用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

摘要

由肝素和鱼精蛋白制备的自组装聚电解质复合物（PEC）被沉积在海藻酸盐微球上，用于包埋并调控成骨生长因子的释放。该递送策略可在脊柱融合应用中使BMP-2剂量减少20倍。本文阐述了PECs的优势及其制备方法。

摘要

在重建性骨科手术中，通常会凭经验将超生理剂量的生长因子加载到支架材料上，以促进骨融合的成功。由于生长因子易受快速酶解而失活，且载体难以在植入部位有效富集足够浓度的生长因子，因此必须使用大剂量高活性的生物制剂。因此，若能采用可延长生长因子（如BMP-2/NELL-1）稳定性的策略，并实现其可控释放，则有望降低其有效剂量，从而减少未来骨再生手术中对高剂量生长因子的需求。这将相应地降低副作用发生率及生长因子的使用成本。已开发出自组装聚电解质复合物（PECs），通过肝素结合实现对BMP-2/NELL-1递送的更优控制，并通过增强生长因子的生物活性进一步提高其效能 体内 稳定性。在此，我们展示了PEC制备的简便性，这有助于在重建性骨科手术中递送多种生长因子。

引言

在退行性脊柱融合术和翻修脊柱手术中，假关节形成的发生率据报道可高达10%至45%¹。为了降低脊柱融合术及其他重建性骨科手术中假关节的发生率，已引入成骨生长因子，如BMP-2、Nell-1¹和血小板源性生长因子（PDGF），以促进新骨形成。其中，BMP-2是脊柱融合术中常用的选择²。尽管BMP-2在诱导和促进新骨形成方面的有效性已得到充分证实³，但由于使用剂量远超生理水平，临床上仍存在诸多显著并发症，如异位骨形成、血清肿和血肿形成、炎症反应、神经根炎、椎体骨溶解以及逆行射精，这些问题仍令人担忧^4,5。

因此，降低BMP-2的剂量仍是减轻其副作用的相关策略。此外，需要高效的载体系统以抑制目前胶原海绵载体系统中观察到的BMP-2初始突释现象，并进一步增强该强效细胞因子的持久性和局部递送效果。逐层自组装交替的阳离子和阴离子聚电解质可作为一种可调控的方法，在支架基质或可植入材料表面构建聚电解质复合物⁶。在这方面，肝素（因其具有所有生物分子中最高的负电荷密度）已被证实可通过静电作用及肝素结合结构域与多种生长因子高亲和力结合。事实上，已有研究显示肝素可延长多种生长因子的半衰期，从而增强其生物活性。

基于此，我们课题组改进了一种逐层自组装方法，用于制备一种基于肝素的聚电解质复合物（PEC），可在固定过程中负载并保持成骨生长因子的生物活性^7,8。海藻酸盐微球核心通过海藻酸中的α-L-古洛糖醛酸（G）残基与二价钙离子或锶离子交联而成。该海藻酸盐核心是一种可生物降解的支架基质；植入后，该基质在融合床中被吸收，为骨组织长入腾出空间。聚-L-赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白作为阳离子层，与支架基质（本例中为海藻酸盐微球载体核心）以及带负电荷的肝素相互交联；而阴离子肝素层则起到稳定和定位负载生长因子的作用。在猪模型中已证实，这种三层结构的PEC可提高生长因子的负载能力⁹。最近的研究表明，在大鼠¹⁰和猪的脊柱融合模型⁸中，PEC载体可成功将BMP-2的有效剂量至少降低20倍。

本文报道了利用BMP-2作为成骨生长因子模型，制备用于脊柱融合及其他重建性骨科手术中增强生长因子递送的PECs的方法。

方案

1. 海藻酸钠溶液的制备

1. 将200 mg非辐照海藻酸钠或400 mg 8 MRad辐照海藻酸钠溶于10 ml双蒸水中，非辐照海藻酸钠摇动1小时，辐照海藻酸钠摇动15分钟。将海藻酸钠溶液在4 °C下保存过夜。在制备海藻酸微珠前，使用无菌的0.2 µm注射器滤器过滤海藻酸钠溶液。

