方法文章

改进的肠道组织包埋卷制技术用于免疫组织化学和免疫荧光分析

DOI：

10.3791/54161

⸱

2016年7月13日

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1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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准确识别和定位沿肠黏膜上皮的上皮细胞对于定义不同细胞谱系至关重要。对肠组织进行适当的成像对于以最高分辨率识别蛋白质表达模式具有关键作用。本研究旨在阐明小鼠肠组织处理的最佳方法和条件。

摘要

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了解调控肠道上皮稳态及其对损伤与再生反应的因素具有重要意义。现有文献描述了多种获取肠道组织图像以进行数据验证的方法学途径。本文阐述了一种关于小鼠肠道组织获取与处理的通用实验方案。文中讨论了肠道组织的适当固定方法以及可增强肠道上皮形态学特征的瑞士卷（Swiss-roll）技术。切除后对包埋肠道组织的处理与重新定向，对于获得切片后仍能显示完整肠道结构特征的石蜡包埋块至关重要。瑞士卷技术有助于对整个肠道或结肠切片进行全面的组织学评估。能够区分肠道结构特征对于沿肠道全长进行炎症和肿瘤发生的定量测量至关重要。最后，石蜡包埋切片适用于免疫组织化学和免疫荧光检测方法的稳定处理。非荧光免疫组织化学切片可提供清晰的组织图像，详细展示不同细胞结构特征，但无法灵活用于细胞内共定位实验。而免疫荧光检测则可合理利用多个荧光通道进行共定位实验，从而支持机制性研究。

引言

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哺乳动物的肠上皮由单层柱状细胞构成。在小肠中，增殖细胞局限于隐窝内，而分化细胞则位于绒毛区域。然而，由于大肠中不存在绒毛，增殖细胞定位于隐窝底部，分化细胞则占据隐窝的上部区域。肠上皮更新迅速（约3–5天），这一过程由隐窝内增殖细胞的持续分裂所驱动。隐窝中的增殖细胞并非均一的群体，可进一步分为干细胞和过渡扩增（TA）细胞1。干细胞位于隐窝底部，处于最底端起始的前4–5个细胞位置2。目前的研究模型支持存在两类干细胞：隐窝基底部柱状（CBC）干细胞和静息型储备干细胞。CBC干细胞具有活跃的增殖活性，其标志分子包括富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）3、嗅觉素4（Olfm4）4和achaete scute样2（Ascl2）5。另一方面，静息型储备干细胞的标志物包括B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1（Bmi1）6、小鼠端粒酶逆转录酶（mTert）7、HOP同源盒（Hopx）8、双皮质素样及钙调蛋白激酶样1（Dclk1）9以及富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域蛋白1（Lrig1）10。活跃增殖的干细胞产生TA细胞，随后进一步分化为吸收细胞（肠上皮细胞）和分泌细胞（肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和簇细胞）。增殖区持续的细胞分裂导致上皮细胞沿隐窝-绒毛轴向上迁移，直至到达绒毛顶端，在此经历凋亡并从....

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方案

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1. 小鼠

  1. 所有涉及小鼠的研究均经石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下。
    1. 购买C57BL/6小鼠。获取携带两侧由loxP位点包围的Klf5等位基因的C57BL/6小鼠（Klf5fl/fl）。这些小鼠此前已有描述21，并由Dr. Ryozo Nagai慷慨提供。
  2. 购买在Lgr5启动子调控下携带可诱导Cre重组酶基因的C57BL/6小鼠（Lgr5-EGFP/CreERT2小鼠）。
  3. 为建立Lgr5-EGFP/CreERT2/Klf5fl/fl 小鼠，将Klf5fl/fl 小鼠与Lgr5-EGFP/CreERT2小鼠杂交，然后将后代回交至Klf5fl/fl 小鼠。
  4. 按照先前描述的....

