利用直接荧光成像对纳米颗粒-聚合物复合材料进行高级组分分析

摘要

本文介绍了一种用于监测纳米颗粒掺入聚合物基体的可靠方法 通过 溶胀包封。我们通过横截面荧光成像展示了硒化镉量子点的表面浓度可被准确可视化。

摘要

聚合物-纳米颗粒复合材料的制备在多种功能材料的开发中具有重要意义。明确这些材料的精确组成尤为关键，尤其是在表面催化剂的设计中，活性组分的表面浓度直接决定了材料的催化活性。利用纳米颗粒的抗菌材料是该技术的一个重要研究方向。近年来，溶胀封装（swell encapsulation）技术被提出用于将抗菌纳米颗粒嵌入聚合物基质中。该方法的优势在于可将纳米颗粒的引入局限于材料的外表面，而这些表面正是材料的活性作用位点。然而，对纳米颗粒负载量的定量分析仍具挑战性。尽管已有研究探讨了抗菌活性与活性组分表面浓度之间的关联，但这种关系尚未实现直接可视化。本文展示了一种可靠的方法，用于监测纳米颗粒在聚合物基质中的掺入过程 通过 溶胀包封。我们通过横截面荧光成像展示了CdSe/ZnS纳米颗粒表面浓度的精确可视化。利用该方法，可定量分析纳米颗粒的摄取量 通过 溶胀封装并测量封装颗粒的表面浓度，这是优化功能材料活性的关键。

引言

纳米材料的应用长期以来一直是新兴技术领域中日益受到关注的方向。^1-3 这包括纳米颗粒在日常用品中的日益广泛应用，如化妆品、服装、包装和电子产品。^4-6 推动功能材料中使用纳米颗粒的一个主要原因是，与常规材料相比，纳米颗粒具有更高的反应活性，此外还可通过调节颗粒尺寸来调控其性能。⁷ 另一个优势在于能够便捷地制备复合材料，从而向基体材料引入关键特性，例如催化功能、材料增强以及电学性能的调控。^8-12

纳米粒子-聚合物复合材料可通过多种技术实现，其中最简单的方法是在基体材料制备过程中直接引入所需的纳米粒子^13,14。这种方法可形成一种均匀的材料，其中纳米粒子在整个基体中均匀分布。然而，许多应用仅需在纳米复合材料的外部界面处存在活性材料。因此，直接掺入会导致有时成本较高的纳米粒子材料利用效率低下，因为大量纳米粒子被浪费在材料本体内部^15,16。为了实现直接掺入，纳米粒子还必须与基体材料的形成过程相容。这可能具有挑战性，尤其是在需要多方面反应的合成过程中，例如热固性聚合物的合成通常由金属配合物催化剂促进，而高活性的纳米粒子可能会影响此类催化机制¹⁴。

在聚合物合成过程中直接掺入纳米颗粒存在诸多显著缺点，这促使研究人员开发出一系列技术，旨在将纳米颗粒的掺入限制在材料表面层。^17-21 膨胀封装（swell encapsulation）是文献报道中最成功的策略之一，可实现较高的表面纳米颗粒浓度，同时最大限度减少纳米颗粒在聚合物本体中的浪费。^17-19 该技术利用溶剂驱动的聚合物基质溶胀过程，使分子物种和纳米颗粒得以进入基质内部。当去除溶胀溶剂后，进入基质的物质即被固定在原位，其中浓度最高的部分集中在材料表面。迄今为止，大多数关于膨胀封装的报道均集中于抗菌聚合物的制备，因为在该类材料中，活性组分必须位于材料表面才能发挥关键作用。尽管许多研究已证实抗菌活性得到增强，但很少有研究对表面纳米颗粒的精确组成进行深入分析。Crick et al. 最近报道了一种直接可视化纳米颗粒渗入过程的方法，为理解膨胀封装所实现的动力学过程及表面纳米颗粒浓度提供了重要见解。²²

