本文介绍了一种新型的人源化小鼠肝脏模型，该模型通过将未成熟且具有扩增能力的人类肝干细胞移植到白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（TRECK）/SCID小鼠体内而建立。
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摘要
摘要
一种新型动物模型已成功建立，该模型通过人肝细胞移植构建了具有人源化肝脏的嵌合小鼠。在这些小鼠中，肝脏已被功能性人肝细胞重新定植，可作为研究人类肝细胞生物学、药物代谢及其他临床前应用的有力工具。实现人肝细胞成功移植的关键因素之一是清除内源性肝细胞，以避免与人源细胞竞争，并为供体人细胞的扩增与分化提供充足的空间和适宜的微环境。迄今为止，已有两种主要的肝损伤小鼠模型被用于该领域，分别为延胡索酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, Fah）缺陷小鼠和尿型纤溶酶原激活物（uroplasminogen activator, uPA）转基因小鼠。然而，Fah小鼠主要适用于成熟肝细胞移植，而uPA模型的应用则受限于繁殖能力下降的问题。为克服上述局限，研究人员采用了白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（Alb-toxin receptor mediated cell knockout, TRECK）/重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠模型 体内 不成熟人肝细胞的分化与人源化肝脏的生成。人肝干细胞（HpSCs）成功地重建了经白喉毒素（DT）处理后发生致死性暴发性肝衰竭的Alb-TRECK/SCID小鼠的肝脏。该Alb-TRECK/SCID小鼠人源化肝脏模型将在药物代谢和药物相互作用研究中具有功能性应用，并将推动其他相关研究的发展。 体内 和 体外 研究。
引言
小鼠常被用于药物测试，因为人类的生物医学研究受到限制1；然而，这些模型并不总是有效，因为它们可能无法准确模拟在人体中观察到的效果。目前临床使用的大多数药物主要在肝脏中代谢。但由于物种间的差异，同一种药物在小鼠和人类肝脏中可能被代谢为不同的代谢产物。因此，在药物开发过程中，通常难以确定一种潜在药物是否会对临床应用带来任何风险2,3。
为解决这一问题，已通过在小鼠体内培养人肝细胞的方式开发出“人源化”小鼠肝脏模型4-6；这些模型表现出与人肝脏相似的药物反应。目前用于构建人源化肝脏的主要小鼠模型包括尿型纤溶酶原激活物（uPA+/+）小鼠4,7、延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah−/−）小鼠6，以及近期报道的胸苷激酶（TK-NOG）小鼠。
然而，先前的报道表明，在 Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) 小鼠肝脏中，移植的人类未成熟细胞或干细胞的竞争能力低于成人人类肝细胞8-10。此外，Fah−/− 小鼠仅对已分化的肝细胞提供生长优势，而对未成熟的肝前体细胞则无此作用11。在实验室中将人类肝干细胞（HpSCs）移植到 TK-NOG 小鼠体内也未能成功。因此，目前尚不存在可用于高效植入人类未成熟肝细胞的有效小鼠模型。
因此，我们开发了一种新型的 Alb-TRECK/SCID 小鼠模型，该模型可被高效地重建造入人未成熟肝细胞。这种转基因小鼠模型在肝细胞特异性白蛋白启动子的调控下表达人肝素结合性表皮样生长因子（HB-EGF）受体。在给予白喉毒素（DT）后，这些小鼠因肝细胞的条件性消融而发生暴发性肝炎，从而为供体细胞的定植与增殖创造条件12。尽管在先前的研究中已成功将小鼠肝细胞移植至 Alb-TRECK/SCID 小鼠体内13,14，但利用 Alb-TRECK/SCID 小鼠构建人源化肝脏的报道尚属首次。
在本研究中，通过将人源性肝祖细胞（HpSCs）移植到Alb-TRECK/SCID小鼠体内，生成了人源化肝脏。该人源化肝脏为干细胞的普遍分化提供了体内环境，并可用于预测人类药物代谢模式及药物-药物相互作用。
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方案
所有动物实验操作均按照横滨市立大学动物保护指南进行。
1. 急性肝损伤小鼠模型的构建
- 向1 mg白喉毒素（DT）中加入1 ml含苯酚的0.85% NaCl溶液（每100 ml 0.85% NaCl溶液中含0.6 g苯酚），配制成1 mg/ml的DT储备液。注意：浓度为1 mg/ml的DT在3 °C至8 °C条件下可保存约2年。
- 用含苯酚的0.85% NaCl溶液将1 mg/ml的DT储备液连续稀释至0.3 μg/ml，并分装0.3 μg/ml的DT溶液作为工作液。注意：该工作液应新鲜配制。
- 为进行亚致死剂量（约50%致死率）实验，向8周龄小鼠给予1.5 μg/kg剂量的DT。
- 将小鼠仰卧固定，于膝盖弯曲处下方、偏离中线左侧或右侧进针，以进行腹腔注射。避免在中线进针，以防刺破膀胱。针头与身体呈约45°角插入。
- 使用胰岛素注射器，按每20 g小鼠体重注射100 µl新鲜配制的0.3 μg/ml DT溶液。例如，一只18 g的小鼠应注射90 µl的0.3 μg/ml DT溶液。
