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方法文章

用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

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DOI：

10.3791/54202

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2016年8月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

由肝素和鱼精蛋白制备的自组装聚电解质复合物（PEC）被沉积在海藻酸盐微珠上，用于包埋并调控成骨生长因子的释放。该递送策略可在脊柱融合应用中使BMP-2的剂量减少20倍。本文阐述了PECs的制备方法及其优势。

摘要

在重建性骨科手术中，通常凭经验将超生理剂量的生长因子加载到支架材料上，以促进骨融合成功。由于生长因子易受快速酶解而失活，且载体难以在植入部位局部维持足够浓度，因此需要使用大量高活性生物制剂。因此，若能采用可延长生长因子（如BMP-2/NELL-1）稳定性的策略，并实现其可控释放，则有望降低其有效剂量，从而减少未来骨再生手术中对高剂量生长因子的需求。这将相应减少副作用并降低生长因子的使用成本。已开发出自组装聚电解质复合物（PECs），通过肝素结合实现对BMP-2/NELL-1递送的更优控制，并通过增强生长因子的生物活性进一步提高其效能 体内 稳定性。在此，我们展示了PEC制备的简便性，这有助于在重建性骨科手术中递送多种生长因子。

引言

据报道，在退行性脊柱融合术和翻修脊柱手术中，假关节形成的发生率可高达10%至45%1。为了降低脊柱融合术及其他重建性骨科手术中假关节的发生率，已引入成骨生长因子（如BMP-2、Nell-11和血小板源性生长因子（PDGF））以促进新骨形成。其中，BMP-2是脊柱融合术中常用的选择2。尽管BMP-2在诱导和促进新骨形成方面的有效性已得到充分证实3，但由于临床使用剂量常超过生理水平，仍存在异位骨化、血清肿和血肿形成、炎症反应、神经根炎、椎体骨溶解以及逆行射精等具有临床意义的并发症，这些问题仍令人关注4,5。

因此，降低BMP-2的剂量仍是减少其副作用的相关策略。此外，需要高效的载体系统以抑制目前胶原海绵载体系统中观察到的BMP-2初始突释现象，并进一步增强这种强效细胞因子的持久性和局部递送效果。逐层自组装交替的阳离子和阴离子聚电解质可作为一种可调控的方法，在支架基质或可植入材料表面构建聚电解质复合物6。在这方面，肝素（因其具有所有生物分子中最高的负电荷密度）已被证实可通过静电作用及肝素结合结构域与多种生长因子高亲和力结合。事实上，已有研究显示肝素可延长多种生长因子的半衰期，从而增强其生物活性。

基于此，本课题组采用逐层自组装方法构建了一种基于肝素的聚电解质复合物（PEC），可在固定过程中负载并保持成骨生长因子的生物活性7,8。海藻酸盐微球核心通过海藻酸中的α-L-古洛糖醛酸（G）残基与二价钙离子或锶离子交联而制备。该海藻酸盐核心是一种可生物降解的支架基质；植入后，该基质在融合区域被吸收，从而为骨组织长入腾出空间。聚-L-赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白作为阳离子层，可同时与支架基质（本例中为海藻酸盐微球载体核心）及带负电荷的肝素相互交联；而阴离子型肝素层则起到稳定和定位负载生长因子的作用。在猪模型中已证实，这种三层结构的PEC可提高生长因子的负载能力9。近期研究显示，在大鼠10和猪的脊柱融合模型8中，PEC载体可成功将BMP-2的有效剂量至少降低20倍。

本文报道了利用BMP-2作为成骨生长因子模型，制备用于脊柱融合及其他重建性骨科手术中增强生长因子递送的PECs的方法。

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方案

1. 海藻酸钠溶液的制备

  1. 将200 mg非辐照海藻酸钠或400 mg 8 MRad辐照海藻酸钠溶于10 ml双蒸水中，非辐照海藻酸钠溶液摇晃1小时，辐照海藻酸钠溶液摇晃15分钟。将海藻酸钠溶液在4 °C下静置过夜。在制备海藻酸微珠前，使用无菌0.2 µm注射器滤器过滤海藻酸钠溶液。