2. 藻酸盐微珠的制备

1. 使用70%乙醇对静电微珠发生器和注射泵进行消毒，并将其置于II级生物安全柜中（图1）。
2. 在微珠发生器内放置一个带有磁力搅拌子的玻璃容器。
3. 将微珠发生器的电极臂设置在容器上方9 cm处。
4. 将微珠发生器的电极电缆连接至电极臂的滚花螺钉2，并向容器中加入80 ml的SrCl₂溶液。
5. 将5 ml经过0.2 µm滤膜过滤的海藻酸钠溶液装入注射器和橡胶管中。将橡胶管连接至电极臂后，启动注射泵，流速设为5 ml/hr，运行2分钟以排出管路中的空气，并将海藻酸钠溶液输送至喷嘴尖端。随后关闭注射泵。
6. 接着，先开启包埋仪，再启动注射泵以开始微珠生成。在包埋仪上将海藻酸钠的流速设为5 ml/hr，电压设为5.8 kV。弃去最初两分钟内生成的微珠（或注射器中最初泵出的0.5 ml海藻酸钠溶液所形成的微珠），因为这些微珠通常尺寸和形状不规则。
7. 将后续生成的微珠收集至0.2 M氯化锶溶液中。在泵入预定体积的海藻酸钠溶液后，按顺序先关闭注射泵，再关闭包埋仪。后续批次的微珠制备重复此步骤。全部完成后，应先关闭注射泵，再关闭包埋仪。
8. 将微珠置于20 ml的0.2 M氯化锶溶液中，于4 °C下保存过夜，以完成交联并稳定凝胶结构。

3. 海藻酸盐微珠的尺寸测量

1. 用塑料移液管收集 0.5 ml 海藻酸盐微珠，置于玻璃载玻片上。在光学显微镜下以 10 倍物镜观察微珠。使用显微镜 CCD 相机拍摄 10 张微珠图像。以 TIFF 格式保存图像，分辨率设为 2,048 × 1,536，并包含比例尺（500 µm）。
2. 使用 ImageJ 中的长度测量工具，测量微珠及比例尺的尺寸（图 2）。将微珠的像素长度转换为微米。
   1. 点击直线工具，在海藻酸盐微珠的中点画一条直线。
   2. 点击菜单栏中的“Analyze”（分析），选择“Measure”（测量），弹出窗口将出现。
   3. 重复步骤 3.2.1–3.2.2，测量图像内所有海藻酸盐微珠的尺寸，并测量图像中的比例尺长度。
   4. 使用以下公式将海藻酸盐微珠的直径转换为实际长度：海藻酸盐微珠长度 / 比例尺长度 × 500 µm。例如，1.420（ImageJ 测得的直径）/ 2.657（ImageJ 测得的比例尺长度）× 500 µm = 267 µm。
3. 将 100 个微珠的平均尺寸（均值 ± 标准差）作为每批微珠的代表性尺寸。

4. 灭菌

1. 使用100 µm尼龙滤网收集微珠，并用双蒸水洗涤微珠。
2. 用刮勺将由0.1 ml海藻酸钠溶液制备的全部微珠转移至2 ml微量离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。
3. 最后，采用液体模式高压灭菌（115 °C，15分钟）或按照制造商说明对微珠进行灭菌处理。向灭菌室中加入1.5 L蒸馏水，以防止微珠干燥。

5. 鱼精蛋白和肝素包被

1. 在BSL-2生物安全柜内，将无菌微珠与1 ml浓度为2 mg/ml的鱼精蛋白溶液（经0.2 µm注射器滤器灭菌）在室温下孵育1小时。
2. 微珠孵育1小时后（步骤5.1），收集150 µl鱼精蛋白溶液用于微量双辛可宁酸（microBCA）检测（第6节）。
3. 用双蒸水将包被鱼精蛋白的微珠清洗两次。在室温下以200 × g离心3分钟。离心后，用注射器吸除上清液。
4. 将包被鱼精蛋白的微珠与1 ml浓度为0.5 mg/ml的肝素溶液（经0.2 µm注射器滤器灭菌）孵育30分钟，以形成聚电解质复合物（PEC）。
5. 包被鱼精蛋白的微珠孵育30分钟后（步骤5.4），收集400 µl肝素溶液用于测定肝素含量（第7节）。
6. 孵育结束后，用双蒸水清洗两次，以去除PEC上未结合的肝素。

6. 鱼精蛋白含量

1. 按照制造商说明书进行微BCA检测。简而言之，将150 µl 鱼精蛋白溶液（与微珠孵育前、后收集）加入96孔板中，再加入150 µl 微BCA工作液。
2. 使用浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、40和200 µg/ml的白蛋白溶液作为校准标准品。
3. 在60 °C下孵育混合物60分钟，使用分光光度计在562 nm波长处测定吸光度。
4. 根据制造商说明书，利用标准曲线确定各未知样品的鱼精蛋白浓度。
5. 通过从与微珠孵育前包被液中的总鱼精蛋白量中减去与微珠孵育后包被液中残留的鱼精蛋白量，计算微珠上的鱼精蛋白含量。

