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方法文章

清醒大鼠无线视网膜电图和视觉诱发电位的植入与记录

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DOI：

10.3791/54160

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2016年6月29日

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1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

本文内容

摘要

我们展示了在清醒大鼠中进行手术植入和记录程序，以测量来自眼睛（视网膜电图）和大脑（视觉诱发电位）的视觉电生理信号，该方法更接近人类情况，因为记录过程无需麻醉，避免了麻醉带来的干扰。

摘要

全视野视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）是评估实验室和临床环境中视网膜及视觉通路完整性的有效工具。目前，临床前的ERG和VEP测量通常在麻醉状态下进行，以确保电极位置的稳定。然而，麻醉本身已被证明会干扰正常的生理反应。为克服麻醉带来的混杂因素，我们开发了一种新型平台，用于在清醒大鼠中检测ERG和VEP。电极通过手术植入眼结膜下以记录ERG信号，并在视觉皮层表面硬膜外植入以测量VEP。在光能逐渐增加的条件下，对ERG和VEP的振幅以及敏感性/时间参数进行了多项检测。结果显示，术后至少4周内，ERG和VEP信号均保持稳定且可重复。这种在临床前环境中无需麻醉即可记录ERG和VEP信号的能力，将有助于更准确地向临床数据转化。

引言

视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）是实验室和临床中用于分别评估视网膜和视觉通路完整性的微创体内检测工具。全视野ERG产生一种特征性波形，可分解为不同组分，每个组分代表视网膜通路中的不同细胞类型1,2。经典的全视野ERG波形包括一个初始的负向波（a波），该波已被证实反映光刺激后光感受器的活动2-4。a波之后是一个显著的正向波形（b波），代表中层视网膜的电活动，主要来源于ON双极细胞5-7。此外，通过调节光刺激强度和刺激间间隔，可分离出视锥细胞和视杆细胞的反应8。

闪光VEP代表视觉皮层和脑干对视网膜光刺激产生的电位反应9,10。该波形可分为早期和晚期成分，其中早期成分反映视网膜-外侧膝状体-视皮层通路神经元的活动11-13，而晚期成分则代表大鼠V1皮层不同层状结构中的皮层信息处理过程11,13。因此，同时测量ERG和VEP可对视觉通路中相关结构进行综合评估。

目前，为了在动物体内记录电生理信号，通常使用麻醉方法以确保电极的稳定放置。尽管已有研究尝试在清醒大鼠中测量视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）14-16，但这些研究采用的是有线装置，可能操作繁琐，并因限制动物活动和自然行为而引发动物应激反应17。随着无线技术的最新进展，包括设备进一步微型化和电池寿命的提升，现已可采用遥测技术进行ERG和VEP记录，从而减少有线记录带来的应激，并提高长期记录的可行性。全植入式遥测探针的稳定植入已被证实可用于体温、血压18、活动度19以及脑电图20的长期监测。此类技术进步也将有助于提高清醒状态下记录的可重复性和稳定性，增强该平台在慢性研究中的应用价值。

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方案

伦理声明：动物实验严格遵循《澳大利亚科学研究用动物护理与使用指南》（2013年版）的规定进行。本研究已获得墨尔本大学动物伦理委员会的动物伦理审批。 本文所述材料仅限用于实验室实验，不得用于医疗或兽医用途。

1. 准备电极

注意：手术植入时使用三通道发射器，可同时进行2个ERG和1个VEP记录。三个主动电极和三个被动电极在植入前需预先弯成环形，以便附着于眼球。为便于识别，制造商将主动电极封装在半白色、半彩色的塑料套管中，而被动电极则完全包裹在彩色套管中。接地电极（透明塑料套管）保持原样不变。所有主动电极和被动电极均需执行步骤1.1、1.2、1.3和1.7。

  1. 使用两个尖头镊子将双股不锈钢电极拧开。
  2. 剪去其中一根不锈钢丝（距尖端约 1 cm），保留一根较长的直丝用于制作环形电极。
  3. 将单根不锈钢丝向自身方向弯折并扭绞，在电极尖端形成一个光滑的环。
  4. 对于视网膜电图（ERG）的活性电极，通过扭绞环的基部将其制成直径约 0.2 - 0.5 mm 的环形（根据此处所述目的，制作两个这样的活性电极以记录双眼的ERG）；对于ERG的非活性电极和视觉诱发电位（VEP）电极，则将环的直径制成约 0.8 mm（在本示例中，为一个VEP活性电极和全部三个非活性电极进行此操作）。
  5. 将环状VEP活性电极钩在一个不锈钢螺钉（直径 0.7 mm，长度 3 mm）上，使电极紧贴螺钉头部。
  6. 将3个非活性电极（2个ERG，1个VEP）钩在第二个不锈钢螺钉（直径 0.7 mm，长度 3 mm）上。
  7. 将塑料套管向前推，覆盖住两根不锈钢丝的尖锐末端，以减少刺激。
  8. 将遥测发射器在2%戊二醛溶液中浸泡超过10小时（温度约为25 °C）进行灭菌，然后用无菌生理盐水冲洗发射器3次。

