黏蛋白是一类高分子量的糖缀合物，其大小范围为 0.2 至 200 兆道尔顿（MDa）。由于分子尺寸较大，黏蛋白无法穿透传统的聚丙烯酰胺凝胶，需要更大孔径的凝胶才能实现分离。本文提供了一种详细的黏蛋白琼脂糖凝胶电泳实验方案，用于相对定量分析及聚合体组装的研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
黏蛋白是一类高度糖基化的蛋白质，覆盖在黏膜表面，在进化过程中成为先天防御的关键组分，通过抵御病原体入侵来保护上皮组织。这些大分子的主要功能是促进颗粒的捕获与清除，同时维持黏膜的润滑。在蛋白质合成过程中，黏蛋白会经历强烈的O-糖基化和多聚化修饰，显著增加其分子质量和体积。这些翻译后修饰对黏液的黏弹性特性至关重要。由于这些分子具有复杂的生化与生物物理特性，使用传统蛋白质分析方法研究黏蛋白面临诸多挑战。例如，其高分子量阻碍了在常规聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移，而其黏性特性则导致其容易黏附于实验管路。然而，近年来人们对黏蛋白在健康（例如，维持黏膜完整性）和疾病（例如，黏蛋白浓度过高、黏液滞留、癌症）中的作用日益关注，黏蛋白正被探索作为潜在的治疗靶点。更深入地理解黏蛋白大分子的生成与功能，可能催生新的药物策略，例如，抑制黏蛋白颗粒胞吐的药物和/或黏液溶解剂。因此，建立一致且可靠的黏蛋白生物学研究方案对科学进步至关重要。本文中，我们描述了使用琼脂糖凝胶电泳分离黏蛋白大分子、将蛋白质转印至硝酸纤维素膜，并利用黏蛋白特异性抗体及红外荧光凝胶成像系统进行信号检测的常规方法。这些技术广泛适用于黏蛋白定量、多聚化状态分析，以及评估药物化合物对黏蛋白的影响。
引言
黏蛋白通常由暴露于外环境的腔道黏膜表面（例如，呼吸道、消化道、生殖道、眼表）以及某些内脏器官（例如，胰腺、胆囊、乳腺）产生。这些糖蛋白的存在可维持表面的水合状态，并形成抵御病原体的物理屏障。尽管黏蛋白的产生对黏膜健康至关重要，但黏蛋白浓度过高和（或）黏液性质异常可导致导管阻塞、细菌定植及慢性炎症，进而引发不可逆的组织损伤。类似的一系列病理过程可见于多种疾病，例如，囊性纤维化1、慢性中耳炎2和宫颈阴道感染3。因此，理解黏蛋白在健康与疾病中的作用，并建立常规的蛋白质鉴定方案具有重要意义。
迄今为止，已鉴定出19个黏蛋白基因，其编码的多肽链长度范围从1,200（例如，MUC1）至 22,000（例如，MUC16）氨基酸。黏蛋白基因家族可分为两个亚型：膜结合型黏蛋白和凝胶形成型黏蛋白。前者参与细胞信号传导和细胞表面保护，后者则赋予黏液凝胶其黏弹性特性。膜结合型黏蛋白多为单体结构，通过疏水性跨膜结构域锚定于细胞表面。相比之下，凝胶形成型黏蛋白含有多个血管性血友病因子（vWF）样结构域和富含半胱氨酸的结构域，这些结构域对于动态多聚网络的形成至关重要。大量糖链通过丝氨酸和苏氨酸残基连接到载蛋白核心（apomucin）上，这些密集的O-连接寡糖可占分子量的80%4分子内和分子间二硫键连接黏蛋白单体，从而维持黏蛋白凝胶....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备黏蛋白凝胶 Western 印迹缓冲液
- 配制1升50倍浓度的TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液。
- 在700 ml去离子水（dH2O）中加入242 g Tris碱（0.4 M）、57.1 g冰乙酸（称量液体）（0.2 M）和14.61 g乙二胺四乙酸（EDTA）（50 mM）。
- 调节pH至8.0，并用dH2O定容至1升。
- 配制10 ml 10倍浓度的上样缓冲液。
- 配制5 ml 1倍浓度的TAE缓冲液。加入5 ml甘油（50%）、25 mg溴酚蓝（0.25%）和100 mg十二烷基硫酸钠（SDS）（1%）。
- 配制2升20倍浓度的柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液。
- 在1.5升dH2O中加入350.6 g NaCl（3 M）和176.4 g柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）（0.3 M）。调节pH至7.0，并用dH2O定容至2升。
- 配制1升含0.1% SDS的1倍TAE缓冲液。