7. 肝素含量

1. 通过将 4 mg 甲苯胺蓝和 20 mg 氯化钠溶解于 0.01 N 盐酸中，配制 10 ml 工作溶液。
2. 按 2:3 的比例将 400 µl 样品（来自步骤 5.5）加入工作溶液中，并涡旋振荡 30 秒。
3. 加入 600 µl 正己烷（与工作试剂溶液体积相等），涡旋混合以萃取甲苯胺蓝-肝素复合物。
4. 相分离后，用注射器吸取 200 µl 水相。
5. 使用分光光度计在 631 nm 处测定水相中未被萃取的甲苯胺蓝含量。
6. 配制浓度为 0–20 µg/ml 的肝素标准溶液。
7. 以各肝素标准品在 631 nm 处的吸光度值对肝素浓度（µg/ml）作图，绘制标准曲线，并利用该曲线确定各样品的肝素浓度。

8. 逐层结构的共聚焦图像

1. 根据制造商提供的技术说明书，制备鱼精蛋白、肝素以及NELL-1/BMP-2的荧光类似物：CF-405标记的鱼精蛋白（蓝色）、CF 594标记的肝素（红色）以及FITC标记的NELL-1/FITC标记的（绿色）BMP-2 + 肝素 + 鱼精蛋白。
2. 采用5.3–5.6节所述的包被方法，用300 µl荧光类似物对100 µg微珠进行包被：CF-405标记的鱼精蛋白（蓝色，2 mg/ml，孵育1小时）、CF 594标记的肝素（红色，0.5 mg/ml，孵育30分钟）以及FITC标记的NELL-1/FITC标记的（绿色）BMP-2（1.5 mg/ml，过夜孵育）。用蒸馏水洗涤微珠两次，以去除未结合的荧光标记鱼精蛋白、肝素和NELL-1/BMP-2。
3. 使用共聚焦显微镜在10倍放大倍数下观察逐层结构（图3）。⁷

9. BMP-2 和 NELL-1 的摄取与释放

1. 将13.3 µl浓度为1.5 mg/ml的BMP-2或NELL-1溶液加载到100 µg的PEC上。在4 °C、30 rpm振荡条件下孵育10小时。
2. 将微珠浸入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37 °C下持续振荡（30 rpm）。
3. 在第1、3、6、10和14天时，收集1 ml上清液，并替换为1 ml PBS。
4. 根据制造商说明书，采用ELISA方法评估BMP-2的负载与释放效率；根据制造商说明书，采用羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛（CBQCA）蛋白检测试剂盒评估NELL-1的负载与释放效率。
5. 确定时间（t）时的累积释放量：
   时间（t）时的累积释放量 = 时间（t）时的释放量 + 前一时间点（t-1）的释放量。
6. 绘制BMP-2和NELL-1的累积释放量随时间变化的曲线图。

10. NELL-1 的体外生物活性

注意：通过检测NELL-1促进兔骨髓间充质干细胞（rBMSC）碱性磷酸酶（ALP）表达的能力，评估其从PEC中释放后的生物活性。

1. 每孔接种20,000个rBMSCs于24孔板中，加入1 ml含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在37 °C、5% CO₂条件下培养一天₂.
2. 24小时后，将培养基更换为1 ml成骨诱导培养基（DMEM添加10% FBS、2%青霉素-链霉素、50 µg/ml抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10^-8 mol/L 地塞米松）中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 7 天₂.
3. 将300 µg PEC-NELL-1（来自步骤8.2）和PEC置于细胞培养插入式小室（TC insert）内，以使PEC与细胞分离（此举可避免成骨诱导培养基更换过程中PEC微珠被洗脱）。将TC insert放入24孔板中，培养14天。
4. 每三天一次，将针头置于TC小室外部，吸出1 ml成骨诱导培养基，并加入1 ml新鲜成骨诱导培养基。
5. 孵育7天和14天后，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒的制造商说明书，使用ALP检测试剂盒测定ALP活性。
   1. 在 4 °C 下，用含有 0.1% TritonX-100 的检测缓冲液裂解细胞，孵育 10 分钟。使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。将细胞悬液在 4 °C 下振荡孵育至少 60 分钟。
   2. 在 4 °C 条件下以 2,500 x g 离心 10 分钟，离心细胞悬液。收集上清液用于碱性磷酸酶（ALP）检测。
   3. 向96孔板的各孔中加入50 µl浓度从200至0 ng/ml梯度稀释的碱性磷酸酶标准品溶液。碱性磷酸酶标准品的最终含量分别为10、5、2.5、1.2、0.6、0.3、0.15和0 ng/孔。
   4. 加入第10.5.2步的上清液（50 µl/孔），并用稀释缓冲液稀释。
   5. 加入 50 µl 的 p向每孔中加入对硝基磷酸苯酯（pNPP）底物溶液。轻轻振荡酶标板30秒以混匀试剂。避光孵育30分钟。使用酶标仪在405 nm处测定吸光度。
   6. 使用标准曲线计算碱性磷酸酶（ALP）活性。
6. 使用 microBCA 蛋白检测试剂盒，按照制造商说明书测定蛋白含量。通过将碱性磷酸酶（ALP）活性除以蛋白含量，对 ALP 活性进行标准化。