2. 发射器植入

  1. 动物准备
    1. 实验前用70%乙醇清洁手术区域以消毒 。所有手术器械使用前需高压灭菌，并在手术过程中不使用时置于氯己定中保存。手术期间用手术巾覆盖动物以维持无菌环境。确保所有操作人员佩戴外科口罩、无菌 手套和手术服。
    2. 以3 L/min的气流诱导1.5–2%异氟烷麻醉，并在手术期间以2 L/min维持1.5–2%的麻醉浓度。通过夹捏脚趾间肌肉无足底反射来确认麻醉深度足够。
    3. 剃除腹部从腹股沟上方至胸骨区域约40 mm × 30 mm的毛发。
    4. 剃除前额区域（眼睛后方至耳前方）约30 mm × 20 mm的毛发。
    5. 对上述两个剃毛区域进行消毒。前额区域使用10%聚维酮碘消毒三次（避免在眼部附近使用含酒精的消毒剂，应符合手术技术人员协会规定的操作标准）。腹部区域使用10%聚维酮碘和70%乙醇消毒。
    6. 在角膜上滴加1滴丙氧卡因以提供额外的局部麻醉。
    7. 在角膜上滴加1滴羧甲基纤维素钠以防止眼睛干燥。
  2. 手术植入
    1. 使用手术刀在两耳之间的头部正中垂直线上做一道10 mm切口。
    2. 在胸骨下方腹中线处通过皮肤层做一道5 mm切口。
    3. 从腹部切口至头部切口皮下穿通一根直径5 mm的套管。
    4. 将发射器的电极导线（3根主动电极和3根非活性电极）经套管从腹部穿至头部。
    5. 将参考电极留在发射器基座处，并用电极尖端覆盖无菌纱布。
    6. 用电极尖端（3根主动电极和3根非活性电极）覆盖无菌纱布。
    7. 将大鼠头部固定于立体定位仪平台上。
    8. 用手术剪将前额切口延长至30 mm。
    9. 使用两根缝线（3-0）在约3点和9点位置牵拉松动皮肤以暴露手术区域。
    10. 用灭菌纱布刮除颅骨表面的骨膜，暴露前囟、后囟及中线缝合线。
    11. 在VEP主动电极（前囟腹侧7 mm，中线外侧3 mm）和非活性电极（前囟头侧5 mm，中线上）的立体定位坐标处钻穿颅骨两个小孔。
    12. 使用小螺丝刀将预装不锈钢螺丝（直径0.7 mm，长度3 mm）的VEP主动和非活性电极固定于颅骨预制孔中，深度约1 mm。此操作可将螺丝锚定于骨组织而不损伤下方皮层组织。
    13. 为植入ERG主动电极，使用8-0缝线暂时牵拉上眼睑。
    14. 从眼球后方经皮下插入16至21 G套管至上方结膜穹窿。
    15. 移除引导针。
    16. 将主动电极经前额处缩短的塑料导管向眼部方向穿入，随后移除塑料导管。
    17. 使用一根穿过电极环的临时缝线（8-0）防止电极回缩至隧道内。
    18. 在12点方向、角膜缘后方1 mm处的上方结膜做0.5 mm切口。采用钝性分离暴露下方巩膜。
    19. 在角膜缘后方立即植入一根8-0或9-0缝线，深度为半层巩膜厚度。
    20. 移除ERG主动电极上的临时缝线。
    21. 通过打三个连续结将ERG主动电极固定于半层巩膜厚度的缝线上，确保电极尖端靠近角膜缘。
    22. 使用1至2个间断缝合（8-0至9-0）关闭结膜瓣。确保结膜完全覆盖ERG电极以提高舒适度。
    23. 移除眼睑牵开缝线。
    24. 对对侧眼重复上述操作。
    25. 在颅骨上涂抹氰基丙烯酸酯凝胶以固定所有不锈钢螺丝和电极导线。固定前确保ERG主动电极不过紧，以便眼球可自由活动。
    26. 使用不可吸收的3-0缝线关闭头部切口。
    27. 旋转啮齿动物以暴露腹部区域。用手术剪沿腹白线将腹部皮肤切口延长至40 mm。
    28. 通过内层肌肉壁做35 mm切口以暴露腹腔内部。
    29. 使用两根缝线（3-0）将发射器本体固定于动物右侧腹内壁。避免接触肝脏。
    30. 将接地电极弯成环状，并用缝线（3-0）固定此形状，将其自由悬浮置于腹腔内。
    31. 使用连续缝合（3-0）关闭腹膜。
    32. 使用间断缝合（3-0）关闭皮肤切口。
  3. 术后护理
    1. 持续监测动物直至其恢复足够意识以维持胸卧位。术后单独饲养动物。
    2. 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）用于镇痛，每日一次，连续4天。
    3. 术后7天内在饮水中添加预防性口服抗生素（恩诺沙星，5 mg/kg）。
    4. 术后前7天在皮肤切口处涂抹抗炎软膏以减少刺激。