- DT注射后48小时，将小鼠置于固定器中，将其尾巴浸入37 °C水浴中约10分钟以扩张血管，随后用锋利的手术刀片在距尾尖2 cm处做一个约1 mm的切口，用毛细管采集血液。
- 将含有血液的毛细管在1,500 x g条件下离心5分钟，通过分离上清液和细胞沉淀收集血清。
- 用移液器将50 µl经1:20稀释的小鼠血清加至GOT/AST-PIII检测片上。根据制造商说明书，使用多功能全自动干化学分析仪在650 nm波长下测定反应产物（蓝色染料）的吸光度。
注意：天冬氨酸氨基转移酶（AST）/谷草转氨酶（GOT）活性结果将自动显示。DT注射后第2天，约60%的小鼠AST值在12,000 - 16,000 IU/L之间，被认为已发生急性肝损伤。这些小鼠被转移至新笼具中，作为细胞移植受体使用。
2. 人肝干细胞的制备
- 使用细胞分选仪，通过CDCP1、CD90和CD66细胞抗原从人原代胎儿肝细胞中分离人肝干细胞，获得CDCP1+CD90+CD66-亚群，然后将分离的细胞接种于IV型胶原包被的培养皿中，方法如先前报道15。使用胚胎发育14至18周之间的人原代胎儿肝细胞。
- 收集在100 mm培养皿中培养至80%–90%融合度的人肝干细胞，吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞，随后移除PBS。加入2 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C下消化5 min。注意：融合度超过90%的细胞不适合用于细胞移植，因为细胞分化可能影响其在小鼠体内的增殖能力。
- 在显微镜下观察细胞分散状态。当细胞呈现漂浮或自由流动状态时，加入8 ml含10% FBS的DMEM/F12终止酶消化反应。
- 用10 ml移液管缓慢重悬细胞，转移至15 ml锥形离心管中，在100 × g、4 °C条件下离心5 min。
- 小心地将细胞沉淀重悬于10 ml含10% FBS的DMEM/F12中，并使用显微镜计数板测定细胞数量。
- 将细胞按每只小鼠50 µl PBS中含1.0 × 106个细胞进行分装，置于冰上保存直至移植。
3. 人肝干细胞的脾内移植
- 将一个洁净的笼子放在 37 °C 的电热垫上。
- 通过将小鼠置于喷嘴下方，使用异氟烷吸入麻醉（1 - 1.5% (vol/vol)，氧气流速为每分钟 2 L）；也可使用含有浸有异氟烷的纱布的管子进行麻醉。
- 通过轻捏小鼠后肢足垫确认其是否已麻醉。若出现膝跳反射，需将小鼠放回麻醉舱内。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，以防角膜干燥。
- 使用电动剃毛器剃除手术区域的毛发，并用 70% (vol/vol) 乙醇和聚维酮碘消毒。然后在左侧腹侧肋骨下缘稍下方做一道长约 1 cm 的皮肤切口，接着切开腹壁和腹膜。
- 小心暴露脾脏。使用带有 32 号 1/2 英寸针头的 100 μl 微量注射器，将 50 µl PBS 中含有的 1.0 × 106 个人肝干细胞直接注射入小鼠脾脏。注射时将针头倾斜约 5° 角。
- 确保注射深度小于脾脏厚度的一半。针头应从脾脏一端（头端）刺入，并在另一端（尾端）释放细胞。
- 为防止注射后细胞外漏，注射后用手指轻轻按压注射部位 2 分钟，然后拔出针头。
- 将脾脏复位至小鼠体内，并使用连续缝合线分别缝合肌肉层和皮肤以关闭切口。
- 移植操作完成后，立即将小鼠转移至已预热至 37 °C 的笼子中。为确保小鼠呼吸顺畅，应将其侧卧放置于笼内，并避免笼内垫料接触手术部位。
- 持续监测小鼠直至麻醉作用完全消退，以确保缝合口保持闭合，且小鼠恢复至术前状态。
- 确保为小鼠提供正常的饮水和饲料。术后 1 小时，将笼子移回动物中心的饲养室，并每日进行监测。
4. 小鼠肝脏中移植的人肝干细胞来源肝细胞的检测
注意：对于以下操作步骤，使用过量的氯胺酮和赛拉嗪使所有动物安乐死，随后进行颈椎脱位。
- 移植后4至6周，处死小鼠，使用手术剪同时剪开皮肤和筋膜，打开腹腔。
- 用手术剪作为撑开器，分离腹膜上方的结缔组织，并沿腹白线剪开腹膜，以暴露腹膜腔。
- 用镊子提起胸骨，穿刺膈肌，然后从两侧沿胸骨向上剪至颈环。
- 在肝脏的胸腔侧切断下腔静脉，将食管从前方向外经肝脏拉出。切除膈肌，以便取出肝脏。
注意：操作时应始终保持剪刀尖端朝上，以防损伤下方的胸腔器官。胸腺有时会附着于胸骨背侧，需小心避免牵连。 - 以膈肌作为抓手，开始将肝脏从腹腔中拉出。此时下腔静脉仍固定肝脏，需剪断下腔静脉；注意避免过早分离右侧肾上腺。
注意：小鼠肝脏分为四个叶，包括中叶、左叶、右叶和尾状叶。胆囊悬挂于中叶的小分叉处。 - 在各肝叶交界处将其分离，并根据制造商说明书将其包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。将含有肝组织的OCT置于冷冻切片机的金属架上进行速冻。
- 在-18 °C条件下，使用冷冻切片机切取5 µm厚的组织切片，贴附于室温载玻片上。将组织储备样本保存于-80 °C。根据已有文献报道的方法16，对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色和免疫荧光染色前处理。
5. 人白蛋白分泌的检测及嵌合率的计算
