大鼠二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型

摘要

我们介绍一种在大鼠中建立肝纤维化动物模型的方法，并通过肝脏组织学检查评估纤维化程度。该模型可用于研究肝脏疾病的发展过程，以及检测潜在抗纤维化药物的疗效。

摘要

采用4至6周龄的雄性Wistar大鼠建立肝纤维化动物模型。该过程需要每周连续3天腹腔注射10 mg/kg的二甲基亚硝胺（DMN），持续给药4周。由于DMN是一种已知的肝毒素和致癌物，腹腔注射操作需在通风橱中进行。该模型具有多个优点：首先，可对肝脏病变进行连续观察或在特定感兴趣阶段进行研究；其次，可通过检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平来监测肝病进展程度；第三，可在预定时间点处死动物，通过Masson三色染色肝组织的组织学检查，确认不同阶段肝损伤的严重程度。经过4周DMN给药后，典型的Ishak纤维化评分为5至6分。该模型可稳定重复，已被广泛用于评估潜在抗纤维化药物的疗效。

引言

DMN 是一种强效的肝脏特异性毒素。Magee¹ 报道了该物质在大鼠体内的代谢、组织分布及其对肝脏造成损伤的能力，Pritchard 和 Butler² 描述了其导致肝细胞损伤及通过凋亡途径引发细胞死亡的机制。已有报道称，间歇性给予该化合物可在狗和大鼠中诱导肝纤维化^3,4。

该模型已被广泛用于研究肝纤维化的机制及形态学变化。早期在大鼠中进行的研究显示，经3周DMN处理后，出现中央静脉周围出血性坏死，随后发展为无脂肪变性的小结节性肝硬化⁵。研究表明，在早期纤维化阶段，形成的胶原蛋白交联程度较高，其中III型胶原较I型更为显著⁶。与其他病因类似，DMN诱导的纤维化改变伴随着库普弗细胞（Kupffer cells）数量的增加；这些细胞是定位于肝窦内的肝巨噬细胞。这些细胞可转化为肌成纤维细胞，并产生过量的细胞外基质，后者是纤维化的主要问题所在⁷。

在细胞信号传导方面，Nakamura et al. 证明了转化生长因子-β（TGF-β）在肝纤维化进展中起关键作用⁸。他们使用表达截短型II型TGF-β受体的腺病毒，特异性抑制TGF-β信号通路。与对照组相比，在给予二甲基亚硝胺（DMN）处理期间，这些大鼠的肝纤维化进程显著被阻断。其他研究也证实，抑制TGF-β可减轻....

方案

所有动物实验均已获得淡马锡理工学院应用科学学院动物护理与使用委员会的批准。

1. DMN 的制备

1. 用移液器吸取200 µl DMN（1 g/ml 储存液），加入19.8 ml PBS，配制用于注射的10 mg/ml DMN溶液。
   注意：DMN具有致癌性。配制DMN溶液及进行动物注射时应在通风橱中操作。

2. 腹腔注射 DMN

1. 使用体重为150 - 200 g的雄性Wistar大鼠。实验开始前将大鼠适应性饲养4 - 7天。
2. 将大鼠饲养在22 ± 1 °C的室温环境中，维持12小时光照与12小时黑暗的循环周期。自由摄取饲料和饮水ad libitum。
3. 每日记录食物和水的摄入量，每周测量一次体重。
4. 根据每只大鼠10 mg/kg体重的剂量计算所需DMN的用量。使用1 ml注射器配25号针头，吸取计算体积的DMN溶液。
5. 固定大鼠以进行腹腔注射²¹。
6. 在正确固定大鼠后，将针头插入腹部右下象限，回抽注射器活塞（不应抽吸出任何物质），以确认针头位于腹腔内，随后缓慢注入DMN溶液。
7. 完成DMN给药后，缓慢拔出针头，并将其丢弃至锐器盒中。
8. 每周连续3天进行DMN腹腔注射，共持续4周。每天在相同时间点给药，并根据每周注射开始时的体重....

结果

经DMN处理的大鼠出现体重下降、活力减退及毛发竖立凌乱。DMN处理组大鼠的平均体重显著降低，该差异在DMN处理2周后首次显现，并持续至处理后的第3周和第4周（图1a）。随着大鼠连续数周接受DMN处理，肝脏受损并逐渐缩小。肝脏指数（即最终肝重占体重的百分比）在DMN处理组大鼠中显著降低（图1b）。

图 1：a）经DMN处理的大鼠体重。数据以均值±标准差表示（n = 6 - 8）。*P < 0.05，与正常对照组比较。 b）肝脏指数；DMN处理4周后，DMN处理组大鼠肝脏重量占最终体重的百分比。数据以均值±.......

讨论

我们已描述了一种建立肝纤维化动物模型并评估其严重程度的方法。准确给予二甲基亚硝胺（DMN）的剂量，并严格遵守每周腹腔注射的时间表至关重要。随着实验的进行，必须每周称量大鼠体重，并在每次DMN注射开始前重新计算给药剂量。需要注意的是，DMN具有毒性，必须在通风橱中操作。我们的腹腔注射操作也在通风橱内进行。由于需要多次注射，正确的固定方法和注射技术对于避免污染和内脏损伤尤为重要。腹腔注射导致的动物死亡情况极为罕见。

在整个实验期间，应每天对大鼠进行两次监测。在DMN注射的最后一周，应更加频繁且密切地观察动物是否出现濒死症状。此阶段肝损伤最为严重，受影响的大鼠会出现食欲减退、体重下降和身体状况恶化。此期间有25%至40%的大鼠可能病情严重，若无兽医干预可能发生死亡。因此，密切监测可使研究人员及时评估动物状况，并适时终止实验，以便从安乐死的大鼠体内新鲜采集器官，避免因意外死亡导致组织腐败而无法获取样本。

我们发现，每周检测ALT和AST水平可作为肝损伤进展的有用指标。我们还观察到，AST的特异性低于ALT，这归因于AST除了从受损的肝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基亚硝胺	Wako	147-03781
福尔马林	国药化学试剂	F63257009
乙醇	Sigma	64-17-5
二甲苯	Fisher	1330-20-7
马松三色染色试剂
苯胺蓝	电子显微镜科学公司	#42755
酸性品红	电子显微镜科学公司	RT42685
猩红红	电子显微镜科学公司	#26905
水合磷钨酸	ALFA AESAR	ALFA40116.4
水合磷钼酸	Sigma SG	221856-25G
威格特铁苏木精	默克	1.15973.0002
DPX 封片介质	默克	HX066873
组织处理机	Leica	Leica TP 1020
包埋机	Sakura	Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
切片机	Leica	Leica RM 2235
兽用检测分析仪	Idexx	Vet Test 8008