2. 藻酸盐微珠的制备

  1. 用70%乙醇对静电微珠发生器和注射泵进行消毒，并将其置于II级生物安全柜中（图1）。
  2. 在微珠发生器内放置一个带有磁力搅拌子的玻璃烧杯。
  3. 将微珠发生器的臂电极设置在烧杯上方9 cm处。
  4. 将微珠发生器的电极电缆连接至臂电极的滚花螺钉2，并向烧杯中倒入80 ml的SrCl2溶液。
  5. 将5 ml经过0.2 µm滤膜过滤的海藻酸钠溶液装入注射器和橡胶管中。将橡胶管连接至臂电极后，以5 ml/hr的流速启动注射泵运行2分钟，以排出管路中的空气并将海藻酸钠溶液输送至喷嘴末端。随后关闭注射泵。
  6. 接着，先开启包埋装置，再启动注射泵以开始微珠的生成。将海藻酸钠的流速设定为5 ml/hr，包埋装置的电压设定为5.8 kV。弃去前两分钟内（或注射器中最初泵出的0.5 ml海藻酸钠溶液）生成的微珠，因为这些微珠通常尺寸和形状不规则。
  7. 将后续生成的微珠收集至0.2 M氯化锶溶液中。在泵入预定体积的海藻酸钠溶液后，依次关闭注射泵和包埋装置（顺序不可颠倒）。重复上述步骤以制备后续批次的微珠。全部完成后，先关闭注射泵，再关闭包埋装置。
  8. 将微珠置于20 ml的0.2 M氯化锶溶液中，4 °C下保存过夜，以完成交联并稳定凝胶结构。

3. 藻酸盐微珠的尺寸测量

  1. 用塑料移液管收集 0.5 ml 海藻酸盐微珠，置于玻璃载玻片上。在光学显微镜下以 10 倍物镜观察微珠。使用显微镜 CCD 相机拍摄 10 张微珠图像。以 2,048 × 1,536 分辨率将图像保存为带比例尺（500 µm）的 TIFF 格式。
  2. 使用 ImageJ 中的长度测量工具，测量微珠和比例尺的尺寸（图 2）。将微珠长度从像素单位转换为微米单位。
    1. 点击直线工具，在海藻酸盐微珠的中点画一条线。
    2. 点击菜单栏中的“Analyze”（分析），选择“Measure”（测量），弹出窗口将出现。
    3. 重复步骤 3.2.1–3.2.2，测量图像中所有海藻酸盐微珠的尺寸，并测量图像中的比例尺长度。
    4. 使用以下公式将海藻酸盐微珠的直径转换为实际长度：海藻酸盐微珠长度 / 比例尺长度 × 500 µm。例如，1.420（ImageJ 测得的直径）/ 2.657（ImageJ 测得的比例尺长度）× 500 µm = 267 µm。
  3. 将 100 个微珠的平均尺寸（均值 ± 标准差）作为每批微珠的代表性尺寸。

4. 灭菌

  1. 使用 100 µm 尼龙滤网收集微珠，并用双蒸水清洗微珠。
  2. 用刮勺将由 0.1 ml 海藻酸盐溶液制成的全部微珠转移至 2 ml 微离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。
  3. 最后，采用液体模式（115 °C，15 分钟）高压灭菌或按照制造商说明书对微珠进行灭菌处理。向灭菌室中加入 1.5 L 蒸馏水以防止微珠干燥。