3. 在清醒大鼠中进行ERG和VEP记录 

  1. 在进行ERG和VEP记录前，将动物暗适应12小时
  2. 所有实验操作均在微弱红光照明下进行（17.4 cd·m-2，λmax = 600 nm）
  3. 向角膜表面滴加局部麻醉剂（0.5%丙美卡因）和散瞳剂（0.5%托吡卡胺）
  4. 将清醒的大鼠引导进入定制的透明固定装置。
    注意：该塑料管的长度可调节，以适应不同体型的大鼠，其整体直径固定为60 mm。装置前端呈锥形，以减少头部移动，并设有穿孔以保证正常呼吸。此锥形前端有助于将大鼠头部和眼睛与全视野球的开口对齐并保持稳定。请注意，大鼠在手术前已对固定装置进行过适应性训练（3至5次）。
  5. 将大鼠置于全视野碗前方，使眼睛与碗的开口对齐。
  6. 通过将磁铁靠近发射器约5 cm处，开启植入式发射器。通过检查接收器底座上的LED状态灯，确认发射器已开启。
  7. 按照先前所述方法21，采集一系列光能水平（即 -5.6 至 1.52 log cd·s·m-2）下的信号。简而言之，在较弱光强下采集更多平均信号（约80次重复），在较强光强下采集较少重复次数（约1次重复）。从最弱到最强光强，逐渐延长刺激间间隔，从1秒增至180秒。
  8. 为分离ERG的视杆细胞和视锥细胞反应，采用双闪光范式8。例如，在1.52 log cd·s·m-2光强下，以500毫秒的刺激间间隔连续施加两次闪光刺激。
  9. 记录VEP信号时，在较强光能条件下（即 1.52 log cd·s·m-2，刺激间间隔5秒）平均采集20次重复信号。
  10. 为评估植入物的稳定性（通过随时间变化的信号变异性进行评估），在术后第7、10、14、21和28天进行ERG和VEP记录。
  11. 实验结束后，在氯胺酮：赛拉嗪麻醉（12:1 mg/kg）基础上，通过心脏内注射戊巴比妥（1.5 ml/kg）处死大鼠。

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结果

基于 Lamb 和 Pugh22 的模型，并依据 Hood 和 Birch23 的公式化方法，通过将延迟高斯函数拟合到每只动物在最高两种光能（1.20、1.52 log c.s.m-2）下 ERG 反应初始下降支前沿，来分析光感受器反应。该公式可得出振幅和敏感度参数（分别为图 1C 和1D）。对每只动物的视杆双极细胞光能反应拟合双曲线函数，同样获得振幅和敏感度参数（分别为图 1E 和1F）。视锥双极细胞的振幅分析为波形的峰值反应（图 1A 和1B 的上方波形），其潜伏期定义为达到峰值反应所需的时间。更多细节请参见 Charng et al.24。

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讨论

由于视觉电生理学具有微创性，对人类患者的ERG和VEP记录通常在清醒状态下进行，仅需使用局部麻醉剂以放置电极。相比之下，动物模型中的视觉电生理学通常在全身麻醉下进行，以通过消除自主的眼球和身体运动来实现稳定的电极放置。然而，常用的全身麻醉剂会改变ERG和VEP反应，这一点已在我们先前的研究24及其他研究者的工作25-27中得到证实。因此，在啮齿类动物模型中建立清醒状态下的ERG和VEP检测平台，能够更准确地反映动物模型中的生理反应，从而可能提高从临床前研究到临床发现的可转化性。使用麻醉的另一个缺点是其限制了实验的持续时间。更具体地说，长时间使用麻醉或反复给予麻醉药物可能增加不良反应的风险，例如药物蓄积及相关呼吸系统问题28。

本研究表明，在清醒大鼠中，遥测系统在术后至少28天内能够稳定地记录到可靠的ERG和VEP信号。我们团队是首个同时开展清醒状态下无线ERG和VEP反应研究的团队24，本文详细描述了相关的手术及记录流程。与其他采用有线方式在清醒动物中进行ERG和VEP记录的手术方法相比，本方法...

