改进的肠道组织包埋卷制技术用于免疫组织化学和免疫荧光分析

摘要

准确识别和定位沿肠黏膜上皮的上皮细胞对于定义不同细胞谱系至关重要。对肠组织进行适当的成像对于以最高分辨率识别蛋白质表达模式具有关键作用。本研究旨在阐明小鼠肠组织处理的最佳方法和条件。

摘要

了解调控肠道上皮稳态及其对损伤与再生反应的因素具有重要意义。现有文献描述了多种获取肠道组织图像以进行数据验证的方法学途径。本文阐述了一种关于小鼠肠道组织获取与处理的通用实验方案。文中讨论了肠道组织的适当固定方法以及可增强肠道上皮形态学特征的瑞士卷（Swiss-roll）技术。切除后对包埋肠道组织的处理与重新定向，对于获得切片后仍能显示完整肠道结构特征的石蜡包埋块至关重要。瑞士卷技术有助于对整个肠道或结肠切片进行全面的组织学评估。能够区分肠道结构特征对于沿肠道全长进行炎症和肿瘤发生的定量测量至关重要。最后，石蜡包埋切片适用于免疫组织化学和免疫荧光检测方法的稳定处理。非荧光免疫组织化学切片可提供清晰的组织图像，详细展示不同细胞结构特征，但无法灵活用于细胞内共定位实验。而免疫荧光检测则可合理利用多个荧光通道进行共定位实验，从而支持机制性研究。

引言

哺乳动物的肠上皮由单层柱状细胞构成。在小肠中，增殖细胞局限于隐窝内，而分化细胞则位于绒毛区域。然而，由于大肠中不存在绒毛，增殖细胞定位于隐窝底部，分化细胞则占据隐窝的上部区域。肠上皮更新迅速（约3–5天），这一过程由隐窝内增殖细胞的持续分裂所驱动。隐窝中的增殖细胞并非均一的群体，可进一步分为干细胞和过渡扩增（TA）细胞¹。干细胞位于隐窝底部，处于最底端起始的前4–5个细胞位置²。目前的研究模型支持存在两类干细胞：隐窝基底部柱状（CBC）干细胞和静息型储备干细胞。CBC干细胞具有活跃的增殖活性，其标志分子包括富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）³、嗅觉素4（Olfm4）⁴和achaete scute样2（Ascl2）⁵。另一方面，静息型储备干细胞的标志物包括B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1（Bmi1）⁶、小鼠端粒酶逆转录酶（mTert）⁷、HOP同源盒（Hopx）⁸、双皮质素样及钙调蛋白激酶样1（Dclk1）⁹以及富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域蛋白1（Lrig1）¹⁰。活跃增殖的干细胞产生TA细胞，随后进一步分化为吸收细胞（肠上皮细胞）和分泌细胞（肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和簇细胞）。增殖区持续的细胞分裂导致上皮细胞沿隐窝-绒毛轴向上迁移，直至到达绒毛顶端，在此经历凋亡并从上皮表面脱落。不同类型的肠上皮细胞可通过表达特定蛋白加以识别（例如，肠杯状细胞可通过抗Muc2抗体染色识别，潘氏细胞则可通过抗溶菌酶抗体染色识别）。我们研究Krüppel样因子（KLFs）在肠上皮稳态及其病理生物学中的作用^11–13。本文所展示的支持改良瑞士卷技术可行性的结果，基于先前关于Krüppel样因子5（KLF5）在维持活跃增殖的肠上皮干细胞功能中作用的研究¹⁴。KLF5是一种锌指转录因子，在活跃的肠干细胞和TA细胞中高表达¹²。先前研究表明，KLF5与Ki-67共表达，后者是肠隐窝中公认的增殖标志物。

