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方法文章

黏蛋白琼脂糖凝胶电泳：高分子量糖蛋白的蛋白质印迹法

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DOI：

10.3791/54153

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2016年6月14日

 ,  , 
1Marsico Lung Institute/CF Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

黏蛋白是一类高分子量的糖缀合物，其大小范围为 0.2 至 200 兆道尔顿（MDa）。由于分子尺寸较大，黏蛋白无法穿透传统的聚丙烯酰胺凝胶，需要更大孔径的凝胶才能实现分离。本文提供了一种详细的黏蛋白琼脂糖凝胶电泳实验方案，用于相对定量分析及聚合体组装的研究。

摘要

黏蛋白是一类高度糖基化的蛋白质，覆盖在黏膜表面，在进化过程中成为先天防御的关键组分，通过抵御病原体入侵来保护上皮组织。这些大分子的主要功能是促进颗粒的捕获与清除，同时维持黏膜的润滑。在蛋白质合成过程中，黏蛋白会经历强烈的O-糖基化和多聚化修饰，显著增加其分子质量和体积。这些翻译后修饰对黏液的黏弹性特性至关重要。由于这些分子具有复杂的生化与生物物理特性，使用传统蛋白质分析方法研究黏蛋白面临诸多挑战。例如，其高分子量阻碍了在常规聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移，而其黏性特性则导致其容易黏附于实验管路。然而，近年来人们对黏蛋白在健康（例如，维持黏膜完整性）和疾病（例如，黏蛋白浓度过高、黏液滞留、癌症）中的作用日益关注，黏蛋白正被探索作为潜在的治疗靶点。更深入地理解黏蛋白大分子的生成与功能，可能催生新的药物策略，例如，抑制黏蛋白颗粒胞吐的药物和/或黏液溶解剂。因此，建立一致且可靠的黏蛋白生物学研究方案对科学进步至关重要。本文中，我们描述了使用琼脂糖凝胶电泳分离黏蛋白大分子、将蛋白质转印至硝酸纤维素膜，并利用黏蛋白特异性抗体及红外荧光凝胶成像系统进行信号检测的常规方法。这些技术广泛适用于黏蛋白定量、多聚化状态分析，以及评估药物化合物对黏蛋白的影响。

引言

黏蛋白通常由暴露于外环境的腔道黏膜表面（例如，呼吸道、消化道、生殖道、眼表）以及某些内脏器官（例如，胰腺、胆囊、乳腺）产生。这些糖蛋白的存在可维持表面的水合状态，并形成抵御病原体的物理屏障。尽管黏蛋白的产生对黏膜健康至关重要，但黏蛋白浓度过高和（或）黏液性质异常可导致导管阻塞、细菌定植及慢性炎症，进而引发不可逆的组织损伤。类似的一系列病理过程可见于多种疾病，例如，囊性纤维化1、慢性中耳炎2和宫颈阴道感染3。因此，理解黏蛋白在健康与疾病中的作用，并建立常规的蛋白质鉴定方案具有重要意义。

迄今为止，已鉴定出19个黏蛋白基因，其编码的多肽链长度范围从1,200（例如，MUC1）至 22,000（例如，MUC16）氨基酸。黏蛋白基因家族可分为两个亚型：膜结合型黏蛋白和凝胶形成型黏蛋白。前者参与细胞信号传导和细胞表面保护，后者则赋予黏液凝胶其黏弹性特性。膜结合型黏蛋白多为单体结构，通过疏水性跨膜结构域锚定于细胞表面。相比之下，凝胶形成型黏蛋白含有多个血管性血友病因子（vWF）样结构域和富含半胱氨酸的结构域，这些结构域对于动态多聚网络的形成至关重要。大量糖链通过丝氨酸和苏氨酸残基连接到载蛋白核心（apomucin）上，这些密集的O-连接寡糖可占分子量的80%4分子内和分子间二硫键连接黏蛋白单体，从而维持黏蛋白凝胶网络的完整性。由于高度糖基化和多聚化，黏蛋白是动物界中分子量最大的分子之一，无法通过常规SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和标准蛋白质ladder进行分析。这些方法仅能分辨分子量低于250 kDa的蛋白质，而黏蛋白单体的分子量可高达2 MDa（如MUC16）。然而，可使用高分子量蛋白质ladder来研究较小的黏蛋白单体（即，MUC1）