本研究详细描述了硒化镉量子点（QD）的合成、将其溶胀封装到聚二甲基硅氧烷（PDMS）中的过程，以及利用荧光成像技术直接观察其掺入情况。研究探讨了溶胀封装时间以及溶胀溶液中纳米粒子浓度变化的影响。该荧光可视化技术可实现对纳米粒子渗入PDMS过程的直接成像，并证明量子点的最高浓度位于材料表面。

方案

1. CdSe/ZnS核壳量子点的制备

1. 三辛基膦（TOP）-硒溶液的制备
   1. 在氮气氛围下的Schlenk烧瓶或手套箱中，将适量的硒（Se）加入三辛基膦（TOP）中，配制0.5 M的硒-TOP溶液（每次反应需8 ml，通常将0.4 g硒溶于10 ml TOP中）。
   2. 搅拌混合物1小时，使硒完全溶解，形成灰色的TOP-Se配合物溶液。
   3. 对溶液进行5次冻抽-解冻除气处理。所得储备液可在氮气氛围下保存3个月。
2. CdSe核的制备
   1. 称取氧化镉（51 mg，0.4 mmol）、TOP氧化物（3.7 g，9.6 mmol）、十六胺（1.93 g，8 mmol）和1-十二烷基膦酸（0.22 g，0.88 mmol），转移至一个250 ml三口圆底烧瓶中，并加入搅拌子。
   2. 用橡胶隔膜封闭两个瓶口，第三个瓶口连接长回流冷凝管和氮气/真空Schlenk线。将加热套温度探针通过一个隔膜插入反应混合物中。用氮气反复抽换烧瓶内气氛五次。
   3. 将烧瓶加热至320 °C，在氮气氛围下搅拌熔融物1小时。
   4. 将加热套温度降至270 °C，然后使用大容量注射器和宽孔针头（20 ml，3 mm孔径）对反应体系进行5次氮气除气。
   5. 取8 ml TOP-Se溶液（步骤1.1制备），通过隔膜快速但小心地注入三口烧瓶中。
   6. 在270 °C下搅拌反应30秒至10分钟，以控制生成颗粒的尺寸。若需获得红光发射（~600 nm），反应时间7–9分钟较为合适。
   7. 准备一烧杯沸水（体积足够浸没反应容器的一半），置于反应装置旁。反应完成后，迅速将反应瓶在沸水中旋转冷却。
      注意：冷却过程可能导致烧瓶破裂，请格外小心，并佩戴厚实的防渗透手套。
   8. 冷却后，向烧瓶中注入10 ml氯仿以溶解全部产物，并将溶液分装至两个50 ml离心管中。
   9. 向每支离心管中补加乙醇（EtOH）至50 ml，于3,600 × g离心10分钟以沉淀颗粒。弃去上清液，将沉淀物重新分散于共10 ml正己烷中。
3. CdSe核的ZnS包壳：
   1. 将正己烷中的CdSe核加入含有二乙基二硫代氨基甲酸锌（0.5 g，1.4 mmol）、油胺（3 ml，9.12 mmol）、三辛基膦（3 ml，6.73 mmol）和1-十八烯（10 ml）的100 ml圆底烧瓶中，加入搅拌子，并将反应体系置换为氮气氛围。
   2. 在热板搅拌器上以3.3 °C/min的速率加热，同时施加部分真空，升温至70 °C，利用Schlenk线除去正己烷。
   3. 切换为氮气氛围，继续以相同速率加热至120 °C，并在120 °C下搅拌2小时。
   4. 让反应液冷却，将混合物分装至两个50 ml离心管中。每管补加乙醇（EtOH）至50 ml以沉淀颗粒，于3,600 × g离心10分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀物重新分散于共10 ml正己烷中。
   6. 将该溶液再次离心（3,600 × g，10分钟），以去除任何不溶性杂质，随后将上清液倾析至样品管中，在氮气氛围下4 °C冰箱中保存，最长可稳定存放三个月。