胃肠道并非结构或功能均一的组织。小肠分为十二指肠、空肠和回肠，大肠则分为盲肠和结肠，其中结肠又进一步分为近端、中段和远端部分。这些不同区段具有独特的组织学特征，并发挥不同的功能作用¹⁵。因此，损伤所造成的影响以及肠上皮反应的程度可能取决于所研究组织的特定区域¹⁶。此外，不同品系的小鼠在组织学水平上对不同类型损伤刺激的反应也表现出差异¹⁶。因此，恰当的组织制备方法对于开展准确的组织学和分子分析至关重要。瑞士卷技术（Swiss-roll technique）能够一次性分析肠上皮的完整长度，从而基于全面的信息得出可靠结论。

瑞士卷技术最初由 Magnus 提出¹⁷，由 Moolenbeck 和 Ruitenberg 以及 Park 详细描述 等 作为制备组织及对啮齿类动物肠道进行组织学分析的方法^18,19分别。本文所述方案是对原始方法的改进版本，可及时且可靠地进行组织制备，用于诊断目的。该改良技术能够高效地收集和制备肠道上皮组织，适用于免疫组织化学、免疫荧光等广泛应用的技术，以及 原位 杂交（荧光和显色）²⁰此外，这种改良的组织标本制备方法使用易于获取且相对廉价的试剂，可实现组织的快速固定，并允许回收蛋白质、DNA和RNA用于进一步分析。综上所述，该技术非常适用于对肠上皮的组织病理学、病理学及分子特征进行全面评估。

方案

1. 小鼠

1. 所有涉及小鼠的研究均经石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下。
   1. 购买C57BL/6小鼠。获取携带两侧由loxP位点包围的Klf5等位基因的C57BL/6小鼠（Klf5^fl/fl）。这些小鼠此前已有描述²¹，并由Dr. Ryozo Nagai慷慨提供。
2. 购买在Lgr5启动子调控下携带可诱导Cre重组酶基因的C57BL/6小鼠（Lgr5-EGFP/CreERT2小鼠）。
3. 为建立Lgr5-EGFP/CreER^T2/Klf5^fl/fl 小鼠，将Klf5^fl/fl 小鼠与Lgr5-EGFP/CreER^T2小鼠杂交，然后将后代回交至Klf5^fl/fl 小鼠。
4. 按照先前描述的方案²²用他莫昔芬处理小鼠。对8周龄的实验组和对照组小鼠腹腔注射（I.P.）1 mg他莫昔芬（10 mg/ml），溶于无菌玉米油中，连续注射5天。
5. 首次注射他莫昔芬后的第14天，将小鼠置于连接CO₂气源的密闭室中，通过CO₂窒息法处死。让气体流入密闭室，直至小鼠失去意识且所有活动停止。为确保安乐死，实施颈椎脱位。