可采用多种技术来研究黏蛋白的大小、构象及其相互作用。传统上，黏蛋白的生化表征通常通过在变性缓冲液中进行等密度梯度离心分离黏蛋白，随后结合尺寸排阻色谱及免疫检测（例如，狭缝印迹法）来完成5。动态光散射和/或多角度光散射可提供富含黏蛋白样品的寡聚状态信息1。此外，速率区带离心结合免疫检测和透射电子显微镜技术常用于确定黏蛋白的大分子构象6。质谱技术也可用于黏蛋白的定量、蛋白水解切割位点的检测以及寡糖组成的分析1,7,8。然而，这些技术成本较高、耗时较长，且通常需要大量样品或高浓度样品。本文所述的方法，即，通过电泳分离黏蛋白，具有可重复性强、成本低的优点，可用于高通量研究，实现黏蛋白的相对定量并分析聚合物组装情况。但该检测方法依赖于高亲和力、高特异性的黏蛋白抗体，而这类抗体可能难以获得，尤其针对稀有黏蛋白（例如，MUC19）或某些物种（例如，猪、雪貂）。

琼脂糖印迹法适用于分离多种富含黏蛋白的样品，其浓度范围从50 µg/ml（例如，细胞冲洗液）到5 mg/ml（例如，痰液）。该检测方法于20世纪90年代首次提出，最初仅在少数专业实验室中开展9,10。该技术最初用于鉴定人呼吸道分泌物中黏蛋白单体的不同亚群11,12，并证实了杯状细胞中黏蛋白的寡聚化过程，即在内质网中形成二聚体，随后在高尔基体中进一步多聚化13。近年来，针对小鼠黏蛋白的多克隆抗体的制备推动了小型动物模型的研究（例如，黏蛋白缺陷型、βENaC、OVA激发的小鼠模型），并为旨在清除肺部黏液的药理化合物的临床前研究开辟了新的研究领域14-17。随着对黏蛋白生物学研究兴趣的日益增长以及新型、更特异性黏蛋白抗体的开发，本文详细描述了通过琼脂糖凝胶电泳分离黏蛋白、真空转印至硝酸纤维素膜以及双色红外荧光检测的技术方法。

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方案

1. 准备黏蛋白凝胶 Western 印迹缓冲液

  1. 配制1升50倍浓度的TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液。
    1. 在700 ml去离子水（dH2O）中加入242 g Tris碱（0.4 M）、57.1 g冰乙酸（称量液体）（0.2 M）和14.61 g乙二胺四乙酸（EDTA）（50 mM）。
    2. 调节pH至8.0，并用dH2O定容至1升。
  2. 配制10 ml 10倍浓度的上样缓冲液。
    1. 配制5 ml 1倍浓度的TAE缓冲液。加入5 ml甘油（50%）、25 mg溴酚蓝（0.25%）和100 mg十二烷基硫酸钠（SDS）（1%）。
  3. 配制2升20倍浓度的柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液。
    1. 在1.5升dH2O中加入350.6 g NaCl（3 M）和176.4 g柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）（0.3 M）。调节pH至7.0，并用dH2O定容至2升。
  4. 配制1升含0.1% SDS的1倍TAE缓冲液。
    1. 将20 ml 50倍TAE缓冲液加入980 ml dH2O中。加入1 g SDS，制成含0.1% SDS的TAE溶液。

2. TAE-SDS 琼脂糖凝胶制备

  1. 加入足够体积（即在可微波加热的锥形瓶中加入150 ml 1×TAE-0.1% SDS缓冲液，制备厚度为5–7 mm的凝胶。加入0.8%（1.2 g）琼脂糖粉末。
  2. 以30秒为间隔微波加热，期间间歇性轻轻摇动，直至琼脂糖完全溶解（通常需1 - 3分钟）。操作过程中请使用防热手套。摇动时注意防止暴沸。
  3. 让琼脂糖溶液冷却 5 - 10 分钟。注意：当烧瓶底部可在掌心停留 5 秒时，琼脂糖溶液即已冷却至可倒胶状态。
  4. 使用胶带密封电泳制胶托盘（10 × 15 cm）边缘，并将加样孔梳子置于适当位置。
  5. 将琼脂糖溶液缓慢倒入制胶托盘中，以避免产生气泡。使用移液器吸头去除气泡。静置等待凝胶冷却并完全凝固。待凝固后，缓慢取出梳子，防止因吸力导致加样孔塌陷，并撕去托盘边缘的胶带。
  6. 将琼脂糖凝胶放入凝胶槽中，并加入1x TAE-0.1% SDS缓冲液至完全浸没凝胶。

3. 样品上样与电泳分离

注意：在我们的实验室中，通常使用来自小鼠和人类的样本，包括支气管肺泡灌洗液（BALF；两种物种）、人支气管上皮细胞的细胞洗涤液（HBE），以及人唾液和痰液样本。样本在采集后可立即用6 M尿素进行变性处理，或通过添加蛋白酶抑制剂混合物在短时间内（6小时）保存。 