5. 鱼精蛋白和肝素包被

  1. 在BSL-2生物安全柜内，将无菌微珠与1 ml浓度为2 mg/ml的鱼精蛋白溶液（使用0.2 µm注射器滤器灭菌）在室温下孵育1小时。
  2. 微珠孵育1小时后（步骤5.1），取150 µl鱼精蛋白溶液用于微量双辛酮酸（microBCA）检测（第6节）。
  3. 用双蒸水将包被鱼精蛋白的微珠清洗两次。在室温下，使用台式离心机以200 × g离心3分钟。离心后，用注射器吸除上清液。
  4. 将包被鱼精蛋白的微珠与1 ml浓度为0.5 mg/ml的肝素溶液（使用0.2 µm注射器滤器灭菌）孵育30分钟，以形成聚电解质复合物（PEC）。
  5. 包被鱼精蛋白的微珠孵育30分钟后（步骤5.4），取400 µl肝素溶液用于测定肝素含量（第7节）。
  6. 孵育结束后，用双蒸水清洗两次，以去除PEC上未结合的肝素。

6. 鱼精蛋白含量

  1. 根据制造商说明书进行微BCA检测。简言之，将150 µl 鱼精蛋白溶液（与微珠孵育前、后收集的）加入96孔板中，再加入150 µl 微BCA工作液。
  2. 使用浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、40和200 µg/ml的白蛋白溶液作为校准标准品。
  3. 在60 °C下孵育混合物60分钟，用分光光度计在562 nm处测定吸光度。
  4. 根据制造商说明书，利用标准曲线确定各未知样品的鱼精蛋白浓度。
  5. 通过从孵育前包被溶液中的总鱼精蛋白量中减去孵育后包被溶液中残留的鱼精蛋白量，计算微珠上的鱼精蛋白含量。

7. 肝素含量

  1. 通过将4 mg甲苯胺蓝和20 mg氯化钠溶解于10 ml 0.01 N盐酸中，制备工作溶液。
  2. 按2:3的比例向工作溶液中加入400 µl样品（来自步骤5.5），涡旋混匀30秒。
  3. 加入600 µl正己烷（与工作试剂溶液体积相等），涡旋混合物以萃取甲苯胺蓝-肝素复合物。
  4. 相分离后，用注射器吸取200 µl水相。
  5. 使用分光光度计在631 nm处测定水相中未被萃取的甲苯胺蓝含量。
  6. 配制浓度为0–20 µg/ml的肝素标准溶液。
  7. 以各肝素标准品在631 nm处的吸光度值对肝素浓度（µg/ml）作图，绘制标准曲线，并利用该曲线确定各样品的肝素浓度。

8. 逐层结构的共聚焦图像

  1. 根据制造商提供的技术说明书，制备鱼精蛋白、肝素和 NELL-1/BMP-2 的荧光类似物：CF-405 鱼精蛋白（蓝色）、CF 594 肝素（红色）以及 FITC 标记的 NELL-1/FITC 标记的（绿色）BMP-2 + 肝素 + 鱼精蛋白。
  2. 采用 5.3–5.6 节所述的包被方法，用 300 µl 荧光类似物对 100 µg 微珠进行包被：CF-405 鱼精蛋白（蓝色）（2 mg/ml，孵育 1 小时）、CF 594 肝素（红色）（0.5 mg/ml，孵育 30 分钟）和 FITC 标记的 NELL-1/FITC 标记的（绿色）BMP-2（1.5 mg/ml，过夜孵育）。用蒸馏水洗涤微珠两次，以去除未结合的荧光鱼精蛋白、肝素和 NELL-1/BMP-2。
  3. 使用共聚焦显微镜在 10X 放大倍数下观察逐层结构（图 3）。7

