研究细菌病原体与其宿主之间的相互作用是生物学研究的重要领域。本文介绍了利用BlaM底物在siRNA基因沉默过程中检测贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）效应蛋白转位所需的关键技术。
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本文内容
摘要
摘要
Coxiella burnetii 是 Q 热的致病原，是一种依赖 IV 型 Dot/Icm 分泌系统建立复制生态位的胞内病原体。大量效应蛋白通过该系统被转运至宿主细胞内，以操控宿主的生物学过程，并形成一种独特的、来源于溶酶体的复制性液泡。本文所介绍的方法结合了两种成熟的技术：利用 siRNA 进行特异性基因沉默，以及利用基于 β-内酰胺酶活性的 FRET 底物来检测效应蛋白的转位。通过整合这两种方法，我们可以初步理解宿主因子在细菌分泌系统功能及效应蛋白转位过程中的作用。在本研究中，我们探讨了 Rab5A 和 Rab7A 的作用，这两种蛋白均为内吞运输通路的重要调控因子。我们证明，沉默任一蛋白的表达均会导致效应蛋白转位效率下降。这些方法可轻松改造，用于研究其他同样利用分泌系统的胞内和胞外病原体。由此，有望揭示参与细菌效应蛋白转位的宿主因子的全局图景。
引言
Coxiella burnetii 是一种独特的人畜共患胞内病原体，可引起人类感染——Q热。该疾病临床表现多样，从无症状的血清学转化到危及生命的慢性感染均有发生，后者常在暴露数年后表现为心内膜炎1。人类感染主要通过吸入被污染的气溶胶而发生，反刍动物是主要的感染宿主，尤其是奶牛、绵羊和山羊。尽管这些动物中的Coxiella感染通常为亚临床状态，但感染可导致流产，且分娩液和胎盘中含有大量细菌，可能污染局部环境1。此类污染对公共卫生和农业产业造成巨大负担的一个实例，是最近在荷兰发生的Q热暴发事件2。在2007年至2010年期间，确诊了超过4,000例人类Q热病例，此次暴发与山羊养殖场的严重污染密切相关3。此外，由于该细菌在环境中具有高度稳定性，且仅需极低感染剂量即可导致严重的发病率和死亡率，Coxiella已被美国疾病控制与预防中心列为潜在的生物武器制剂4。
Coxiella 存在两个相：从自然来源分离的I相生物体具有极强的毒力，而II相生物体则显著减毒 体内例如，在多次之后 体外 传代 贝氏柯克斯体 九英里I相生物体，产生含有不可逆染色体缺失的II相细菌，导致脂多糖（LPS）截短5。该菌株， C. burnetii
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方案
注意：所有涉及 Coxiella burnetii RSA439 NMII 培养或操作的实验步骤均须在生物安全二级实验室内的生物安全柜中进行，并遵守当地相关安全规范。下文所述的反向转染与易位实验流程示意图见图2。
1. 准备 C. burnetii 表达与CBU0077融合的培养物 β-β-内酰胺酶（pBlaM-CBU0077）（第1天）
- 制备1X ACCM-26:
- 将所列组分混合 表1. 用 6 M NaOH 将 pH 调至 4.75，并过滤除菌（不可高压灭菌）。ACCM-2 在 4°C 下保存约可稳定三周 4 °C.
- 生成 C. burnetii pBlaM-CBU0077 质粒保存液
- 感染HeLa 229细胞 C. burnetii 携带 pBlaM-CBU0077 质粒的菌株，传代培养直至大多数细胞中观察到大型空泡。
- 培养 C. burnetii 携带 pBlaM-CBU0077 质粒的菌株，置于 20 ml 含有 3 µg/ml 75 cm 中的氯霉素2 带通气盖的组织培养瓶中培养 7 天 3....
- 感染HeLa 229细胞 C. burnetii 携带 pBlaM-CBU0077 质粒的菌株，传代培养直至大多数细胞中观察到大型空泡。
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结果
本研究选用 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌株，因为已有研究表明 CBU0077 是 Coxiella Dot/Icm 分泌系统的一种被转位的效应蛋白17。感染前，使用 qPCR 对培养 7 天的 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌液中的基因组总数（基因组数/ml）进行计数。 图4 展示了 qPCR 后标准品和样本中预期得到的循环阈值（Ct）值示例。Ct 值（在扩增曲线图中以图形表示（图4B）和数值形式列出（图4C））被导出并按 4.3.3 节所述进行分析。根据所示的代表性数据，10 ml 重悬细菌培养物中含有 2.31 × 108 个基因组/ml（图4D）。为制备适当的细菌稀释液（2 ml 中含 1.88 × 108 个基因组/ml），将 1........