  1. 通过向每个样品中加入10%的上样染料来制备上样样品（即，30 µl 样品和 3 µl 染料）。通过移液吹打混匀样品。在 5,000 rpm 下短暂离心收集液滴。
  2. 小心地将等体积的样品加入到各孔中。
    1. 预润吸头和/或使用正向置换移液器，以方便加样高黏度样品。缓慢吸取80%–90%的样品-染料溶液（即，27 - 30 µl）以避免移液时产生气泡。
    2. 缓慢将液体加至孔底部，同时逐渐向上移动移液枪头。对于仍附着在移液枪头上的样品，应以45°角排液，并在孔正上方垂直拉长液体以脱离枪头，或轻轻借助孔壁刮断丝状黏液。切勿过量加样至孔中。
  3. 将电泳槽的电极连接至电泳电源。确保电极正确连接（即，红电极连接至发生器的正极输出端，以使带负电荷的黏蛋白向正极移动。
  4. 单梳胶以80伏电压电泳90分钟，双梳胶以80伏电压电泳60至75分钟，以防止两排泳带之间发生重叠。
  5. 关闭发生器电源，并将电极从电源断开。
  6. 用一只手扶住制胶板的一侧，另一只手扶住另一侧，小心地将凝胶从电泳槽中取出，以确保凝胶保持原位。

4. 降低琼脂糖凝胶浓度以实现高效的黏蛋白转印

  1. 将凝胶小心地平放在玻璃容器中，用去离子水（dH2O）冲洗，以去除残留的TAE-SDS缓冲液。
  2. 通过将200 ml的20x SSC缓冲液加入800 ml的dH2O中，配制1升4x SSC缓冲液。将309 mg新鲜的二硫苏糖醇（DTT）加入200 ml的4x SSC缓冲液中，配制成200 ml含10 mM DTT的4x SSC溶液。
  3. 用含DTT的4x SSC缓冲液浸泡凝胶并覆盖容器，轻轻摇动20分钟（每分钟10次旋转）。随后用不含DTT的4x SSC缓冲液冲洗凝胶。

5. 真空印迹装置的组装及样品向硝酸纤维素膜的转移

  1. 准备用于转印的真空印迹装置。
    1. 小心地将硝酸纤维素膜裁剪成比凝胶略宽的尺寸（即，10 × 15 厘米。
    2. 用去离子水润湿多孔垫2O，并将其光滑面朝上放入吸水纸中。
    3. 用不含DTT的4×SSC缓冲液润湿硝酸纤维素膜，并将其置于多孔垫的中央。
    4. 用橡胶垫圈覆盖多孔垫，确保垫圈的开口与硝酸纤维素膜精确对齐。若仍可见多孔垫，需仔细调整膜的位置，确保垫圈与膜之间无任何间隙。
  2. 将琼脂糖凝胶小心地放置在膜上，确保凝胶与垫圈之间形成紧密的密封，且凝胶的加样孔对准膜上的相应位置以进行转印。
    1. 避免膜与凝胶之间产生气泡。为尽量减少气泡形成，可在膜上滴加数滴4x SSC缓冲液，然后从顶部到底部轻轻移动凝胶，以排出已形成的气泡。切勿在膜上移动凝胶，因为蛋白质会立即开始转印。
  3. 用 4x SSC 缓冲液小心覆盖凝胶。
  4. 通过吸力开始黏蛋白转移。
    1. 打开真空印迹仪，将压力调至40–50 mBar。每5–10分钟在凝胶上加入几滴4x SSC缓冲液，以防止凝胶干燥。转移运行90分钟。可选步骤：转移完成后，用铅笔标记加样孔位置以确定方向。
  5. 使用塑料镊子夹取凝胶边缘的硝酸纤维素膜，并弃去凝胶。

6. 膜封闭与检测

  1. 立即用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗膜，切勿让膜干燥。
  2. 将膜浸入 50 ml 的 3% 脱脂牛奶-PBS 封闭缓冲液中，于室温在摇床上孵育 1 小时。孵育结束后，弃去封闭缓冲液。
  3. 将膜浸入 1% 脱脂牛奶-PBS 一抗溶液中，在 4 °C 下于摇床上过夜孵育。孵育结束后，弃去一抗溶液。将一抗按 1:2,000 的比例用封闭缓冲液稀释。注意：对于来自小鼠的样品，我们使用 UNC 222 兔抗 Muc5b 和山羊抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体；对于来自人类的样品，我们使用 H300 抗 MUC5B 和 45M1 抗 MUC5AC 一抗。
  4. 在摇床上用 PBS 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
  5. 将膜浸入 1% 脱脂牛奶-PBS 二抗溶液中，将二抗按 1:7,500 的比例用封闭缓冲液稀释（例如，700 抗兔和 680 抗山羊），于室温在摇床上孵育 1 小时。使用不透明容器避光孵育。1 小时后弃去二抗溶液。
  6. 在摇床上用 PBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。用 dH2O 冲洗膜以去除盐分。
  7. 根据制造商说明，使用红外荧光系统读取膜信号。