9. BMP-2 与 NELL-1 的摄取与释放

  1. 将 13.3 µl 的 1.5 mg/ml BMP-2 或 NELL-1 溶液加载到 100 µg 的 PEC 上。在 4 °C、30 rpm 振荡条件下孵育 PEC 10 小时。
  2. 将微珠浸入 1 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在 37 °C 下以恒定振荡（30 rpm）进行处理。
  3. 在第 1、3、6、10 和 14 天时，收集 1 ml 上清液，并替换为 1 ml 新鲜 PBS。
  4. 根据制造商说明书，采用 ELISA 方法评估 BMP-2 的结合与释放效率；根据制造商说明书，采用羧基苯并喹啉-2-甲醛（CBQCA）蛋白测定法评估 NELL-1 的结合与释放效率。
  5. 确定时间（t）时的累积释放量：
    时间（t）时的累积释放量 = 时间（t）时的释放量 + 之前时间（t-1）时的释放量。
  6. 绘制 BMP-2 和 NELL-1 的累积释放量随时间变化的曲线图。

10. 体外 NELL-1 的生物活性

注意：通过检测从PEC释放的NELL-1增强兔骨髓间充质干细胞（rBMSC）碱性磷酸酶（ALP）表达的能力，评估其生物活性。

  1. 在24孔板中每孔接种20,000个rBMSCs，加入1 ml含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），培养一天 37 °C 和5% CO2.
  2. 24 小时后，将培养基更换为 1 ml 成骨诱导培养基（DMEM 添加 10% FBS、2% 青霉素-链霉素） 50 µg/ml 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10-8 mol/L 地塞米松）中培养 7 天 37 °C 和5% CO2.
  3. 放置 300 µg PEC-NELL-1（来自步骤8.2）和细胞培养插件（TC insert）内的PEC，以使PEC与细胞分离（此举可避免成骨诱导培养基更换过程中PEC微珠被洗脱）。将TC插件置于24孔板中培养14天。
  4. 每三天一次，将针头置于TC插件外，吸出1 ml成骨诱导培养基，并加入1 ml新鲜的成骨诱导培养基。
  5. 孵育7天和14天后，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒制造商提供的说明书，使用该试剂盒测定ALP活性。
    1. 使用含 0.1% TritonX-100 的检测缓冲液裂解细胞 4 °C 10分钟。使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。将细胞悬液于 4 °C 在振荡条件下反应至少60分钟。
    2. 将细胞悬液在 2,500 x g 条件下离心 4 °C 孵育10分钟。收集上清液用于碱性磷酸酶（ALP）检测。
    3. 添加 50 µl 将碱性磷酸酶标准品溶液从200至0 ng/ml进行系列稀释后加入96孔板的各孔中。每孔中碱性磷酸酶标准品的最终含量分别为10、5、2.5、1.2、0.6、0.3、0.15和0 ng/孔。
    4. 加入第10.5.2步的上清液（50 µl/well）并用稀释缓冲液稀释。
    5. 添加 50 µl 的 p将对硝基苯磷酸酯（pNPP）底物溶液加入各孔中。轻轻振荡酶标板30秒以混匀试剂。避光孵育30分钟。使用酶标仪在405 nm处测定吸光度。
    6. 使用标准曲线计算 ALP 活性。
  6. 使用 microBCA 蛋白检测试剂盒，按照制造商说明书测定蛋白含量。通过将碱性磷酸酶（ALP）活性除以蛋白含量，对 ALP 活性进行归一化处理。

11. 细胞活力

  1. 将 200 mg PEC-NELL-1 与 1 ml DMEM +10% FBS 在 37 °C 下孵育 24 小时，用于 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测。
  2. 在 96 孔板中每孔接种 2,000 个 rBMSCs（含 10% FBS 的 100 µl DMEM），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 天。
  3. 将 DMEM + 10% FBS 替换为 100 µl PEC-NELL-1/PEC 提取物，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育。
  4. 孵育 1 天或 3 天后，每孔加入 10 µl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT 溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下避光继续孵育 4 小时。
  5. 向每孔加入 100 µl DMSO 溶液以溶解甲臜结晶。
  6. 使用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度。
  7. 计算相对生长率：
    相对生长率公式，吸光度比值，细胞暴露分析，生物学实验。

