我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体(TCR)快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞,以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内 作为TCR转基因小鼠的替代方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体(TCR)快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞,以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内 作为TCR转基因小鼠的替代方案。
T细胞受体(TCR)信号转导在胸腺内T细胞的发育以及在外周组织中T细胞的分化过程中均起着至关重要的作用。由于TCR种类极为多样,研究针对特定抗原的免疫应答变得十分困难。因此,人们构建了TCR转基因小鼠,用于研究胸腺中的阳性选择和阴性选择过程,以及外周T细胞的活化、增殖和耐受机制。然而,目前所构建的TCR转基因小鼠中,针对任一特定抗原的品系仍相对较少。因此,针对同一抗原肽但具有不同亲和力的TCR相关研究仍十分缺乏。构建一个新的TCR转基因小鼠品系通常需要六个月甚至更长时间,此外,若需进行特定的回交育种,还需额外耗时约六个月。为了实现对多个TCR的快速构建与筛选,研究人员建立了通过逆转录病毒转导骨髓细胞的技术方案,可实现TCRα与TCRβ链的化学计量比表达,并由此生成逆转录基因小鼠(retrogenic mice)。每只逆转录基因小鼠本质上均可视为一个独立的创始个体,从而几乎消除了创始者效应,同时将构建TCR逆转录基因小鼠的时间由六个月缩短至大约六周。本文介绍了一种快速且灵活的TCR转基因小鼠替代方案,该方法可在任意选定的遗传背景下表达任意特定的TCR。
据估计,人类和小鼠的T细胞受体(TCR)库分别包含约1×108和2×106种独特的TCR1,2。这种高度多样性使得T细胞能够识别由自身肽段以及由抗原呈递细胞(APC)上的主要组织相容性复合体(MHC)呈递的病原体来源的大量抗原表位。TCR与特异性肽-MHC复合物之间相互作用的细微差异决定了T细胞将经历凋亡、无能、活化、分化、细胞因子产生或细胞毒性等不同命运。然而,由于TCR库极为庞大,要分析某一特定TCR对特定抗原的应答,必须借助单个TCR系统。
为了在体内模型中研究单一T细胞受体(TCR)的功能,已构建了多种TCR转基因小鼠3-9。然而,TCR转基因小鼠存在一些局限性,包括制备成本高、生成单个转基因小鼠所需时间长,以及外源基因随机插入生殖系DNA所导致的所谓“创始人效应”10。因此,针对任一特定抗原所构建的TCR转基因小鼠数量相对有限,且同一表位在高亲和力与低亲和力TCR之间的功能差异很少被系统研究。为满足快速筛选并单独或联合研究多个TCR的需求,研究人员已采用逆转录基因(“retro”源自逆转录病毒,“genic”源自转基因)小鼠作为TCR转基因小鼠的替代方案11-13。
多种病毒中存在的2A肽共识基序为2A-Asp-Val/Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro,其中切割发生在2A的甘氨酸与2B的脯氨酸之间 顺式-作用水解酶活性,导致翻译过程中的核糖体跳跃10,14-16有关各种2A肽(F2A、E2A、T2A和P2A)切割机制的详细图示,请参见参考文献10–12。通过这种方式,可将两个顺反子(TCRα和TCRβ)连接,实现在单一载体中的化学计量比翻译。利用该方法,我们能够表达并直接比较多种抗原特异性的TCR。 在体.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
伦理声明:在照射和尾静脉注射过程中,将尽一切努力将动物的不适或应激降至最低。本实验使用小鼠作为细胞来源;因此,除安乐死外,不涉及其他操作或处理。小鼠将通过吸入 CO2 进行安乐死,随后实施颈椎脱位以确认死亡。该程序符合美国兽医医学协会安乐死专家组的建议。
1. 准备逆转录病毒载体
2. 逆转录病毒生产细胞系的建立
3. 逆转录病毒介导的干细胞基因转移(第 -5 天)
4. 向供体小鼠注射5-氟尿嘧啶(5-FU)(第 -3 天)
5. 骨髓提取步骤(第0天)
6. 骨髓培养(第0天)
7. 逆转录病毒生产细胞培养(第0天)
8. 慢病毒上清液(第1天)
9. 骨髓采集(第1天)
10. 骨髓转导(第1天)
11. 逆转录病毒上清液与转导(第2天)
12. 添加新鲜补充的DMEM(第3天)
13. 收获转导的骨髓(第4天)
14. 小鼠辐照、骨髓注射及护理