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结果

我们展示了对小鼠肺部支气管肺泡灌洗液（BALF）进行琼脂糖凝胶电泳后黏蛋白表达的代表性结果（图1）。在本示例中，我们使用琼脂糖凝胶显示了在Tg-Muc5ac小鼠模型中经IL-13处理后黏蛋白生成的上调。Western印迹提供了黏蛋白表达的可视化图谱，可用于多聚体或单体条带信号强度的定量分析（图2）。该方法也可用于检测人支气管上皮（HBE）细胞冲洗液及人痰液样本中黏蛋白的表达。此外，该方法可用于显示经还原剂处理后黏蛋白表达的减少。我们展示了用递增浓度DTT处理的HBE冲洗液的代表性结果（图3）。我们对使用还原剂处理导致黏蛋白还原后多聚体信号强度的降低进行了定量分析（图4）。

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讨论

本视频中描述的黏蛋白Western印迹实验方案，结合了分子生物学中用于分离和转移DNA等大分子的常规技术，以及常规的蛋白质检测技术。 即，免疫印迹。该技术也可用于研究复杂糖胺聚糖的生物学特性，例如高分子量透明质酸的降解18尽管该技术可广泛应用于多种检测，但成功的琼脂糖Western印迹依赖于多个步骤，这些步骤需要细致且严格把握时间的操作。为了最大限度地提高成功率，应重点关注一些关键步骤。

样品制备与凝胶上样是获得准确结果的关键步骤。富含黏蛋白的样品， 即，痰液具有天然黏附实验管道的特性， 即，移液器吸头，离心管，滤器。使用正向置换移液器并预先润湿移液器吸头有助于将粘弹性材料加样至孔中。由于此类样品具有较高的浮力和黏附性，操作时需特别注意。浓度过高的样品（高于5 mg/ml）在0.8%琼脂糖凝胶的孔径中迁移效果较差，可能需要进一步稀释和/或在最高6 M尿素中进行变性处理。然而，应避免上样经盐酸胍（GuHCl）变性的样品，因为胍离子会与SDS发生沉淀。因此，保存在GuHCl中的样品需额外进行透析步骤。对于非聚合...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 John Sheehan 博士和 Lubna Abdullah 博士在本研究完成过程中所提供的指导与 mentorship。本研究得到了美国国立卫生研究院（P01HL108808，UH2HL123645）和囊性纤维化基金会治疗公司（EHRE07XX0）的资金支持。Kathryn Ramsey 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）早期职业研究人员奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris 碱SigmaT6060-1kg1 kg
冰醋酸SigmaARK2183-1L1 L
EDTASigmaEDS-100g100 g
甘油FisherBP229-11 L
溴酚蓝Sigma114391-5g5 g
SDS（十二烷基硫酸钠）SigmaL6026-50g50 g
20× SSC（柠檬酸钠-氯化钠）缓冲液PromegaV42611 L
NaClFisherS271-11 kg
柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）SigmaW302600-1kg1 kg
10 mM DTT（二硫苏糖醇） SigmaD063225 g
奶粉Saco速溶脱脂奶粉
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）Gibco lifetechnologies14200-025500 ml
抗-GFP 山羊一抗（小鼠样本）Rockland antibodies and assays600-101-2151 mg
UNC 222 抗-Muc5b 兔一抗（小鼠样本）UNC
H300 抗-MUC5B 一抗（人样本）Santa Cruzsc-20119200 μg
45M1 抗-MUC5AC 一抗（人样本）Abcamab3649100 μg
驴抗兔 800CW 红外染料LI-COR Biosciences926-322130.5 mg
驴抗鼠 680LT 红外染料LI-COR Biosciences926-680220.5 mg
电泳凝胶槽及制胶托盘Owl Seperation Systems
电源装置BioradModel 200/20
膜转移滤纸Amersham 10600016 
Whatman 滤纸和硝酸纤维素膜 GE 10 439 196
Boekel/Appligene 真空印迹仪 230 vExpotech USA230600-2
Odyssey 红外荧光成像系统LI-COR Biosciences

参考文献

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