12. 支架材料的包封及 BMP-2 与 NELL-1 的负载

  1. 在 BSL-2 操作舱内，使用无菌刮刀将 PEC 填充至可生物降解的医用级聚己内酯-三钙磷酸盐（mPCL-TCP）支架的孔隙中。
  2. 将 BMP-2 或 NELL-1 溶液（浓度为 1.5 mg/ml）加入已填充 PEC 的 mPCL-TCP 支架中，并于 4 °C 下孵育过夜。

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结果

在我们的载体中，选用鱼精蛋白替代聚-L-赖氨酸，因其具有相似的化学性质，且已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为肝素的解毒剂。光学显微镜结果显示，未辐照的微珠呈球形，直径为 267 ± 14 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速 5 ml/hr，电压 5.8 kV）。大多数经辐照的微珠呈泪滴状。在辐照微珠的圆形部分测得的直径为 212 ± 30 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速 4 ml/hr，电压 6 kV）。（图4）。

PEC微球的共聚焦图像显示了逐层包覆的CF-405标记鱼精蛋白（蓝色）、CF594标记肝素（红色）以及FITC-BMP-2/FITC-NELL-1（绿色）。结果表明，PEC可通过肝素结合域与带正电荷的BMP-2和带负电荷的NELL-1结合（图5）。这说明PEC与成骨生长因子之间的相互作用不依赖于电荷。

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讨论

本方案介绍了一种通过逐层自组装法制备聚电解质复合物（PECs）的方法。利用鱼精蛋白、肝素、BMP-2 和 NELL-1 的荧光类似物，并结合共聚焦显微镜，对逐层结构进行可视化观察。摄取与释放实验表明，PEC 上的肝素可介导成骨生长因子的摄取与释放。该 PEC 方法的摄取效率为：NELL-1：86.7 ± 2.7%，BMP-2：70.5 ± 3.1%。与纯表面吸附载体（如磷酸钙磷灰石颗粒，释放率为 40–80%）相比，PEC 载体对 NELL-1 的释放具有更优的调控能力（释放率为 20%）11。

除了调节释放外，肝素还可中和多聚阳离子（如鱼精蛋白）过量的正电荷，以避免与细胞毒性相关的不良问题12。通过MTT法和Alamar Blue法检测，PEC未表现出任何细胞毒性迹象7。碱性磷酸酶（ALP）检测显示，PEC载体能够维持NELL-1和BMP-2两者的生物活性。尽管PEC最初是为脊柱融合手术中成骨生长因子BMP-2的治疗而开发，但它也可负载其他具有肝素结合结构域的生长因子，如NELL-1和PDGF-BB。与其他递送方法...