2. 组织制备与瑞士卷法

1. 使用解剖镊和剪刀，在腹部侧面的皮肤上剪开一个切口。用一对镊子夹住切口处的皮肤，并轻轻将其从腹肌组织上拉开。使用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹肌。
2. 用镊子夹住并提起腹膜，注意不要夹住或牵拉肠道。小心地在腹膜组织上做切口，并继续剪开皮肤以暴露腹肌。再小心地在腹肌上做切口，并继续剪开腹肌以暴露肠道。
3. 识别结肠，并沿其向远端追踪至与直肠/肛门连接处。用剪刀尽可能靠近肛门开口处进行剪切。
4. 识别胃部，并追踪其与小肠连接的位置。用剪刀在距离胃约1 cm处剪断小肠。将游离出的整段小肠和结肠转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的洁净培养皿中。
5. 用一只手或一对镊子夹住结肠的远端，另一只手轻轻将结肠全长从任何肠系膜结缔组织和/或脂肪组织中展开。
6. 识别盲肠（位于小肠与大肠之间的细小囊状结构），并在盲肠与结肠连接处（即结肠近端）剪断，以游离结肠。
7. 用一只手或一对镊子夹住小肠，另一只手轻轻将小肠全长从任何肠系膜结缔组织和/或脂肪组织中展开。剪除盲肠并丢弃（如无需保留）。
   注意：可通过将解剖出的肠道在改良Bouin固定液（50%乙醇/5%乙酸溶于dH₂O）中过夜固定，暂停操作，次日继续后续步骤。
8. 取一段肠道（小肠或结肠），用10 ml注射器吸取改良Bouin固定液，并连接灌胃针。将针头插入肠段前端开口约0.5厘米处。
9. 用器械对肠段施加稳固压力，以固定灌胃针于肠段内部。另一只手握住注射器，施加轻柔但持续的压力，用改良Bouin固定液冲洗肠段内容物。此步骤可同时完成肠段清洗与即时固定。使用培养皿收集冲洗流出的废液。可通过结肠颜色变为不透明来观察固定效果。
   注意：冲洗时切勿施加过大压力，以免肠段破裂。
10. 使用剪刀沿肠系膜缘纵向剪开肠段。用镊子夹住组织，在含有PBS的培养皿中短暂冲洗。
    1. 将小肠切成三个等长段：近端、中段和远端。近端段紧接胃部，远端段紧邻结肠。近端段相当于十二指肠，中段相当于空肠，远端段相当于回肠。
    2. 对每一段标记其近端和远端。近端为原本朝向胃的一端，远端为朝向结肠的一端。
11. 使用培养皿盖放置已清洗并展开的肠段，使肠腔面朝上。
    1. 对于结肠，可通过其宽度方向上的条纹/皱褶识别肠腔面，这些特征在近端较为明显；中段和远端区域则存在一些纵向条纹。对于小肠，可通过表面粗糙的区域识别肠腔面，该区域即为绒毛所在处。
       注意：小肠在宏观上无明显的外部解剖标志区分近端、中段和远端。但这些区域可在显微镜下切片中识别：绒毛在近端最长，向远端逐渐变短，在远端最短。显微镜下，结肠隐窝在近端最短，可通过皱褶的存在加以识别；隐窝在中段最高，在远端较短但仍高于近端。
12. 进行结肠的瑞士卷（Swiss roll）处理：
    1. 保持结肠平展打开状态，用镊子从其近端向培养皿边缘轻轻拉直。
    2. 保持肠腔面朝上，一只手用镊子夹住近端，另一只手持牙签。
    3. 用镊子将近端边缘缠绕在牙签上，并轻轻捏紧缠绕部分，使其固定在牙签上。
    4. 用手指缓慢而轻柔地开始滚动牙签，将结肠卷成瑞士卷状。
    5. 当整段结肠完全卷好后，用镊子小心地将结肠瑞士卷从牙签上滑下，放入组织处理/包埋盒中。将包埋盒置于10%缓冲福尔马林中，室温下固定过夜。
13. 进行小肠的瑞士卷处理：
    1. 每次处理一段，保持该段平展打开，肠腔面朝上，用镊子从其近端向培养皿边缘轻轻拉直。
    2. 按照结肠的瑞士卷方法进行操作。
14. 对福尔马林固定的组织进行后续处理，用于石蜡包埋。操作步骤如下：
    注意：使用自动组织处理仪（详见材料与设备部分）。
    1. 组织仍在包埋盒中时，用PBS冲洗组织，直至完全去除固定液。
    2. 使用乙醇进行脱水，顺序如下：50%乙醇10分钟，70%乙醇10分钟，80%乙醇10分钟，95%乙醇10分钟，100%乙醇10分钟，100%乙醇10分钟，100%乙醇10分钟。
    3. 用二甲苯逐步置换乙醇，顺序如下：2:1乙醇:二甲苯10–15分钟，1:1乙醇:二甲苯10–15分钟，1:2乙醇:二甲苯10–15分钟，100%二甲苯10–15分钟，100%二甲苯10–15分钟，100%二甲苯10–15分钟。警告：二甲苯具有健康危害，工作场所应配备带适当通风罩的局部排风系统，操作人员应穿戴适当的防护装备。
    4. 用石蜡置换二甲苯。在设定为54–58 °C的真空烘箱中进行以下步骤：2:1二甲苯:石蜡30分钟，1:1二甲苯:石蜡30分钟，1:2二甲苯:石蜡30分钟，100%石蜡1–2小时，100%石蜡1–2小时或过夜。
       注意：切勿让石蜡长时间超过60 °C，否则会导致石蜡聚合物降解，使其变硬变脆。
    5. 在新鲜石蜡中包埋，并在石蜡凝固前按所需方向调整组织位置。对于瑞士卷样本，在完成石蜡浸润后，包埋时应将每个卷状样本侧放。这可确保在切片时获得每个卷的全长横截面。
15. 染色时，使用切片机切取5-μm厚的切片。将切片收集于带电荷的载玻片上，并在65 °C烘箱中烘干（烘烤）过夜；冷却至室温后用于染色。
    注意：烘烤时间可根据切片新鲜程度缩短至1–2小时。若切片在一个月内，则建议过夜烘烤；若超过一个月，则1–2小时烘烤已足够，可节省时间。若时间紧张，始终可采用过夜烘烤。

