荧光仪。此前，我们开发了一种成本低廉、性能优异的FRET分析仪，可特异性测量两个发射波长范围（530 nm和480 nm）的比值，从而实现高检测灵敏度。最近研究发现，基于细菌周质结合蛋白的FRET传感器在50–55 °C的关键温度范围内对配体的检测灵敏度达到最高。本报告介绍了一种利用我们便携式FRET分析仪结合温度特异性FRET传感器测定市售饮料样品中糖含量的实验方案。结果表明，对FRET传感器进行额外的预加热处理可显著提高FRET比值信号，从而实现对糖含量更准确的测定。我们自主研制的FRET分析仪与传感器已成功应用于三种市售饮料中糖含量的定量分析。我们预计，未来设备在体积进一步缩小和性能持续提升后，将有助于手持式分析仪在无法使用高端设备的环境中推广应用。
引言
荧光共振能量转移（FRET）已被广泛用作生物传感器，用于检测糖类、钙离子和氨基酸等小分子1-4。FRET 生物传感器包含荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），这些蛋白被融合在周质结合蛋白（PBP）的两端。糖分子结合到位于 FRET 传感器中间的 PBP 上，引起传感器结构变化，从而改变位于 PBP 两端的两个荧光蛋白之间的距离和跃迁偶极取向。这种变化使得通过测量增强型黄色荧光蛋白（EYFP，530 nm）和增强型青色荧光蛋白（ECFP，480 nm）发射波长的比值，可对糖含量进行定量分析。由于 FRET 生物传感器具有高灵敏度、高特异性、实时监测能力和快速响应时间，因此在环境、工业和医学领域得到广泛应用5。此外，使用 FRET 生物传感器进行比率测量具有重要的实际优势，可用于检测传感器浓度难以精确控制且背景荧光始终存在的复杂生物样品中的组分。
尽管基于FRET的传感器在定量可视化方面具有上述优势，但微小的结构变化会导致结构域运动无法完全传递至荧光蛋白，从而产生本质上较弱的信号强度。这种弱信号限制了基于FRET的传感器在体外（in vitro）或体内（in vivo）分析中的应用6。因此，大多数FRET生物传感器需要使用昂贵且高灵敏度的设备。此前，我们开发了一种低成本且便携式的FRET分析仪，其性能与现有的荧光分析仪相当7。该设备采用....
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方案
1. 生物传感器的制备
- 按照先前建立的方案2构建质粒pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6。
- 取5 ml LB培养基，接种一株大肠杆菌（Escherichia coli）DE3单菌落，于37 °C振荡培养16小时。
- 将过夜培养物（O/N）1 ml转移至含有100 ml LB培养基的500 ml三角瓶中，于37 °C振荡培养，直至600 nm处的光密度（OD600）达到0.5（约3小时）。
- 在4 °C条件下，以1,000 × g离心20分钟，于50 ml锥形管中收集细胞。
- 每管中迅速加入50 ml冰冻去离子水（DW）重悬沉淀，在4 °C条件下以1,000 ×g离心20分钟。
- 用含10%（v/v）甘油的50 μl冰冻去离子水轻轻涡旋重悬沉淀，直至溶液（电转感受态细胞）的OD600达到100。
- 将电转感受态细胞混合物（50 μl，OD600为100）与10 ng质粒pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6加入冰冻的电穿孔比色皿中，置于电穿孔仪中进行电转（18 kV/cm，25 µF）。
- 迅速向比色皿中加入1 ml SOC培养基，轻轻重悬细胞，随后在15 ml圆底管中于37 °C轻度振荡培养1小时以恢复细胞生长。
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结果
为了使用FRET分析仪对糖含量进行定量分析，需要建立一条拟合曲线，以根据观测到的FRET比值估算目标糖浓度。设r为CFP在480 nm处的发射强度与YFP在530 nm处产生的发射强度的比值（公式1）。
通过在不同糖浓度下观察FRET生物传感器（CMY-BII，53 °C）的FRET比率r，可生成其剂量-反应曲线。该曲线可表示.......
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讨论
本方案利用自制的FRET分析仪，在FRET传感器的最佳温度下快速高效地定量饮料样品中的糖含量7。该分析仪采用近期开发的低成本405 nm波段紫外LED作为光源，并配备两个带有硅光电二极管的光电探测器。该设备比其他同类荧光光度计更具成本效益。在测量FRET传感器最佳温度范围内两个发射波长带（530 nm和480 nm）的比值时，该设备表现出高检测灵敏度。其在检测多种糖类时的灵敏度和信号强度均优于荧光分光光度计设备7。
本实验方案的主要目标是借助自制的FRET分析仪，支持基于FRET的传感器的广泛应用。尽管该分析仪通过FRET传感器间接测量糖含量，但显然该设备融合了FRET传感器的多项优势，包括可通过基因工程广泛扩展的配体特异性、模块化设计、与传感器浓度无关的信号输出，以及对细胞内小分子的精确定位检测。FRET传感器实际上已被用于检测多种小分子，包括离子9、血红素10等。此外，超过20种不同类型的FRET构建体可通过非营利性质粒库AddGene轻松查找并订购11。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由全球前沿项目智能合成生物学中心（2011-0031944）和韩国生物技术研究基金会研究启动计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB | BD | #244620 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Sigma | I6758 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | A9518 | |
| Tris-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，20 mM 葡萄糖 | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm 阴离子交换色谱柱 |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| 石英比色皿 | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | 快速蛋白液相色谱仪（FPLC） |
| Cary Eclipse | VarianInc | 荧光分光光度计 | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | 多功能酶标仪 |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | 电转感受态细胞 | |
| A（饮料） | 韩国益力多公司（韩国） | Birak | 发酵饮料 |
| B（饮料） | 乐天食品（韩国） | Epro | 软饮料 |
| C（饮料） | 乐天食品（韩国） | Getoray | 运动饮料 |
参考文献
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G.
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重印与许可