- 将20 ml 50倍TAE缓冲液加入980 ml dH2O中。加入1 g....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们展示了对小鼠肺部支气管肺泡灌洗液（BALF）进行琼脂糖凝胶电泳后黏蛋白表达的代表性结果（图1）。在本示例中，我们使用琼脂糖凝胶显示了在Tg-Muc5ac小鼠模型中经IL-13处理后黏蛋白生成的上调。Western印迹提供了黏蛋白表达的可视化图谱，可用于多聚体或单体条带信号强度的定量分析（图2）。该方法也可用于检测人支气管上皮（HBE）细胞冲洗液及人痰液样本中黏蛋白的表达。此外，该方法可用于显示经还原剂处理后黏蛋白表达的减少。我们展示了用递增浓度DTT处理的HBE冲洗液的代表性结果（图3）。我们对使用还原剂处理导致黏蛋白还原后多聚体信号强度的降低进行了定量分析（图4）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本视频中描述的黏蛋白Western印迹实验方案，结合了分子生物学中用于分离和转移DNA等大分子的常规技术，以及常规的蛋白质检测技术。 即，免疫印迹。该技术也可用于研究复杂糖胺聚糖的生物学特性，例如高分子量透明质酸的降解18尽管该技术可广泛应用于多种检测，但成功的琼脂糖Western印迹依赖于多个步骤，这些步骤需要细致且严格把握时间的操作。为了最大限度地提高成功率，应重点关注一些关键步骤。
样品制备与凝胶上样是获得准确结果的关键步骤。富含黏蛋白的样品， 即，痰液具有天然黏附实验管道的特性， 即，移液器吸头，离心管，滤器。使用正向置换移液器并预先润湿移液器吸头有助于将粘弹性材料加样至孔中。由于此类样品具有较高的浮力和黏附性，操作时需特别注意。浓度过高的样品（高于5 mg/ml）在0.8%琼脂糖凝胶的孔径中迁移效果较差，可能需要进一步稀释和/或在最高6 M尿素中进行变性处理。然而，应避免上样经盐酸胍（GuHCl）变性的样品，因为胍离子会与SDS发生沉淀。因此，保存在GuHCl中的样品需额外进行透析步骤。对于非聚合.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 John Sheehan 博士和 Lubna Abdullah 博士在本研究完成过程中所提供的指导与 mentorship。本研究得到了美国国立卫生研究院（P01HL108808，UH2HL123645）和囊性纤维化基金会治疗公司（EHRE07XX0）的资金支持。Kathryn Ramsey 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）早期职业研究人员奖学金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tris 碱 | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| 冰醋酸 | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| 甘油 | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| 溴酚蓝 | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20× SSC（柠檬酸钠-氯化钠）缓冲液 | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7） | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT（二硫苏糖醇） | Sigma | D0632 | 25 g |
| 奶粉 | Saco | 速溶脱脂奶粉 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| 抗-GFP 山羊一抗（小鼠样本） | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 抗-Muc5b 兔一抗（小鼠样本） | UNC | ||
| H300 抗-MUC5B 一抗（人样本） | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 抗-MUC5AC 一抗（人样本） | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| 驴抗兔 800CW 红外染料 | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| 驴抗鼠 680LT 红外染料 | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| 电泳凝胶槽及制胶托盘 | Owl Seperation Systems | ||
| 电源装置 | Biorad | Model 200/20 | |
| 膜转移滤纸 | Amersham | 10600016 | |
| Whatman 滤纸和硝酸纤维素膜 | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene 真空印迹仪 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey 红外荧光成像系统 | LI-COR Biosciences |
参考文献
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