3. 组织学分析与免疫荧光染色

进行组织学分析和免疫荧光染色，方法如前所述^23,24，略有修改。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）免疫荧光染色如下：

1. 将载玻片置于 65 °C 烤箱中烘烤 1 小时，以灭活内源性碱性磷酸酶活性，随后用二甲苯进行脱蜡处理。
2. 将切片在含 3% 过氧化氢的甲醇溶液中孵育，以阻断内源性组织过氧化物酶活性；然后通过梯度递减的酒精溶液（100%、95%、70%）重新水化，接着在柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween-20，pH 6.0）中，使用去封闭室于 125 °C 处理 10 分钟进行抗原修复。
3. 使用记号笔在组织切片周围画圈，形成疏水屏障，并将切片在封闭缓冲液（含 2.5% 牛血清白蛋白 [BSA] 的 TBS-Tween 溶液）中于 37 °C 孵育 30 分钟，随后在湿盒中加入抗 EGFP 一抗（稀释比例 1:500），于 4 °C 轻柔振荡条件下过夜孵育。
4. 洗涤切片后，在 37 °C 下以适当浓度的荧光标记二抗孵育 30 分钟。
5. 二抗孵育后充分洗涤载玻片，用 Hoechst 染色细胞核，然后用封片介质封片。
   1. 对于 Klf5/EGFP/Ki-67 共染，按照步骤 3.1–3.3 所述处理载玻片，并通过加入 Klf5 抗体（稀释比例 1:150）过夜孵育完成 Klf5 染色。
   2. 根据操作说明，对载玻片应用兔 AP 聚合物检测系统。
   3. 按照制造商说明书，使用显色免疫组化染色法显影 Klf4 染色信号。
   4. 采用先前描述的方法²⁵进行抗体洗脱：将载玻片置于 pH 2.0 的甘氨酸-SDS 溶液中，于 50 °C 振荡孵育 1 小时。
   5. 用蒸馏水彻底洗涤载玻片，随后在封闭缓冲液（含 2.5% BSA 的 TBS-Tween 溶液）中于 37 °C 孵育 30 分钟。
   6. 同时加入 Ki-67（稀释比例 1:500）和 EGFP（稀释比例 1:500）抗体，在 37 °C 孵育 1 小时。
   7. 使用相应的荧光二抗进行检测，随后进行 Hoechst 染色（数据未显示），并用封片介质封片。
6. 通过苏木精-伊红（H&E）染色 5-μm 切片观察组织的组织学形态²⁶。对于荧光图像，分别使用 535、646 和 700 的发射波长来观察 EGFP、Klf5 和 Ki-67 的染色信号。

结果

结合免疫组织化学染色的瑞士卷技术可对小肠或大肠组织进行全面分析。以C57BL/6小鼠大肠的H&E染色为例 （图1），该实例展示了该技术的可行性与有效性。如 图1 所示，图像能够完整呈现结肠的所有部分：近端、中段和远端，从而实现全面的组织学评估。瑞士卷技术以及完整获取小肠或大肠组织全长的能力，对于研究基因表达的异质性、标志物染色或肠道组织对损伤的可变反应具有重要意义。