2. 纳米颗粒在聚二甲基硅氧烷中的溶胀封装

1. 溶胀液的制备：
   1. 通过将 36 ml 正己烷与 4 ml CdSe 量子点分散液（按原合成产物）混合，制备 CdSe 量子点的储备液，并使用磁力搅拌器搅拌溶液。
   2. 取两个小瓶，每瓶装入 9 ml 上述储备液，作为指定的溶胀液备用。
   3. 使用剩余的储备液制备不同量子点浓度的溶胀液。通过稀释储备液，配制三种浓度递减的溶胀液，分别为 66% (v/v)、50% 溶液和 33% 溶液。
      1. 通过将 6 ml CdSe 量子点储备液与 3 ml 正己烷混合，制备 66% (v/v) 溶液。磁力搅拌以确保充分混合。
      2. 通过将 4.5 ml CdSe 量子点储备液与 4.5 ml 正己烷混合，制备 50% (v/v) 溶液。磁力搅拌以确保充分混合。
      3. 通过将 3 ml CdSe 量子点储备液与 6 ml 正己烷混合，制备 33% (v/v) 溶液。磁力搅拌以确保充分混合。
   4. 将所有量子点溶液置于避光条件下，室温保存。
2. 聚合物制备及量子点掺入——改变溶胀液中的量子点浓度：
   1. 使用新的手术刀片切割出四块医用级硅胶方片（11 mm × 11 mm）。
   2. 将每块医用级硅胶方片分别浸入四种不同量子点浓度（v/v）的溶胀液中：储备液、66% (v/v)、50% (v/v) 和 33% (v/v)。在避光、室温条件下使聚合物样品溶胀 24 小时。
   3. 将溶胀后的聚合物样品从相应的溶胀液中取出，在避光条件下空气中干燥 48 小时，期间残留溶剂挥发，聚合物收缩恢复至初始尺寸。
   4. 用去离子水彻底清洗掺入量子点的样品，以去除表面结合的物质。
3. 聚合物制备及量子点掺入——改变聚合物在溶胀液中的暴露时间：
   1. 参照步骤 2.2.1，再准备四块医用级硅胶方片（11 mm × 11 mm）。
   2. 将医用级硅胶方片分别浸入储备溶胀液中，暴露时间分别为 1 小时、3 小时、6 小时和 24 小时。
   3. 从溶胀液中取出后，在避光条件下将溶胀的聚合物样品空气中干燥 48 小时，使其收缩恢复至原有尺寸。
   4. 用去离子水彻底清洗掺入量子点的样品，以去除表面结合的物质或残留溶剂。

3. 纳米颗粒溶胀封装进入聚二甲基硅氧烷的可视化

1. 硅胶样品制备：
   1. 使用新的手术刀片切割出两块硅胶方块（5.5 mm × 11 mm），确保暴露出硅胶样品的内部表面。
2. 荧光成像：
   1. 将硅胶样品放置在显微镜载玻片上进行成像，确保聚合物的新鲜切割面与玻璃载玻片完全接触。轻轻按压硅胶部分，以确保其与显微镜载玻片之间平滑贴合。将样品置于显微镜载物台上。
   2. 使用光谱滤波的488 nm激光线完成荧光寿命测量，该激光线由脉宽5 psec、重复频率20 MHz或类似的脉冲组成。²³ 使用声光可调滤波系统直接耦合至激光输出端，以产生488 nm激光线。通过自行搭建的激光扫描单元（见补充信息）聚焦激光束，该光束经二向色镜（488 nm）反射后进入10X物镜的后孔径，最终照射到样品上。
      1. 使用同一物镜收集荧光发射信号，信号随后穿过同一二向色镜，导向工作于单光子计数模式的雪崩光电二极管。使用时间相关单光子计数（TCSPC）板处理寿命测量数据。²³
   3. 在每次实验开始和结束时记录仪器响应函数（IRF）。²³
      注意：TCSPC实验中记录的信号应显示光子到达探测器与后续激光脉冲产生之间的时间延迟。然而，该时间延迟需与测量装置的IRF进行卷积。因此，IRF通过测量100 nM金胺O的仪器响应获得，其荧光寿命显著短于仪器响应（约100 psec）。
   4. 通过非线性拟合荧光强度的指数衰减曲线，并利用最大似然估计（MLE）算法将结果与IRF去卷积，从而提取寿命值。^25-27 MLE（γ_j）的计算公式为
      