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披露

RG 和 RF 是本研究商业资助方（辉瑞Neusentis和辉瑞全球研究）的雇员。MI 在本研究期间是辉瑞全球研究的雇员，目前为Proteostasis Therapeutics（美国马萨诸塞州剑桥）的雇员。

致谢

JC 感谢 David Hay 纪念基金和墨尔本大学为撰写本稿件提供的经费支持。本项目获得了澳大利亚研究委员会（ARC）合作项目资助 100200129（BVB、AJV、CTON）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物放大器ADInstrumentsML 135放大ERG和VEP信号
1.0%羧甲基纤维素钠AllerganCAS 0009000-11-7手术期间维持角膜水合状态
卡洛芬 0.5%Pfizer Animal Health GroupCAS 53716-49-7术后镇痛，与生理盐水注射液联合使用以补充体液
0.5%氯己定Orion Laboratories27411, 80085手术器械消毒
氰基丙烯酸酯凝胶活化剂RS components473-439快速干燥氰基丙烯酸酯凝胶
氰基丙烯酸酯凝胶 RS components473-423将不锈钢螺钉固定于颅骨
牙科钻头Storz Instruments, Bausch and LombE0824A直径约0.7 mm的微型钻头，用于在每个半球颅骨上钻小孔以植入VEP螺钉
钻机BoschDremel 300系列用于颅骨钻孔的自动钻机
恩诺沙星Troy Laboratories术后预防性抗生素
全视野积分球Photometric Solutions International定制设计的光刺激器：直径36 mm，孔径大小13 cm
纱布拭子Multigate Medical Products Pty Ltd57-100B手术期间干燥手术切口及暴露的颅骨表面
异氟烷 99.9%Abbott Australia Pty LtdCAS 26675-46-7商品名：Isoflo(TM) 吸入麻醉剂。与氧气混合使用的药用级吸入麻醉剂，用于VEP电极植入手术
Kenacomb软膏Aspen Pharma Pty Ltd术后减轻皮肤刺激和瘙痒
Luxeon LED灯Phillips Lighting Co.用于光刺激，包含二十个5 W和一个1 W LED灯，由Scope软件控制
缝合针（大体手术）World Precision Instruments501959用于腹部和头部手术缝合，配合3-0缝线使用，圆针，刃口为5/16圆，尺寸1，长15 mm
持针器（大体手术）World Precision Instruments500224在腹部和头部手术中夹持缝合针
持针器（显微手术）World Precision Instruments555419NT在眼部手术中夹持缝合针
Optiva导管Smiths Medical International LTD16或21 G引导角膜活性电极从颅骨至结膜
10%聚维酮碘Sanofi-AventisCAS 25655-41-8商品名：Betadine，用于术前备皮的皮肤消毒剂，浓度10%，500 ml
Powerlab数据采集系统ADInstrumentsML 785从遥测发射器获取信号，并与遥测数据转换器配对
丙美卡因 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9局部眼部麻醉
固定装置定制制作固定装置前端呈锥形以减少头部移动，长度可调以适应不同体长的大鼠，整体直径为60 mm。 
手术刀片R.G. Medical SuppliesSNSM0206用于手术切口
剪刀（大体手术）World Precision Instruments501225用于切割腹部和前额组织
剪刀（显微手术）World Precision Instruments501232用于分离结膜以便电极附着
Scope软件ADInstruments版本 3.7.6通过ADI Powerlab系统同步触发刺激并采集数据
剃毛器OsterGolden A5剃除手术区域的毛发
不锈钢螺钉 MicroFastenersL001.003CS304轴径0.7 mm，长度3 mm 
立体定位仪David KopfModel 900用于在颅骨上定位植入标志点的小动物立体定位仪器
手术单Vital Medical SuppliesGM29-612EE确保手术期间的无菌环境
缝线（大体手术）Ninbo medical needles3-0用于腹部和头部手术缝合，无菌编织丝线，长60 cm
缝合针（显微手术）Ninbo medical needles8-0或9-0用于眼部手术，包括将电极缝合至巩膜及闭合结膜伤口，尼龙缝线，3/8圆，1 × 5，长30 cm
遥测数据转换器 DataSciences InternationalR08使遥测信号能够与数据采集软件连接
遥测数据交换矩阵DataSciences International从发射器收集数据，并与接收器配对
遥测数据接收器DataSciences InternationalRPC-1接收来自发射器的遥测数据
遥测发射器DataSciences InternationalF50-EEE三通道遥测发射器
托吡卡胺 0.5%Alcon Laboratories 散瞳
镊子（大体手术）World Precision Instruments500092在腹部和头部手术中操作组织
镊子（显微手术）World Precision Instruments500342在眼部手术中操作组织

参考文献

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