使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

摘要

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus 胚胎提取物的使用已日益普遍，用于阐明细胞器大小调控的机制。本方法描述了胚胎提取物的制备以及一种新型的细胞核比例调控检测方法，可用于鉴定细胞核大小调控的机制。

摘要

细胞生物学中的一个基本问题是细胞和细胞器的大小是如何被调控的。长期以来人们认识到，细胞核的大小通常与细胞大小成比例，尤其是在胚胎发生过程中，细胞和细胞核的尺寸会发生显著减小。目前，调控细胞核大小的机制在很大程度上仍不清楚，但可能与癌症相关，因为在癌症中，细胞核大小的改变是一个重要的诊断和预后指标。 在体 鉴定细胞核大小调控因子的方法因细胞核功能的重要性和复杂性而变得复杂。 体外 此处描述的用于研究细胞核大小调控的方法，利用了细胞在正常发育过程中发生的细胞核尺寸减小现象 Xenopus laevis 发育。首先，细胞核被组装起来 X. laevis 卵母细胞提取物中。随后，将这些细胞核分离并重悬于晚期胚胎的细胞质中。经过30至90分钟的孵育后，细胞核表面积减少20%至60%，该方法可有效用于鉴定晚期胚胎细胞质中参与发育过程中细胞核大小缩放调控的组分。该方法的主要优势在于卵母细胞和胚胎提取物易于进行生物化学操作，有助于鉴定调控细胞核大小的新蛋白和活性成分。与任何 体外 方法，结果验证在 an 体内 系统很重要，且显微注射 X. laevis 胚胎特别适用于这些研究。

引言

细胞器的大小通常与细胞大小成比例，其中细胞核大小与细胞大小的比例关系可能是这方面记录最为详尽的例子^1-10这一点在胚胎发生和细胞分化过程中尤为明显，此时通常会观察到细胞和细胞核尺寸的显著减小^11,12此外，细胞核大小的改变是癌症诊断和预后判断的关键参数^13-17核大小调控机制在很大程度上尚不清楚，部分原因在于核结构与功能的复杂性和重要性。本文所述方法是作为一种 体外 一种适用于生化操作并可用于阐明细胞核大小调控机制的细胞核大小比例测定方法。

Xenopus laevis 卵母细胞提取物是用于重现和研究复杂细胞过程的成熟体系 体外 这些提取物揭示了关于多种细胞过程（包括有丝分裂纺锤体、内质网和细胞核的组装与功能）的新基本信息^18-22提取系统的一个关键优势在于 X. laevis 卵母细胞提取物几乎代表了未稀释的细胞质，其成分易于改变，例如通过添加重组蛋白或进行免疫耗竭。此外，可通过使用某些处理手段来操控关键的生物学过程，而这些处理在完整细胞中可能会导致细胞死亡 体内 背景下。对卵提取物实验步骤的改进可实现从不同来源分离提取物 X. laevis 胚胎而非卵子，且这些胚胎提取物同样适用于生化操作²³. 在……期间 X. laevis 发育过程中，....

方案

所有 Xenopus 相关操作和研究均遵循《美国国家研究委员会实验动物护理与使用指南》第8版。相关方案已获怀俄明大学机构动物护理和使用委员会（认证编号 # A-3216-01）批准。

1. 准备 X. laevis 卵母细胞提取物（改编自^27,28)

1. 在采集卵子前至少三天至最多两周，对雌性 X. laevis 青蛙进行初次处理，注射一次100 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）。
2. 实验前一天，向已处理的青蛙注射800 IU的人绒毛膜促性腺激素（HCG），并将其置于每只青蛙1 L的1/3x Marc's改良林格液（MMR）中，温度保持在16 °C。所有缓冲液的配方见表1。
   ​注意：部分青蛙可能不产卵或产出质量较差的卵。通常需注射2–3只青蛙，以确保至少有一只青蛙能产出足够数量且质量良好的卵。平均每只青蛙产出的卵可制备至少1 ml的卵提取物。
3. 使用冷的去离子蒸馏水（ddH₂O）配制1 L的1/3x MMR，并准备500 ml缓冲液B、1 L缓冲液C、500 ml缓冲液D和100 ml缓冲液E。
4. 将产出的卵转移至玻璃结晶皿（150 × 75 mm）中。使用剪去尖端的塑料巴斯德吸管，去除白色蓬松的已激活卵或破裂卵。仅保留具有清晰且均等的深色动物极和白色植物极的卵。