      其中n_i表示第i通道中的光子计数，k为每次荧光衰减对应的通道（或时间 bins）数量，p_i(j)表示当粒子寿命为j时，一组光子落入第i通道的概率，N为特定衰减曲线的总光子计数。
   5. 对每个样品连续记录5分钟的荧光强度和寿命数据，生成包含264幅图像的连续扫描，每幅图像尺寸为512 × 512像素。将这些数据合并，生成二维荧光强度图、寿命图及强度加权寿命图，并采用MATLAB进行处理，计算时设定MLE阈值为150个光子。

结果

量子点表现出红色荧光，其最大发射波长（lambda max）约为 600 nm。^22,28 这种红色发射是由于激子被量子棒限制所致，其尺寸处于强限制区域。Li et al. 研究表明，对于量子棒，当棒的宽度或长度增加时，发射峰会向更低能量方向移动。他们进一步指出，发射特性主要由横向限制决定，即使在量子棒非常长的情况下，横向限制仍起着重要作用，特别是当其宽度小于相应材料的激子玻尔半径时，这正是强限制区域的特征。²⁹ 透射电子显微镜（TEM）成像显示了量子点的伸长形貌（长径比约为 2.5）。统计表明，量子点的平均长度为 12.6 nm ± 2.1 nm（n = 200）（图 1）。量子点溶液在冷藏条件下可稳定保存长达 3 个月。量子点的低倍率图像见补充信息（SI - 1）。

在包封过程中，硅胶样品在溶胀液中1小时后明显发生膨胀，尺寸最大达到15 mm × 15 ...

讨论

横截面荧光成像可实现对溶胀包埋过程中纳米颗粒的直接可视化。实验结果展示了包埋动力学过程，并显示出向高纳米颗粒表面浓度发展的趋势。纳米颗粒的包埋程度随溶胀包埋时间（见第2.3节）而变化，延长包埋时间可增加包埋的纳米颗粒总量；当使用聚合物样品时，纳米颗粒浓度主要集中于表面。纳米颗粒溶液浓度的变化（最高达3× 稀释，见第2.2节）表明，所包封颗粒的数量几乎没有变化。所用颗粒的溶胀包封行为（CdSe量子点， Ø - 12.6 ± 2.1 nm）也显示出与类似尺寸颗粒（二氧化钛， Ø - 13.1 ± 5.6 nm)²² 这表明该技术在进一步研究溶胀封装动力学方面具有潜在应用价值。实验中观察到的溶胀封装速率被认为对纳米颗粒尺寸敏感，因此任何尺寸变化都可能导致封装速率的改变。

在纳米复合材料中对纳米颗粒进行准确定量是许多研究团队面临的一项挑战。^1-3 虽然存在一些基本方法可用于确定材料的整体组成，但在评估局部纳米颗粒浓度或微米（甚至纳米）尺度上的浓度梯度时，复杂性显著增加。现有标准主要依赖于整体测量方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷片材	NuSil	-	医用级
油胺	Sigma Aldrich	O7805	工业级
三辛基膦	Sigma Aldrich	117854	工业级
三辛基氧化膦	Sigma Aldrich	346187	工业级
1-十八碳烯	Sigma Aldrich	O806	工业级
二乙基二硫代氨基甲酸锌	Sigma Aldrich	329703	-
油酸	Sigma Aldrich	364525	工业级
三乙胺	Sigma Aldrich	471283	-
氧化镉	Alfa Aesar	33235	-
十六胺	Alfa Aesar	B22459	工业级
1-十二烷基膦酸	Alfa Aesar	H26259	-
硒粉	Acros	19807	-
氯仿	Sigma Aldrich	366919	-
正己烷	Sigma Aldrich	208752	-
显微镜载玻片	VWR	631-0137	厚度1号