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高灵敏度快速荧光检测结合便携式FRET分析仪

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DOI：

10.3791/54144

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2016年10月1日

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1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用定制的便携式FRET分析仪对荧光共振能量转移（FRET）传感器数据进行快速且高灵敏度定量的方法。该设备用于在可最大化检测灵敏度的关键温度范围内检测麦芽糖，从而实现对糖含量的实用且高效的评估。

摘要

近年来，福斯特共振能量转移（FRET）传感器的改进使其可用于检测多种小分子，包括离子和氨基酸。然而，FRET传感器固有的信号强度较弱，这一问题严重限制了其在多个领域的应用，并导致必须使用昂贵的高端荧光仪。此前，我们开发了一种成本低廉、性能优异的FRET分析仪，可特异性测量两个发射波长范围（530 nm和480 nm）的比值，从而实现高检测灵敏度。最近研究发现，基于细菌周质结合蛋白的FRET传感器在50–55 °C的关键温度范围内对配体的检测灵敏度达到最高。本报告介绍了一种利用我们便携式FRET分析仪结合温度特异性FRET传感器测定市售饮料样品中糖含量的实验方案。结果表明，对FRET传感器进行额外的预加热处理可显著提高FRET比值信号，从而实现对糖含量更准确的测定。我们自主研制的FRET分析仪与传感器已成功应用于三种市售饮料中糖含量的定量分析。我们预计，未来设备在体积进一步缩小和性能持续提升后，将有助于手持式分析仪在无法使用高端设备的环境中推广应用。

引言

荧光共振能量转移（FRET）已被广泛用作生物传感器，用于检测糖类、钙离子和氨基酸等小分子1-4。FRET 生物传感器包含荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），这些蛋白被融合在周质结合蛋白（PBP）的两端。糖分子结合到位于 FRET 传感器中间的 PBP 上，引起传感器结构变化，从而改变位于 PBP 两端的两个荧光蛋白之间的距离和跃迁偶极取向。这种变化使得通过测量增强型黄色荧光蛋白（EYFP，530 nm）和增强型青色荧光蛋白（ECFP，480 nm）发射波长的比值，可对糖含量进行定量分析。由于 FRET 生物传感器具有高灵敏度、高特异性、实时监测能力和快速响应时间，因此在环境、工业和医学领域得到广泛应用5。此外，使用 FRET 生物传感器进行比率测量具有重要的实际优势，可用于检测传感器浓度难以精确控制且背景荧光始终存在的复杂生物样品中的组分。

尽管基于FRET的传感器在定量可视化方面具有上述优势，但微小的结构变化会导致结构域运动无法完全传递至荧光蛋白，从而产生本质上较弱的信号强度。这种弱信号限制了基于FRET的传感器在体外（in vitro）或体内（in vivo）分析中的应用6。因此，大多数FRET生物传感器需要使用昂贵且高灵敏度的设备。此前，我们开发了一种低成本且便携式的FRET分析仪，其性能与现有的荧光分析仪相当7。该设备采用廉价的405 nm波段紫外发光二极管（LED）作为光源，激发荧光信号，从而替代了昂贵的灯源或激光器。分析仪的检测系统通过硅光电二极管，将衰减的荧光信号高效聚焦到两个光电探测器上。在最近的一项研究中，我们发现将检测温度优化至50 - 55 °C可显著增强比率型FRET信号8。这种温度特异性的信号增强，结合自制的FRET分析仪，使得FRET传感器能够在更广泛的诊断应用中实现快速且高灵敏度的检测。

在本方案中，我们通过定量分析市售饮料中的糖含量，验证了FRET分析仪在最佳FRET温度条件下的普遍适用性。本方案详细介绍了FRET设备的操作方法，以及传感器和样品制备的简要步骤。我们预期本报告将推动便携式分析仪在小型实验室环境中的潜在应用，并为基于FRET生物传感器的低成本现场诊断设备的进一步开发奠定基础。