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披露

我们不存在利益冲突。

致谢

这些研究由新加坡国家医学研究理事会临床科学家个人研究基金（CS-IRG）NMRC/CIRG/1372/2013 和 NMRC EDG/0022/2008 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生命科学 Acrodisc 25 毫米，0.2 微米注射器滤器 µm Supor 膜PALL PN4612无菌鱼精蛋白，通过超滤的肝素溶液
24孔板细胞星 662160
96孔板 Nunc Delta表面Thermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)，MTTSigma AldrichM5655测量 PEC-NELL-1 的细胞毒性
丙酮Fisher ScientificA/0600/17沉淀 CF-405
标记的鱼精蛋白
Alamar BlueInvitrogen，Life TechnologiesDAL 1025测定 PEC-BMP-2 的细胞毒性
碱性磷酸酶检测（ALP）试剂盒AnaspecAS-72146
氯化铵默克艺术 1145FITC标记中的终止试剂
无水二甲基亚砜（DMSO）Invitrogen, Life TechnologiesD12345荧光素异硫氰酸酯的溶剂 I
二甲基亚砜（DMSO）Sigma Aldrich溶解  甲臜 
高压灭菌HirayamaHU-110通过蒸汽对海藻酸盐微珠进行灭菌
β-甘油磷酸钠Sigma AldrichG9422
BMP-2（Infuse 骨移植大剂量 II 套件） Medtronic Sofamor Danek，美国田纳西州孟菲斯7510800成骨生长因子，需要透析以去除会干扰FITC偶联的稳定剂成分
羧基苯甲酰基喹啉-2-甲醛（CBQCA） Thermo Fisher ScientificA-6222定量 NELL-1 蛋白
细胞筛（100 µm)BD Science352360用于碱性磷酸酶检测的Pec样品
细胞刮刀 290 毫米 宽刀片 20 毫米SPL Life Science90030从24孔板中分离细胞
CF 405S，琥珀酰亚胺酯Sigma AldrichSCJ4600013用于鱼精蛋白标记的蓝色荧光染料
CF 594，酰肼Sigma AldrichSCJ4600031用于肝素标记的深红色荧光染料
离心Beckman CoulterMicrofuge 22R
共聚焦显微镜Olympus FV1000
地塞米松Sigma AldrichD4902成骨生长培养基组分
葡聚糖脱盐柱Pierce（Thermo Scientific） 43230
DMEMGibco 12320
BMP-2 Quantikine ELISA 试剂盒R&D系统DBP200测定 BMP-2 释放
胎牛血清 FBSHycloneSV30160.03
异硫氰酸荧光素，异构体 ISigma AldrichF7250用于 NELL-1 和 BMP-2 标记的绿色荧光染料
ThinCert 细胞培养小室
24孔板，无菌		Greiner 662630防止更换成骨培养基时PEC被冲走
哈佛仪器注射泵（11 plus）Havard Apparatus70-2208
正己烷（n-Hexane）>99%)Sigma Aldrich139386
肝素Sigma AldrichH3149与成骨相关的结合
具有肝素结合结构域的生长因子
盐酸（37%）默克100317强腐蚀性
培养箱结合剂C8150
MicroBCA 蛋白定量检测试剂盒赛默飞世尔科技23235
微孔板读板仪TecanInfinite M200用于 ALP 和 microBCA 检测
Nisco 细胞封装仪Nisco Engineering Inc封装单元 VAR V1
荧光显微镜奥林巴斯IX71
mPCL-TCP支架（孔径为1.3 毫米OsteoporePCL-TCP 0/90保留 PEC 体内 研究
青霉素-链霉素 10,000 单位/毫升, 100 毫升Hyclone 细胞培养SV30010抗生素
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）VivantisPB0344-1L10倍浓度溶液，超纯级
聚-L-赖氨酸 MW 15,000-30,000Sigma AldrichP2568多阳离子
硫酸鱼精蛋白盐，源自鲑鱼Sigma AldrichP4020聚阳离子
沙克器LabnetS2025
Snakeskin透析管，3,500分子量截留值，22 毫米 × 35 英尺赛默飞世尔科技68035通过透析去除未反应的FITC
氯化钠默克1.06404.1000
氢氧化钠QrecS5158
碳酸氢钠US BiologicalS4000缓冲液
碳酸钠Sigma AldrichS7795-500G缓冲液
六水合氯化锶Sigma Aldrich255521海藻酸盐交联剂
刮勺3dia
5 ml 注射器Terumo140425R注射器直径影响流速
75 cm2 细胞培养锥形瓶康宁730720
甲苯胺蓝Sigma Aldrich52040肝素检测
胰蛋白酶 1xHyclone 细胞培养SH30042.01
海藻酸钠Novamatrix（FMC Biopolymer，美国新泽西州普林斯顿）Pronova UPMVG微珠的核心材料

参考文献

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海藻酸盐微珠共聚焦显微镜碱性磷酸酶检测骨形态发生蛋白NELL样分子鱼精蛋白-肝素包被氯化锶溶液
用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物
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