11. 细胞活力

1. 将200 mg PEC-NELL-1与1 ml DMEM +10% FBS在37 °C下孵育24小时，用于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测。
2. 在96孔板中每孔接种2,000个rBMSCs（含100 µl含10% FBS的DMEM），于37 °C、5% CO₂条件下孵育1天。
3. 将DMEM + 10% FBS更换为100 µl PEC-NELL-1/PEC提取物，并在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育。
4. 孵育1天或3天后，每孔加入10 µl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，在37 °C、5% CO₂条件下避光继续孵育4小时。
5. 向每孔加入100 µl DMSO溶液以溶解甲臜结晶。
6. 使用酶标仪测定570 nm处的吸光度。
7. 计算相对生长率：
   

12. 支架材料的包封及 BMP-2 与 NELL-1 的负载

1. 在 BSL-2 操作舱内，使用无菌刮勺将 PECs 填充至可生物降解的医用级聚己内酯-三钙磷酸盐（mPCL-TCP）支架的孔隙中。
2. 将 BMP-2 或 NELL-1 溶液（浓度为 1.5 mg/ml）加入已填充 PECs 的 mPCL-TCP 支架中，并于 4 °C 下孵育过夜。

结果

在我们的载体中，选择鱼精蛋白替代聚-L-赖氨酸，因其具有相似的化学性质，且已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为肝素的解毒剂。光学显微镜结果显示，未辐照的微珠呈球形，直径为 267 ± 14 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速为 5 ml/hr，电压为 5.8 kV）。大多数经辐照的微珠呈泪滴状。辐照微珠圆形部分的直径为 212 ± 30 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速为 4 ml/hr，电压为 6 kV）。（图 4）。

PEC微球的共聚焦图像显示了逐层包覆的CF-405标记鱼精蛋白（蓝色）、CF594标记肝素（红色）以及FITC-BMP-2/FITC-NELL-1（绿色）。结果表明，PEC可通过肝素结合域与带正电荷的BMP-2和带负电荷的NELL-1结合（图5）。这提示PEC与成骨生长因子之间的相互作用不依赖于电荷。

讨论

本方案介绍了一种通过逐层自组装法制备聚电解质复合物（PECs）的方法。利用鱼精蛋白、肝素、BMP-2 和 NELL-1 的荧光类似物，并结合共聚焦显微镜，对逐层结构进行可视化观察。摄取与释放实验表明，PEC 上的肝素可介导成骨生长因子的摄取与释放。该 PEC 方法的摄取效率为：NELL-1：86.7 ± 2.7%，BMP-2：70.5 ± 3.1%。与纯表面吸附载体（如磷酸钙磷灰石颗粒，释放率为 40–80%）相比，PEC 载体对 NELL-1 的释放具有更优的调控能力（释放率为 20%）¹¹。