一个例子是 Lgr5-EGFP/CreER^T2 小鼠中的 EGFP 染色模式。在这种小鼠模型中，EGFP 的表达由 Lgr5 启动子驱动，该启动子仅在活跃增殖的肠隐窝中具有活性。此外，该小鼠模型的转基因表达外显率较低（约 5 - 10%）。如图2所示，肠组织中的 EGFP 表达模式具有变异性。因此，能够获取组织的大视野图像有助于识别目标区域。...

讨论

瑞士卷技术是一种用于大规模制备肠道组织以进行组织学和形态学评估的有力方法。与先前描述的瑞士卷技术（最初为冷冻切片制备而开发^18,19）相比，本文所述的方法可实现肠道组织的快速制备和固定，适用于福尔马林固定及石蜡包埋（FFPE）。与冷冻组织相比，FFPE组织具有更长的保存期限，且因组织完整性更佳，是组织学分析的首选类型。瑞士卷技术的关键步骤包括确保组织具有足够的柔韧性以完成卷绕操作，并在固定后维持瑞士卷结构的完整性及组织染色质量。传统的肠道组织FFPE瑞士卷技术通常较为繁琐且耗时（约2天）^18,19。此外，该标准方法通常得到的肠道组织较僵硬，难以卷成理想的瑞士卷形态，原因在于在卷绕前需将离体肠道组织在10%缓冲福尔马林中孵育过夜。尽管已有针对FFPE目的对该技术进行的其他改良，但这些方法普遍存在组织容易松开和/或卷芯发生扭曲的问题。这主要是因为这些技术使用的是未经固定的鲜组织，其表面因肠道分泌的黏液而过于滑腻。本文展示的新改良技术通过采用一种改良的Bouin固定液克服了上述问题。原始Bouin固定液由乙酸、乙醇、苦味酸和多聚甲醛（或福尔马林）混合而成。本改良方法去除了其中两种最具危险性的成分——...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不锈钢解剖工具套装	VWR	25640-002
脱蜡室	Biocare Medical	DC2012
10 ml 注射器	VWR	89215-218
Swingsette 组织包埋/处理盒（带盖）	Simport	M515
Superfrost Plus 载玻片 [尺寸：25 × 75 × 1 mm]	VWR	48311-703
手动载玻片染色装置	Tissue-Tek/Sakura	4451
绿色染色缸	Tissue-Tek/Sakura	4456
白色染色缸	Tissue-Tek/Sakura	4457
24 片式可拆把手载玻片架	Tissue-Tek/Sakura	4465
烘箱	Thermo Scientific	6243	用于在 65°C 烘烤载玻片
解剖显微镜	Zeiss	Stemi 2000C
荧光显微镜	Nikon	Eclipse 90i	明场与荧光照明，配备 10X、20X 物镜
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
200 证乙醇	AAPR	111000200
甲醇	VWR	BDH1135-4LP
冰醋酸	AAPR	281000ACS
二甲苯	Fisher Scientific	X5P-1GAL
25% 水溶液过氧化氢	ACROS	202465000
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	22-026-213
牛血清白蛋白 V 型，热灭活	Roche	3116956001
Tween 20	Sigma Aldrich	P7949
柠檬酸钠	Fisher Scientific	S279
灌胃针	VWR	20068-624
兔抗 Klf5 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-22797	稀释比例 1:150
鸡抗 EGFP 抗体	Millipore	AB16901	稀释比例 1:500
兔抗 Ki67 抗体	Biocare Medical	CRM325B	稀释比例 1:500
Mach3 兔 AP 聚合物检测试剂盒	Biocare Medical	M3R533L
Warp 红色显色试剂盒	Biocare Medical	WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 小鼠	Jackson labs	008875
自动组织处理仪	Leica	Leica TP1020