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结果

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瑞士卷技术结合免疫组织化学染色可实现对小肠或大肠组织的全面分析。以C57BL/6小鼠大肠的H&E染色为例 （图1），展示了该技术的可行性和有效性。如 图1 所示，图像能够完整呈现结肠的所有部分：近端、中段和远端，从而实现全面的组织学评估。瑞士卷技术以及完整获取小肠或大肠组织全长的能力，对于研究基因表达的异质性、标志物染色或肠道组织对损伤的可变反应具有重要意义。

一个例子是 Lgr5-EGFP/CreERT2 小鼠中 EGFP 的染色模式。在这种小鼠模型中，EGFP 的表达由 Lgr5 启动子驱动，该启动子仅在活跃增殖的肠隐窝中具有活性。此外，该小鼠模型的转基因表达外显率较低（约 5 - 10%）。如图 2所示，肠组织中 EGFP 的表达模式具有变异性。因此，能够获取组织的大视野图像有助于识别目标区域。

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讨论

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瑞士卷技术是一种用于大规模制备肠道组织以进行组织学和形态学评估的有力方法。与先前描述的瑞士卷技术（最初为冷冻切片制备而开发18,19）相比，本文所述的方法可实现肠道组织的快速制备和固定，适用于福尔马林固定及石蜡包埋（FFPE）。与冷冻组织相比，FFPE组织具有更长的保存期限，且因组织完整性更佳，是组织学分析的首选类型。瑞士卷技术的关键步骤包括确保组织具有足够的柔韧性以完成卷绕操作，并在固定后维持瑞士卷结构的完整性及组织染色质量。传统的肠道组织FFPE瑞士卷技术通常较为繁琐且耗时（约2天）18,19。此外，该标准方法通常得到的肠道组织较僵硬，难以卷成理想的瑞士卷形态，原因在于在卷绕前需将离体肠道组织在10%缓冲福尔马林中孵育过夜。尽管已有针对FFPE目的对该技术进行的其他改良，但这些方法普遍存在组织容易松开和/或卷芯发生扭曲的问题。这主要是因为这些技术使用的是未经固定的鲜组织，其表面因肠道分泌的黏液而过于滑腻。本文展示的新改良技术通过采用一种改良的Bouin固定液克服了上述问题。原始Bouin固定液由乙酸、乙醇、苦味酸和多聚甲醛（或福尔马林）混合而成。本改良方法去除了其中两种最具危险性的成分——.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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我们感谢Ainara Ruiz de Sabando提供H&E图像。本研究由美国国立卫生研究院（DK052230、DK093680和CA172113）授予Vincent W. Yang博士的资助支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不锈钢解剖工具套装VWR25640-002
脱蜡室Biocare MedicalDC2012
10 ml 注射器VWR89215-218
Swingsette 组织包埋/处理盒（带盖）SimportM515
Superfrost Plus 载玻片 [尺寸：25 × 75 × 1 mm]VWR48311-703
手动载玻片染色装置Tissue-Tek/Sakura4451
绿色染色缸Tissue-Tek/Sakura4456
白色染色缸Tissue-Tek/Sakura4457
24 片式可拆把手载玻片架Tissue-Tek/Sakura4465
烘箱Thermo Scientific6243用于在 65°C 烘烤载玻片
解剖显微镜ZeissStemi 2000C
荧光显微镜NikonEclipse 90i明场与荧光照明，配备 10X、20X 物镜
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
200 证乙醇AAPR111000200
甲醇VWRBDH1135-4LP
冰醋酸AAPR281000ACS
二甲苯Fisher ScientificX5P-1GAL
25% 水溶液过氧化氢ACROS202465000
10% 缓冲福尔马林Fisher Scientific22-026-213
牛血清白蛋白 V 型，热灭活Roche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
柠檬酸钠Fisher ScientificS279
灌胃针VWR20068-624
兔抗 Klf5 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-22797稀释比例 1:150
鸡抗 EGFP 抗体MilliporeAB16901稀释比例 1:500
兔抗 Ki67 抗体Biocare MedicalCRM325B稀释比例 1:500
Mach3 兔 AP 聚合物检测试剂盒Biocare MedicalM3R533L
Warp 红色显色试剂盒Biocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 小鼠 Jackson labs008875 
自动组织处理仪LeicaLeica TP1020

参考文献

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  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....

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