- 为测量人肝再殖程度，使用血清和人白蛋白ELISA试剂盒，按照制造商说明书进行人白蛋白ELISA检测。
- 通过实时PCR分析全人源化肝脏中基因表达水平，计算人源化肝脏嵌合率。确定人特异性肌动蛋白与人鼠交叉反应性肌动蛋白的相对表达水平比值（比值1），以及鼠特异性肌动蛋白与人鼠交叉反应性肌动蛋白的相对表达水平比值（比值2）。嵌合率计算公式为：比值1 / (比值1 + 比值2)。
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结果
Alb-TRECK/SCID 小鼠的肝细胞在白蛋白启动子的调控下表达人源白喉毒素受体 HB-EGF 基因，在给予白喉毒素（DT）后表现出细胞毒性效应12。为评估 DT 处理对肝损伤的影响，向 8 周龄的 Alb-TRECK/SCID 小鼠注射 1.5 μg/kg 的 DT，并在给药后 48 小时通过组织学方法评估肝脏的病理变化。与对照组小鼠（未接受 DT 处理）相比，DT 处理组小鼠肝脏结构紊乱，伴有充血改善及血清 AST 活性升高。此外，DT 处理组小鼠的肝细胞中出现多个深染的嗜酸性胞质包涵体，并伴有深染的细胞核（极可能为凋亡的肝细胞）；部分其他肝细胞则表现为结构保存完整，或呈现空泡化胞质及深染细胞核，门静脉周围炎症轻微或无明显炎症（图 1）。这些发现与先前的研究结果一致，表明 Alb-TRECK/SCID 小鼠是理想的致死性暴发性肝衰竭模型，且仅需单次注射 DT 即可建立该模型12。
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讨论
近期研究表明，小鼠肝脏可被人类肝细胞重建，包括成体肝细胞和增殖性肝干细胞17这些重建肝脏已被用作药物代谢测试以及药物发现与开发的临床前实验模型18；此外，他们还提供了 体内 细胞成熟与分化的环境19本研究的主要目的是建立一种新型肝病小鼠模型，以支持人类未成熟肝细胞的增殖、成熟与分化，从而获得药物代谢活性。
脾内移植的过程已被广泛研究。移植到大鼠和小鼠脾脏中的细胞可存活至其平均寿命结束。脾内移植方案已被证明在探究特定科研问题方面非常有用；由于该方法可提高小鼠存活率并促进肝脏再生，全球许多实验室已尝试将其用作肝细胞移植的一种高度可重复且可靠的模型。然而，将细胞植入脾实质存在一定风险，因为大多数移植的细胞会迁移至肝脏，可能阻塞门静脉分支。尽管这种阻塞可能是暂时的，且对健康肝脏环境影响较小，但在已有肝损伤的情况下，该操作可能进一步降低肝功能，加重门静脉高压，并可能对细胞定植产生负面影响。尽管我们已成功应用脾内途径进行肝细胞移植，但仍有一些问题需要进一步研究，尤其是潜在新细胞来源的问题。此外，在进行脾内肝细胞...
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢日本东京都医学科学研究所哺乳动物遗传学项目提供实验小鼠。同时感谢日本积水医疗株式会社吸收、分布、代谢、排泄与毒理学研究所的 S. Aoyama 和 Y. Adachi，以及 K. Kozakai 和 Y. Yamada 在 LC-MS/MS 分析方面的协助。本研究部分得到了日本文部科学省（MEXT）向 Y-W.Z. 提供的科研经费资助（项目编号：18591421、20591531 和 23591872）；江苏省高层次人才引进创新创业项目及江苏省科技计划项目（BE2015669）的资助；以及日本科学技术振兴机构（JST）向 H.T. 提供的战略性创新研究推进计划（S-innovation，项目编号：62890004）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人血清白蛋白 | Sigma | A6684 | 小鼠 |
| 人CK19 | Dako | M088801 | 小鼠 |
| 人核抗原 | Millipore | MAB1281 | 小鼠 |
| 人CK8/18 | Progen | GP11 | 豚鼠 |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | 小鼠 |
| CD90 | BD | 559869 | 小鼠 |
| CD66 | BD | 551479 | 小鼠 |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 白喉毒素 | Sigma | D0564-1MG | |
| 人白蛋白ELISA试剂盒 | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| 注射器（1 ml） | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" 针头 | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.包埋剂（118 ml） | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo高速细胞分选仪 | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
参考文献
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