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方案

1. 生物传感器的制备

  1. 按照先前建立的方案2构建质粒pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6。
  2. 取5 ml LB培养基，接种一株大肠杆菌（Escherichia coli）DE3单菌落，于37 °C振荡培养16小时。
  3. 将过夜培养物（O/N）1 ml转移至含有100 ml LB培养基的500 ml三角瓶中，于37 °C振荡培养，直至600 nm处的光密度（OD600）达到0.5（约3小时）。
  4. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心20分钟，于50 ml锥形管中收集细胞。
  5. 每管中迅速加入50 ml冰冻去离子水（DW）重悬沉淀，在4 °C条件下以1,000 ×g离心20分钟。
  6. 用含10%（v/v）甘油的50 μl冰冻去离子水轻轻涡旋重悬沉淀，直至溶液（电转感受态细胞）的OD600达到100。
  7. 将电转感受态细胞混合物（50 μl，OD600为100）与10 ng质粒pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6加入冰冻的电穿孔比色皿中，置于电穿孔仪中进行电转（18 kV/cm，25 µF）。
  8. 迅速向比色皿中加入1 ml SOC培养基，轻轻重悬细胞，随后在15 ml圆底管中于37 °C轻度振荡培养1小时以恢复细胞生长。
  9. 将细胞涂布于含100 µg/ml氨苄青霉素的LB平板上，于37 °C培养12小时。
  10. 用接种环挑取单菌落，接种至含100 µg/ml氨苄青霉素的10 ml LB培养基中，于37 °C摇床培养12小时。
  11. 将5 ml种子培养物加入500 ml含100 µg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37 °C振荡培养箱中继续培养。
  12. 当OD600达到0.5时，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在37 °C振荡培养箱中继续培养24小时。
  13. 在4 °C条件下以4,500 × g离心20分钟，小心弃去上清液。
  14. 用5 mL结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM PMSF，0.5 mM EDTA，1 mM DTT）重悬沉淀。
  15. 在冰上进行超声处理，以200–300 W功率进行六次10秒脉冲，每次脉冲后冷却10秒。
  16. 在4 °C条件下以10,000 ×g离心30分钟，沉淀细胞碎片，将上清液（可溶性蛋白）转移至新的收集管中。
  17. 为实现FRET传感器蛋白的亲和纯化，将4 ml澄清的细胞裂解液上样至Ni-NTA亲和柱（5 ml体积），并使用快速蛋白液相色谱（FPLC）18进行层析分析。
  18. 用五倍柱体积的洗涤缓冲液I（50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM氯化钠，10 mM咪唑，pH 7.0）洗涤柱子一次。
  19. 用五倍柱体积的洗涤缓冲液II（50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH 7.0）重复洗涤步骤。
  20. 用五倍柱体积的洗脱缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM氯化钠，500 mM咪唑，pH 7.0）洗脱传感器蛋白。
  21. 为浓缩并脱盐洗脱样品，将最多20 ml样品加入超滤浓缩管（截留分子量10,000）中，在3,000 × g下离心10分钟。用0.8%磷酸盐缓冲液（PBS）重新填充浓缩管。重复此步骤两次，第一次加入20 ml样品，然后再次用PBS填充。
  22. 回收浓缩并脱盐后的传感器蛋白，并于-80 °C保存。