除了调节释放外，肝素还可中和多聚阳离子（如鱼精蛋白）过量的正电荷，以避免与细胞毒性相关的不良问题¹²。通过MTT法和Alamar Blue法检测，PEC未表现出任何细胞毒性迹象⁷。碱性磷酸酶（ALP）检测显示，PEC载体能够维持NELL-1和BMP-2两者的生物活性。尽管PEC最初是为脊柱融合手术中成骨生长因子BMP-2的治疗而开发，但它也可负载其他具有肝素结合结构域的生长因子，如NELL-1和PDGF-BB。与其他递送方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生命科学 Acrodisc 25 mm Syring 滤光片，带 0.2 &微;m Supor 膜	PALL	PN4612	无菌鱼精蛋白、肝素超滤
24 孔板	Cell Star	662160
96 孔板 核克隆 Delta 表面	Thermo Fisher Scientific	167008
（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物），MTT	Sigma Aldrich	M5655	测量 PEC-NELL-1 的细胞毒性
酮	Fisher Scientific	A/0600/17	沉淀物 CF-405 标记的鱼精蛋白
Alamar Blue	Invitrogen，Life Technologies	DAL 1025	测量 PEC-BMP-2
碱性磷酸酶测定 （ALP） 测定试剂盒	Anaspec	AS-72146
氯化铵	Merck	Art 1145	FITC 标记中的终止试剂
无水二甲基亚砜 （DMSO）	Invitrogen，Life Technologies	D12345	异硫氰酸酯荧光溶剂 I
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma Aldrich		溶解  福尔马赞
高压灭菌	器 平山	胡-110	用蒸汽对海藻酸盐珠子进行消毒
β-甘油磷酸盐	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 （注入骨移植物大 II 套件）	Medtronic Sofarmor Danek， Memphis TN， USA	7510800	成骨生长因子，需要透析以去除干扰 FITC 偶联的稳定剂成分
羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛 （CBQCA）	Thermo Fisher Scientific	A-6222	定量 NELL-1 蛋白
细胞过滤器 （100 &微;m）	BD Science	352360	用于 ALP 测定的 Hold PEC
细胞刮刀 290 mm 刀片宽 20 mm	SPL Life Science	90030	从 24 孔板中分离细胞
CF 405S、琥珀酰亚胺酯	Sigma Aldrich	SCJ4600013	用于鱼精蛋白标记的蓝色荧光染料
CF 594、酰肼	Sigma Aldrich	SCJ4600031	用于肝素标记的深红色荧光染料
离心	Beckman Coulter	微量离心机 22R
共聚焦显微镜	奥林巴斯	FV1000
地塞米松	Sigma Aldrich	D4902	成骨生长培养基的成分
右旋糖醇脱盐柱	Pierce （Thermo Scientific）	43230
DMEM	Gibco	12320
BMP-2 Quantikine ELISA 试剂盒	R&D 系统	DBP200	测定 BMP-2 释放
胎牛血清 FBS	Hyclone	SV30160.03
异硫氰酸氟素，异构体 I	Sigma Aldrich	F7250	用于 NELL-1 和 BMP-2 标记的绿色荧光染料
ThinCert 细胞培养小室， 用于 24 孔板，无菌	Greiner	662630	防止更换成骨介质时 PEC 冲洗
Havard Appartus 注射泵 （11 plus）	Havard Apparatus	70-2208
正己烷 （>99%）	Sigma Aldrich	139386
肝素	Sigma Aldrich	H3149	与具有肝素结合域的成骨 生长因子结合
盐酸 （37%）	Merck	100317	高腐蚀性
培养箱	粘合剂	C8150
MicroBCA 蛋白质检测试剂盒	Thermoscientific	23235
酶标仪	Tecan	Infinite M200	用于 ALP 和 microBCA 检测
Nisco 细胞封装仪	Nisco Engineering Inc	封装装置 VAR V1
荧光显微镜	奥林巴斯	IX71
mPCL-TCP 支架（孔径为 1.3 mm）	骨孔	PCL-TCP 0/90	保持 PEC 用于 体内研究
青霉素-链霉素 10,000 单位/毫升，100 ml	Hyclone 细胞培养	SV30010	抗生素
10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Vivantis	PB0344-1L	10x 溶液，超纯级
聚-L-赖氨酸 MW 15,000-30,000	Sigma Aldrich	P2568	聚阳离子
蛋白硫酸盐，来自鲑鱼	Sigma Aldrich	P4020	聚阳
离子摇床	Labnet	S2025
蛇皮透析管 3,500 MWCO 22 毫米 x 35 英尺	Thermo Fisher Scientific	68035	通过透析去除未反应的 FITC
氯化钠	Merck	1.06404.1000
氢氧化钠	Qrec	S5158
碳酸氢钠	US Biological	S4000	缓冲液
碳酸钠	Sigma Aldrich	S7795-500G	缓冲液
氯化锶六水合	物 Sigma Aldrich	255521	用于藻酸盐
刮刀	3dia
5 ml 注射器	Terumo	140425R	注射器的直径影响流速
75 cm2细胞培养瓶 斜颈	Corning	730720
甲苯胺蓝	Sigma Aldrich	52040	肝素测定
胰蛋白酶 1x	Hyclone 细胞培养	物 SH30042.01
海藻酸钠	Novamatrix（FMC 生物聚合物，普林斯顿，新泽西州）	Pronova UPMVG	微珠的核心材料