逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

摘要

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内 作为TCR转基因小鼠的替代方案。

摘要

T细胞受体（TCR）信号转导在胸腺内T细胞的发育以及在外周组织中T细胞的分化过程中均起着至关重要的作用。由于TCR种类极为多样，研究针对特定抗原的免疫应答变得十分困难。因此，人们构建了TCR转基因小鼠，用于研究胸腺中的阳性选择和阴性选择过程，以及外周T细胞的活化、增殖和耐受机制。然而，目前所构建的TCR转基因小鼠中，针对任一特定抗原的品系仍相对较少。因此，针对同一抗原肽但具有不同亲和力的TCR相关研究仍十分缺乏。构建一个新的TCR转基因小鼠品系通常需要六个月甚至更长时间，此外，若需进行特定的回交育种，还需额外耗时约六个月。为了实现对多个TCR的快速构建与筛选，研究人员建立了通过逆转录病毒转导骨髓细胞的技术方案，可实现TCRα与TCRβ链的化学计量比表达，并由此生成逆转录基因小鼠（retrogenic mice）。每只逆转录基因小鼠本质上均可视为一个独立的创始个体，从而几乎消除了创始者效应，同时将构建TCR逆转录基因小鼠的时间由六个月缩短至大约六周。本文介绍了一种快速且灵活的TCR转基因小鼠替代方案，该方法可在任意选定的遗传背景下表达任意特定的TCR。

引言

据估计，人类和小鼠的T细胞受体（TCR）库分别包含约1×10⁸和2×10⁶种独特的TCR^1,2。这种高度多样性使得T细胞能够识别由自身肽段以及由抗原呈递细胞（APC）上的主要组织相容性复合体（MHC）呈递的病原体来源的大量抗原表位。TCR与特异性肽-MHC复合物之间相互作用的细微差异决定了T细胞将经历凋亡、无能、活化、分化、细胞因子产生或细胞毒性等不同命运。然而，由于TCR库极为庞大，要分析某一特定TCR对特定抗原的应答，必须借助单个TCR系统。

为了在体内模型中研究单一T细胞受体（TCR）的功能，已构建了多种TCR转基因小鼠^3-9。然而，TCR转基因小鼠存在一些局限性，包括制备成本高、生成单个转基因小鼠所需时间长，以及外源基因随机插入生殖系DNA所导致的所谓“创始人效应”¹⁰。因此，针对任一特定抗原所构建的TCR转基因小鼠数量相对有限，且同一表位在高亲和力与低亲和力TCR之间的功能差异很少被系统研究。为满足快速筛选并单独或联合研究多个TCR的需求，研究人员已采用逆转录基因（“retro”源自逆转录病毒，“genic”源自转基因）小鼠作为TCR转基因小鼠的替代方案^11-13。

多种病毒中存在的2A肽共识基序为2A-Asp-Val/Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly....

方案

伦理声明：在照射和尾静脉注射过程中，将尽一切努力将动物的不适或应激降至最低。本实验使用小鼠作为细胞来源；因此，除安乐死外，不涉及其他操作或处理。小鼠将通过吸入 CO₂ 进行安乐死，随后实施颈椎脱位以确认死亡。该程序符合美国兽医医学协会安乐死专家组的建议。

1. 准备逆转录病毒载体

1. 将T细胞受体（TCR）α链和β链亚克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体中，两链之间由2A连接肽分隔¹¹ 载体（例如 pMIAII 或 pMIGII）¹¹.
   注意：2A连接肽可实现从单一开放阅读框中对TCR α链和β链进行化学计量比一致且协调的表达。该载体包含一个IRES荧光蛋白盒（ametrine或GFP），用于追踪转导细胞及转导效率。详细实验方案请参见Holst 等¹¹
2. 使用市售质粒DNA提取试剂盒或类似产品分离质粒DNA。工作浓度为1 - 2 μg/μl^-1.

2. 逆转录病毒生产细胞系的建立

1. 采用两步法生成逆转录病毒生产细胞系。
   注：详细方案请参阅 Holst et al.¹¹。
   1. 通过将三种质粒（pVSVG、pEQ-Pam3(-E) 和目的载体

结果

在将骨髓经尾静脉注射入体内之前，需在方案的第13.3步检测骨髓的转导效率。在代表性骨髓转导结果图（图1A）中，取约10 μl收获的骨髓加入100 μl PBS中，检测ametrine的表达情况。通常，荧光阳性细胞的比例介于25%至70%之间，具体数值取决于所用构建体及逆转录病毒滴度。骨髓移植6周后，采集小鼠外周血以评估骨髓重建情况（图1B）。取约25 μl外周血，经红细胞裂解后，使用抗TCRβ抗体进行染色。在图2B中，所有TCR阳性细胞均一致表达ametrine荧光蛋白。

讨论

在本方案中，我们详细说明了若干关键步骤，以确保骨髓健康、转导效率及重建效果达到最佳。第一个关键步骤是 GP+E86 病毒产生细胞的制备与妥善维护。应使用低代次的病毒产生细胞系，并在使用前保持其融合度不超过 80%。在制备新鲜的 GP+E86 病毒产生细胞时，需确保 293T 细胞处于低代次状态，并已在培养中生长 24 至 48 小时。在转导步骤中，若接种过多 GP+E86 细胞，将导致病毒滴度降低。病毒滴度的测定方法详见 Holst 等¹¹ 确保 GP+E86 具有强效的病毒产生能力。此外，从收获的骨髓中去除红细胞可提高转导效率。维持骨髓前体细胞的健康状态对本实验方案的成功至关重要。为此，务必使用新鲜培养基（添加胎牛血清后于 4 °C 保存不超过 4 周）和新鲜细胞因子（于 4 °C 保存不超过 2 周）。六甲溴铵（Hexadimethrine bromide）也易降解，配制成溶液后应每两个月重新配制一次。其他有助于维持骨髓细胞最佳健康状态和高效转导的细节包括：在进行离心转导前预热离心机；在 37 °C 条件下进行离心转导，并用封口膜包裹培养板以尽可能减少气体交换。此外，避免将骨髓细胞在 37 °.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM，高糖 + 谷氨酰胺	Corning Cellgro	10-013-CV	含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的伊格尔改良培养基 &和丙酮酸钠
FBS	Atlanta Biological	S11550
胰蛋白酶-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm 注射器滤器	赛默飞世尔科技	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	经 dH₂O 无菌过滤2O
环丙沙星	VWR	AAJ61970-06
5-氟尿嘧啶（5-FU）	VWR	AAA13456-06
丙酮酸钠	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM非必需氨基酸	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M 溶液	Corning Cellgro	25-060-CI
2-巯基乙醇	Gibco（隶属于 Life Technologies）	21985-023
青霉素/链霉素	Corning Cellgro	30-002-CI
L-谷氨酰胺	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm 组织培养皿	Greiner Bio-one	639160
组织培养处理的6孔平底板	Greiner Bio-one	657160
70 µm 尼龙细胞滤网	Falcon	352350
小鼠 IL-3	Invitrogen	PMC0033
人IL-6	Invitrogen	PHC0063
小鼠干细胞因子	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS 缓冲液	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml 注射器	BD	300912
BD 1 ml 注射器	BD	309659
27 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头	BD	305109
30 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头	BD	305106