2. 使用FRET分析仪测量糖含量

注意：FRET 分析仪构建的详细信息已在我们之前的工作中描述过7。

  1. 配制含有0.2 µM传感器蛋白的0.8% PBS检测溶液。
  2. 打开FRET分析仪。按下 "向上" 按下按钮 2 秒以校准最佳温度。使用该按钮将温度设置为 53 °C。 "向上" 和 "向下" 按钮并按下 "SET" 按钮
  3. 校准过程中，按住并保持 "向上" 和 "向下" 同时按下按钮2秒，确认LED面板显示 "校准" 并按下 "SET" 按钮
  4. 将一个仅装有PBS缓冲液的12.5 × 12.5 × 45 mm（长×宽×高）矩形平行六面体容器（比色皿）放入分析仪的比色皿架中，然后按下 "SET" 按钮
  5. 更换为仅含有检测溶液（见2.1）但不含糖（麦芽糖/蔗糖）的比色皿，然后按下 "SET" 校准基线按钮。
  6. 更换为含有10 mM糖的检测溶液的比色皿，然后按下 "SET" 按钮
  7. 为测定饮料样品中的糖含量，取1 ml饮料样品置于1.5 ml微量离心管中，在16,000 × g离心1分钟。
    注意：基于FRET传感器的荧光检测具有无需对样品进行特殊预处理的优势，因为样品仅占总体积的1%（v/v）。然而，我们建议去除可能影响荧光检测的任何物质例如， 细胞、不溶性颗粒、脂质、脂肪或任何具有自发荧光的物质。此外，若存在高浓度的强酸、强碱、清洗剂（洗涤剂）或乳化剂（乳化剂），且可能影响FRET生物传感器的性能，则应使用有机溶剂或中和剂将其去除。例如，在从冷冻零食中去除乳脂和乳化剂时，将样品在微量离心管中以16,000 × g离心30分钟，收集底部沉淀与上层乳脂之间的液体。随后加入等体积的正己烷，再以15,000 × g离心30分钟以去除脂质。
  8. 用1 ml注射器吸除上清液，并通过孔径0.2 µm的注射器滤器过滤。
  9. 将0.1 ml过滤后的饮料样品加入含有0.9 ml PBS的1.5 ml微量离心管中，轻轻涡旋混匀。
    注意：正确稀释饮料样品至关重要。本实验中进行了1,000倍稀释，以使糖浓度落在仪器的动态检测范围内。我们建议通过参考饮料标签上的糖含量，预先估算目标糖浓度。
  10. 向含有0.495 ml检测溶液的比色皿中加入5 µl稀释后的饮料样品（1%，v/v）。
  11. 将比色皿放入FRET分析仪的比色皿 holder 中，并将样品溶液预热至53 °C。
  12. 按压 "SET" 按钮用于测量糖含量。
    注意：可通过读取488/535 nm处的荧光比值，使用配备帕尔帖温控装置的多功能酶标仪或荧光分光光度计来评估FRET测量结果。7,8使用CSY-LH传感器检测蔗糖时，按照步骤1.1至2.12进行操作2.

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结果

为了使用FRET分析仪对糖含量进行定量分析，需要建立一条拟合曲线，以根据观测到的FRET比值估算目标糖浓度。令r表示在480 nm处CFP的发射强度与在530 nm处YFP的发射强度之比（公式1）。

figure-results-1

通过在不同糖浓度下观察FRET生物传感器（CMY-BII，53 °C）的FRET比率r，可生成其剂量-反应曲线。该曲线可表示为如下S形的sigmoid曲线：

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讨论

本方案利用自制的FRET分析仪，在FRET传感器的最佳温度下快速高效地定量饮料样品中的糖含量7。该分析仪采用近期开发的低成本405 nm波段紫外LED作为光源，并配备两个带有硅光电二极管的光电探测器。该设备比其他同类荧光光度计更具成本效益。在测量FRET传感器最佳温度范围内两个发射波长带（530 nm和480 nm）的比值时，该设备表现出高检测灵敏度。其在检测多种糖类时的灵敏度和信号强度均优于荧光分光光度计设备7。

本实验方案的主要目标是借助自制的FRET分析仪，支持基于FRET的传感器的广泛应用。尽管该分析仪通过FRET传感器间接测量糖含量，但显然该设备融合了FRET传感器的多项优势，包括可通过基因工程广泛扩展的配体特异性、模块化设计、与传感器浓度无关的信号输出，以及对细胞内小分子的精确定位检测。FRET传感器实际上已被用于检测多种小分子，包括离子9、血红素10等。此外，超过20种不同类型的FRET构建体可通过非营利性质粒库AddGene轻松查找并订购11。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由全球前沿项目智能合成生物学中心（2011-0031944）和韩国生物技术研究基金会研究启动计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LBBD#244620
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）SigmaI6758
氨苄青霉素SigmaA9518
Tris-HClBioneerC-9006-1
PMSFSigma78830
EDTABioneerC-9007
DTTSigmaD0632
NaClJunsei19015-0350
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco70011-0440.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC2% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，20 mM 葡萄糖
Resource QAmersham Biosciences17-1177-016 × 30 mm 阴离子交换色谱柱 
HisTrap HP1Amersham Biosciences29-0510-21
石英比色皿SigmaZ802875
AKÄKTAFPLCAmersham Biosciences18-1900-26快速蛋白液相色谱仪（FPLC）
Cary EclipseVarianInc荧光分光光度计
VICTOR  PerkinElmer2030-0050多功能酶标仪
E. coli JM109 (DE3)Promega电转感受态细胞
A（饮料）韩国益力多公司（韩国）Birak发酵饮料
B（饮料）乐天食品（韩国）Epro软饮料
C（饮料）乐天食品（韩国）Getoray运动饮料

参考文献

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