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在将骨髓经尾静脉注射入体内之前,需在方案的第13.3步检测骨髓的转导效率。在代表性骨髓转导结果图(图1A)中,取约10 μl收获的骨髓加入100 μl PBS中,检测ametrine的表达情况。通常,荧光阳性细胞的比例介于25%至70%之间,具体数值取决于所用构建体及逆转录病毒滴度。骨髓移植6周后,采集小鼠外周血以评估骨髓重建情况(图1B)。取约25 μl外周血,经红细胞裂解后,使用抗TCRβ抗体进行染色。在图2B中,所有TCR阳性细胞均一致表达ametrine荧光蛋白。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在本方案中,我们详细说明了若干关键步骤,以确保骨髓健康、转导效率及重建效果达到最佳。第一个关键步骤是 GP+E86 病毒产生细胞的制备与妥善维护。应使用低代次的病毒产生细胞系,并在使用前保持其融合度不超过 80%。在制备新鲜的 GP+E86 病毒产生细胞时,需确保 293T 细胞处于低代次状态,并已在培养中生长 24 至 48 小时。在转导步骤中,若接种过多 GP+E86 细胞,将导致病毒滴度降低。病毒滴度的测定方法详见 Holst 等11 确保 GP+E86 具有强效的病毒产生能力。此外,从收获的骨髓中去除红细胞可提高转导效率。维持骨髓前体细胞的健康状态对本实验方案的成功至关重要。为此,务必使用新鲜培养基(添加胎牛血清后于 4 °C 保存不超过 4 周)和新鲜细胞因子(于 4 °C 保存不超过 2 周)。六甲溴铵(Hexadimethrine bromide)也易降解,配制成溶液后应每两个月重新配制一次。其他有助于维持骨髓细胞最佳健康状态和高效转导的细节包括:在进行离心转导前预热离心机;在 37 °C 条件下进行离心转导,并用封口膜包裹培养板以尽可能减少气体交换。此外,避免将骨髓细胞在 37 °...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
未声明任何利益冲突。
本工作获得了以下资助:美国国立卫生研究院(NIH)(5K22A1119151-01 和 1R56DK104903-01)授予 M.L.B. 的基金、贝勒医学院糖尿病研究中心(P30-DK079638)的试点/可行性项目计划、JDRF 1-FAC-2014-243-A-N APF、美国糖尿病协会(ADA)1-15-JF-07、美国免疫学会免疫学职业奖学金授予 M.B. 的资助,以及罗伯特和简妮斯·麦克奈尔基金会的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM,高糖 + 谷氨酰胺 | Corning Cellgro | 10-013-CV | 含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的伊格尔改良培养基 &和丙酮酸钠 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| 胰蛋白酶-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm 注射器滤器 | 赛默飞世尔科技 | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | 经 dH₂O 无菌过滤2O |
| 环丙沙星 | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-氟尿嘧啶(5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| 丙酮酸钠 | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM非必需氨基酸 | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M 溶液 | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-巯基乙醇 | Gibco(隶属于 Life Technologies) | 21985-023 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-谷氨酰胺 | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm 组织培养皿 | Greiner Bio-one | 639160 | |
| 组织培养处理的6孔平底板 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm 尼龙细胞滤网 | Falcon | 352350 | |
| 小鼠 IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| 人IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| 小鼠干细胞因子 | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS 缓冲液 | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml 注射器 | BD | 300912 | |
| BD 1 ml 注射器 | BD | 309659 | |
| 27 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头 | BD | 305109 | |
| 30 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头 | BD | 305106 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。