结果

卵提取物中细胞核的组装

本方案的第一步是准备 X. laevis 卵母细胞提取物（方案1）和去膜精子核（方案2）。这些试剂随后用于组装细胞核 从头合成 （方案3） 图1 显示一些代表性数据。加入钙离子可使处于减数分裂阻滞的卵提取物进入间期，而环己酰亚胺可使提取物持续阻滞在间期。在反应启动后30至45分钟，最初细长的S形精子核应开始增厚，形成蛞蝓状的染色质团块。可通过荧光标记的核输入货物（如GST-GFP-NLS，数据未显示）的入核与滞留，或使用识别含FG重复序列核孔蛋白的mAb414对核孔复合体进行边缘染色，来评估完整核膜的形成情况。图1A）。在细胞核组装完成后，随着核膜的扩张以及核蛋白的输入，核形态应变得更加圆润，核体积应增大（图1B-C）。若未观察到完整核膜的形成或细胞核生长，则.......

讨论

本文介绍了一种研究细胞核大小调控机制的新方法 X. laevis 发育。发育进程伴随着细胞生理学、代谢、分裂速率和迁移的显著变化，以及细胞和细胞内结构大小的改变。这些多样化的过程复杂且至关重要，因此很难单独研究发育的某一个方面 体内 环境。 X. laevis 此处描述的胚胎提取物及细胞核收缩实验可用于研究尺寸调控机制 体外 环境，绕过复杂的信号和物理限制 体内 系统。此外，该提取物的开放性使其易于进行生化操作。

该实验方案中某些步骤可能需要进行故障排查。核组装和生长过程中出现问题，可能源于卵子质量差、精子核去膜不完全、精子核浓度过高，或核组装反应孵育温度过低。由于晚期胚胎提取物中的内源性胚胎核体积较小，去除这些核可能较为困难。该步骤可能需要进行多轮离心，或使用其他类型的转子，才能完全去除所有核。在核收缩实验中，若核未出现体积缩小，可能是由于胚胎质量不佳、起始核体积过小，或孵育温度过低所致。卵子和胚胎质量差的表现包括：大量呈白色蓬松状的激活卵、卵黄和色素颗粒分布不均，以及卵呈串状产出。将固定后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG	Molecular Probes	A10037
ATP 二钠盐	Sigma Aldrich	A2383
苯佐卡因	Sigma Aldrich	E1501
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma Aldrich	C3306
离心机	Beckman	J2-21M
离心机转子	Beckman	JS 13.1
抑肽酶	Sigma Aldrich	C7268
磷酸肌酸二钠	Calbiochem	2380
放线菌酮	Sigma Aldrich	C6255
细胞松弛素 D	Sigma Aldrich	C8273
一次性擦拭纸（kimwipes）	Sigma Aldrich	Z188956
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	W326306
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
甲醛	Sigma Aldrich	F8775
玻璃结晶皿（150 × 75 mm）	VWR	89090-662
甘油	Macron	5094-16
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
Hoechst - 双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐	Sigma Aldrich	B2261
HCG - 人绒毛膜促性腺激素	Prospec	hor-250-c
L15 培养基	Sigma Aldrich	L4386
亮抑蛋白酶肽	Sigma Aldrich	L2884
溶血卵磷脂	Sigma Aldrich	L1381
mAb414	Abcam	ab24609
MgCl2	EMD	MX0045-2
MgSO4	Sigma Aldrich	M9397
麦芽糖	Sigma Aldrich	M5885
NP40	BDH	56009
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710
青霉素 + 链霉素	Sigma Aldrich	Pp0781
胃蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	P5318
PIPES	Sigma Aldrich	P6757
塑料石蜡膜（parafilm）	Sigma Aldrich	P7793
KCl	Sigma Aldrich	P9541
KH2PO4	Mallinckrodt	70100
KOH	Baker	5 3140
PMSG - 孕马血清促性腺激素	Prospec	hor-272-a
NaCl	Sigma Aldrich	S3014
NaHCO3	Fisher	BP328
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
NaOH	EMD	SX0590
研钵	Thomas Scientific	3411D56
圆底玻璃试管，15 ml	Corex	8441
二抗（Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG）	ThermoFisher	A10037
蔗糖	Calbiochem	8550
PCR 仪	Bio-Rad	T100
超速离心机	Beckman	L8-80M
超速离心机转子	Beckman	SW 50.1
Vectashield（抗荧光淬灭封片剂）	Vector	H-1000