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讨论
分泌系统及其将效应蛋白转运至宿主细胞胞质的过程，是许多致病菌在特定复制生态位中建立感染所依赖的重要毒力组分。目前许多研究团队的关注重点在于细菌效应蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，以及这些效应蛋白对宿主细胞通路的影响。然而，关于宿主蛋白是否可能在细菌效应蛋白的成功转位过程中发挥必要作用，相关研究极为有限，甚至尚未开展。
本研究中使用了专性胞内病原体Coxiella burnetii，该病原体是人畜共患Q热的致病因子。进入宿主细胞后，含有Coxiella的液泡被动地经过经典的内吞途径，最终到达酸性的溶酶体来源的液泡，并在其中大量复制。除了利用宿主正常的运输途径外，Coxiella建立成功复制微环境的能力还依赖于一个功能性的IVB型分泌系统（T4SS）及其后续的效应蛋白转运8,17。该分泌系统在功能上类似于已被深入研究的Legionella的Dot/Icm IV型分泌系统。这一点已通过用相应的Coxiella基因互补Legionella特定的dot/ic.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家健康与医学研究委员会（NHMRC）基金（基金编号 1062383 和 1063646）资助，授予 HJN。EAL 获澳大利亚研究生奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 柠檬酸 | Sigma | C0759 | ACCM-2 培养基组分 |
| 柠檬酸钠 | Sigma | S4641 | ACCM-2 培养基组分 |
| 磷酸钾 | Sigma | 60218 | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化镁 | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化钙 | Sigma | C5080 | ACCM-2 培养基组分 |
| 硫酸亚铁 | Fisher | S93248 | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化钠 | Sigma | S9625 | ACCM-2 培养基组分 |
| L-半胱氨酸 | Sigma | C6852 | ACCM-2 培养基组分 |
| Bacto-新蛋白胨 | BD | 211681 | ACCM-2 培养基组分 |
| 酪蛋白氨基酸 | Fisher | BP1424 | ACCM-2 培养基组分 |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma | C4555 | ACCM-2 培养基组分 |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯霉素 | Sigma | C0378 | 用于细菌培养 |
| ON-TARGETplus 非靶向对照池 (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | 非靶向对照 |
| siGENOME 人 PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | 引起细胞死亡；用于检测转染效率 |
| siGENOME 人 RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME 人 RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5x siRNA 缓冲液 | Dharmacon | B-002000-UB-100 | 使用无菌无 RNase 的水将 5x siRNA 缓冲液稀释为 1x siRNA 缓冲液 |
| DharmaFECT-1 转染试剂 | Dharmacon | T-2001-01 | 用于转染 |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | 低血清培养基，用于转染 |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | 用于细胞培养和感染 |
| 热灭活胎牛血清 (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | 可使用其他等效产品 |
| DMSO | Sigma | D8418 | 用于储存贝氏柯克斯体菌株 |
| PBS | 用于细胞培养 | ||
| 0.05% 胰蛋白酶 + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | 用于细胞培养 |
| dH2O | 用于 qPCR 样品和标准品的稀释 | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | 可使用其他等效产品提取基因组 DNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | 可使用其他等效的 qPCR 预混液产品进行 qPCR 反应 |
| LiveBLAzer FRET-B/G 加载试剂盒（含 CCF2-AM） | Invitrogen | K1032 | 用于通过荧光检测易位并制备 6X 加载溶液（包含溶液 A、B、C 和 DMSO） |
| 氢氧化钠 | Merck | 106469 | 丙磺舒溶液组分 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | 71505 | 丙磺舒溶液组分 |
| 磷酸氢二钠 | Merck | 106586 | 丙磺舒溶液组分 |
| 丙磺舒 | Sigma | P8761 | 丙磺舒溶液组分 |
| DRAQ5 荧光探针溶液 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | 细胞核染色剂，用于检测细胞活力。使用时以 PBS 按 1:4000 稀释。 |
| 含 4% PFA（多聚甲醛）的 PBS 溶液 | Sigma | P6148 | 用于 HeLa 229 细胞的固定 |
| 25 cm2 带透气盖的组织培养瓶 | Corning | 430639 | 用于细菌菌株的培养 |
| 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯 TC 处理微孔板，单独包装，带盖，无菌 | Corning | 3603 | |
| 75 cm2 带透气盖的组织培养瓶 | Corning | 430641 | 用于 HeLa 229 细胞的培养 |
| 175 cm2 带透气盖的组织培养瓶 | Corning | 431080 | 用于 HeLa 229 细胞的培养 |
| 血细胞计数板 | 用于 HeLa 229 细胞的定量 | ||
| Tear-A-Way 96 孔 PCR 板 | 4titude | 4ti-0750/TA | 用于 qPCR 反应 |
| 8 孔平盖链 | Sarstedt | 65.989.002 | 用于 qPCR 反应 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 台式微量离心机 | |||
| 台式涡旋振荡器 | |||
| 旋转混合器 | |||
| 离心机 | Eppendorf | 5810 R | 用于收集细菌培养物 |
| Nanodrop | 用于基因组 DNA 定量 | ||
| Mx3005P qPCR 仪 | Aligent Technologies | 401456 | 用于定量 7 天培养物中的贝氏柯克斯体基因组 |
| ClarioSTAR 微孔板读数仪 | BMG LabTech | 用于荧光检测 |
参考文献
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al.
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重印与许可
